XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Зачастую возникновение и развитие заболеваний связано с первичным ослаблением и снижением устойчивости сеянцев и саженцев вследствие длительного неблагоприятного воздействия метеорологических факторов (засуха, заморозки и др.) или нарушения агротехники выращивания. Также немаловажным является и использование зараженных семян или почвенных субстратов. Мероприятия по защите сеянцев и саженцев древесных пород от болезней представляют собой использование целого комплекса агротехнических, биологических, химических, физикомеханических и других методов. Для более достоверной диагностики заболеваний выполняют микроскопирование пораженных тканей с целью обнаружения патогенного микроорганизма и его идентификации по структуре мицелия и плодовых тел, особенностям спороношения. Микроскопический метод является наиболее распространенным в практике специализированных лабораторий лесозащитных организаций. Недостатками исследования фитопатогенов путем пересева инфекционного начала в чистую культуру являются длительность исследований, их трудоемкость и отсутствие специфических сред для каждого конкретного вида возбудителя болезни. На текущий момент наиболее современными и перспективными способами диагностики и видовой идентификации болезнетворных микроорганизмов являются методы, основанные на применении технологий молекулярной генетики. Общие принципы диагностики возбудителей инфекционных заболеваний сводятся к выявлению генетического материала патогена в тканях хозяина или образцах почвы, воды, воздуха, соскобах, пыли и др. с помощью специфических реактивов и оборудования.

Проводится фитопатологическое обследование лесных питомников на основании использования методов ДНК-маркирования и внедрение технологии ранней диагностики и идентификации болезней древесных растений в лесохозяйственную практику. Процедура молекулярно-фитопатологической диагностики состоит из следующих стадий (рис.1): выделение суммарной ДНК из инфицированных растений, амплификация локусов грибной ДНК методом ПЦР, расшифровка структуры амплифицированных локусов (секвенирование), сравнительный анализ в базе данных (идентификация). Выделение суммарной ДНК из растительного материала, растительных остатков выполняется CTAB-методом, почвы – PEG-методом. Для установления видовой принадлежности изолятов проводится амплификация и секвенирование региона рДНК, включающего следующую последовательность локусов: 18S рРНК – ВТС1 – 5,8S рРНК – ВТС2 – 28S рРНК. ПЦР- анализ выполняется на основании использования DreamTaq™ Green PCR Master Mix (Fermentas, Литва) при следующих параметрах реакции: начальная денатурация – 5 мин при 95ºC, последующие 35 циклов – 20 сек. при 95ºC, 25 секунд при 67ºC и 45 секунд при 72ºC, финальная элонгация – 8 мин при 72ºC.

Рис. 1 Схема проведения молекулярно-генетической диагностики патогенов в лесном посадочном материале.

Для амплификации используютя праймеры ITS1 и ITS4. Предварительный анализ продуктов амплификации выполняетя с помощью электрофоретического фракционирования в 2,5% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием, а также дополнительным рестрикционным анализом . Альтернативные по размеру и рестрикционным спектрам (MspI, AluI, TaqI, RsaI, HhaI) ампликоны отбираются для последующего секвенирования. Секвенирующая реакция выполняется на основании использования набора BigDye Terminator Sequence Kit v.1.1 (Applied Biosystems, США) согласно протоколу компании-изготовителя. Электрофоретическое фракционирование проводится с помощью генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США), интерпретация результатов – программного обеспечения Sequence Analysis 5.1.1 (Applied Biosystems, США). Для установления (подтверждения) видовой принадлежности образцов, нуклеотидная структура секвенированных ампликонов анализируется с помощью программы BLAST в GenBank NCBI. В ходе проводимой молекулярно-генетической диагностики посадочного материала в инфицированных растениях выявляется наличие генетического материала патогенов. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов, образцов инфицированных растений хвойных пород на фореграммах представлены окрашенными зонами – выявляемый генетический материал патогенных микромицетов, в то же время здоровые растения характеризуются отсутствием ДНК возбудителей заболеваний (рис. 2). При использовании технологии ПЦР в реальном времени у зараженных растений в ходе прохождения программы амплификации наблюдается накопление ПЦР- продукта (наличие S-образной кинетической кривой), у здоровых образцов график амплификации являлся горизонтальным, а уровень сигнала находился в пределах уровня детекции фоновых значений (рисунок 2). ДНК-спектры посадочного материала лиственных пород (дуба, клена, липы, березы), кроме генетического материала патогена в случае инфицированных растений, содержат и ампликоны растения-хозяина, что связано с гомологией регио нов генов 18S и 28S рРНК грибов и покрытосеменных растений (рис. 3). Здоровые сеянцы и саженцы характеризуются наличием только одной окрашенной зоны, специфичной для исследуемой породы. Диагностическая особенность лиственных пород используется в качестве дополнительного внутреннего контроля протекания ПЦР-реакции. Отсутствие фракции растения- хозяина в ПЦР-спектре указывает на нарушение технологии молекулярно-фитопатологического анализа.

Рисунок 2 - Молекулярно-фитопатологическая диагностика посадочного материала хвойных методами а) классической ПЦР и б) ПЦР в реальном времени

Рисунок 3 - Молекулярно-фитопатологическая диагностика посадочного материала лиственных пород.

Расположение фракций на электрофореграмме зависит от размера выявляемого фрагмента ДНК патогена и является величиной видоспецифичной. Данный признак используется в качестве первичного критерия при проведении идентификации возбудителя заболевания. Для образцов инфицированных растительных тканей получены многофракционные ПЦР- спектры, что свидетельствует о содержании генетического материала более чем одного вида патогенов. Несмотря на многофракционный тип выявляемых спектров, наибольшей интенсивностью характеризуется какой-либо один или несколько доминирующих альтернативных вариантов ампликонов, что указывает на большое количественное содержание соответствующего ему вида гриба в исследуемом образце.

Выводы. Методы ДНК-анализа позволяют выявлять и идентифицировать фитопатогены как в посадочном материале, так и объектах окружающей среды (почва, растительные остатки и др.). Кроме того, существенными моментами ДНК-диагностики, в отличие от визуальной фитопатологической оценки, являются точная постановка диагноза, а также возможность выявления болезней на самых ранних стадиях ее развития.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Баранов О. Ю. и др. Молекулярно-генетическая диагностика грибных болезней в лесных питомниках // Лесн. и охот. хоз-во. 2012. № 6. С. 21–29.

Баранов О. Ю., Ярмолович В. А., Пантелеев С. В. Молекулярно-генетические особенности пораженных шютте тканей хвои сеянцев ели европейской // Современное состояние и перспективы охраны и защи- ты лесов в системе устойчивого развития: мат-лы Междунар. науч. конф. Институт леса НАН Беларуси. 2013. С. 63–66.

Дьяков Ю. Т. Общая и молекулярная фитопатология. М.: Об-во фитопатологов, 2001. 301 с.

Падутов В. Е., Баранов О. Ю., Воропаев Е. В. Методы молекулярно-генетического анализа. Минск: Юнипол, 2007. 176 с.

СИБИРСКИЙ ЛЕСНОЙ ЖУРНАЛ. 2018. № 2. С. 15–27 http://xn80abmehbaibgnewcmzjeef0c.xnp1ai/upload/iblock/d77/d77743321cbf18b530d3ff85f6060a80.pdf