XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Актуальность: метод фильтрации трофобластов, представляется акутальным методом в современной пренатальной диагностике хромосомных заболеваний, так как за счет данного метода не требуется прибегать к инвазивной диагностике.

Цель: изучить и оценить приемущества данного метода диагностики над другими методами.

Введение

Трофобласт- (от греч. trophe питание и blastos росток) наружный слой клеток у зародышей млекопитающих на стадии бластоцисты. Обеспечивает контакт зародыша с материнским организмом. Участвует в имплантации зародыша в стенку матки и образовании плаценты.

Особенностью данного метода является неинвазивность. Метод основан на фильтрации периферической крови беременных женщин. Трофобласты- это клетки эпителия, следовательно их отличает крупный размер и особая структура. На основании данных свойств можно применить метод фильтрации, в основе которого будет лежать задержка крупных клеток на фильтре с порами определенного диаметра, тогда как большинство клеток периферической крови будут проходить через него.

Материалы и методы.

В исследовании использовались 16 образцов искусственных смесей, полученных из клеток хориона с известным кариотипом и венозной крови взрослого человека. В кровь взрослых людей добавляли гепарин, чтобы предотвратить свертывание. В качестве источника клеток хориона использовали абортный материал. Ворсины хориона препарировали с очищением от фрагментов материнских тканей. Для приготовления суспензии клетки хориона помещали в раствор трипсин-ЭДТА и инкубировали, сначала всю ночь при температуре 4^оС, затем при температуре приближенной к температуре тела человека, около 37^оC 30 минут. К венозной крови взрослого человека из образца добавляли по 0,5мл суспензии хориона. Разводили данную смесь фильтрационным буфером в соотношении 1:10 и настаивали 10 минут при комнатной температуре. Трофобласты выделяли с помощью вакуумного фильтра. Нужные клетки выделяли методом окрашивания. Изучаемые образцы собирали в пробирки и отправляли на полногеномное исследование.

Результаты исследований.

Методика фильтрации трофобластов из образцов периферической крови является наиболее современным и рациональным, в сравнении с методом градиентного центрифугирования. Метод градиентного уступает методу фильтрации своей сложностью, многоэтапностью и большими клеточными потерями. Первым результатом работы стало получение образцов цитологических препаратов трофобластов как с нормальным, так и с аномальным кариотипом[3]. На этапе фильтрации наиболее важным является выбор диаметра пор. Суть подбора оптимального размера фильтра заключается в том, чтобы он не только задерживал клетки трофобластов, но и пропускал преимущественное большинство клеток крови. Средний размер клеток крови приближен к 10 мкм, а трофобластов 18 мкм[9]. После многих тестирований и исследований было установлено, что фильтр с диаметром пор 8 мкм является наиболее рациональным, потому что задерживает менее 0,1 % клеток периферической крови[6]. После цитохимического окрашивания, распознавание трофобластов происходило с помощью микроскопического исследования. Клетки трофобластов определялись по характерному окрашиванию цитоплазмы.

Следующая стадия изоляции единичных СК-7 положительных клеток методом лазерной микродиссекции. Данный метод позволяет избежать повреждений при выборке нужных клеток. Для дальнейших исследований единичных клеток с помощью лазерной микродиссекции были выбраны препараты с аномальным кариотипом. Это были образцы плода женского пола с трисомией по хромосоме 13 и плод мужского пола с трисомией по 16 хромосоме. По результатам проведенной работы было сделано заключение о том, что средняя концентрация ДНК в клетках образцов составила 1105 нг\мкл.

Итак, полногеномная амплификация позволила добиться многократного увеличения количества ДНК, достаточного для проведения анализа.

Сложности данной неинвазивной диагностики заключаются в том, что содержание плодных клеток в крови матери крайне низкое. В 1 мл крови содержится около 1-8 плодных клеток, большинство из которых по природе трофобласты. Клетки трофобластов можно обнаружить в периферической крови матери с 5-й недели беременности. После родов данные клетки в крови матери не сохраняются[7]. Вследствие этого, актуально развития изоляции единичных клеток из образца.

Изоляция клеток, основанная на их крупном размере - современный метод, позволяющий изучить строение трофобластов, выявить аномалии. Полученные клетки могут быть изолированы методом микродиссекции, проведение полногеномной амплификации позволит выявить аномалии последовательности генетического материала.

Изначально метод ISET был применен для выявления раковых клеток, из крови пациентов. По результатам исследований была доказана эффективность этого метода в сравнении методикой магнитно-активированной сортировке клеток. Метод фильтрации не имеет многих недостатков, которые имеют методы более инвазивной диагностики.

Результаты экспериментов могут быть использованы для дальнейших совершенствований методики, и нахождения более совершенных способов выделения плодных клеток, а также новых условий амплификации, для более малого количества генетического материала не только в рамках эксперимента, но и для применения на реальных пациентах.

Список литературы.

1.Миньженкова М.Е., Шилова Н.В., Макарова Ж.Г., Козлова Ю.О., Золотухина Т.В. Эффективность различных методов диагностики хромосомных аномалий при репродуктивных потерях // Медицинская генетика. – 2014. – Т. 13, №2. – С.25-30.

2.Мусатова Е.В., Маркова Ж.Г., Витязева И.И., Шилова Н.В. Оценка возможности выделения клеток трофобласта из периферической крови и их анализа в условиях модельного эксперимента // Современные проблемы науки и образования – 2015.

3. Emad A., Drouin R. Evaluation of the impact of density gra- dient centrifugation on fetal cell loss during enrichment from mater- nal peripheral blood // Prenat Diagn. — 2014. — Vol. 34, ¹ 9. — Ð. 878—885.

4. Hatt L., Brinch M., Singh R., Mîller K., Lauridsen R.H., Ul- dbjerg N., Huppertz B., Christensen B., Kîlvraa S. Characterization of fetal cells from the maternal circulation by microarray gene exp- ression analysis — could the extravillous trophoblasts be a target for future cell-based non-invasive prenatal diagnosis? // Fetal. Diagn. Ther. — 2014. — Vol. 35, ¹ 3. — Ð. 218—227.

5. Kîlvraa S., Christensen B., Lykke-Hansen L., Philip J. The fetal erythroblast is not the optimal target for non-invasive prenatal diagnosis: preliminary results // J. Histochem. Cytochem. — 2005.— Vol. 53(3). — Ð. 331—336.

6. Ma Y.C., Wang L., Yu F.L. Recent advances and prospects in the isolation by size of epithelial tumor cells (ISET) methodology // Technol. Cancer Res. Treat. — 2013. — Vol. 12, ¹ 4. — Ð. 295—309.

7. Mouawia H. Genotyping analysis of circulating fetal cells re- veals high frequency of vanishing twin following transfer of multiple embryos // Avicenna J. Med. Biotechnol. — 2013. — Vol. 5, ¹ 2. — Ð. 125—132.

8. Vona G., Sabile A., Louha M., Sitruk V., Romana S., Schut- ze K., Capron F., Franco D., Pazzagli M., Vekemans M., Lacour B., Brechot C., Paterlini-Brechot P. Isolation by size of epithelial tu- mor cells: a new method for the immunomorphological and molecu- lar characterization of circulating tumor cells // Am. J. Pathol. — 2000. — Vol. 156, ¹ 1. — Ð. 57—63.

9. Vona G., Beroud C., Benachi A., Quenette A., Bonnefont JP., Romana S., Munnich A., Vekemans M., Dumez Y., Lacour B., Paterlini-Brechot P. Enrichment, immunomorphological, and gene- tic characterization of fetal cells in maternal blood // Am. J. Pathol.— 2002. — Vol. 160, ¹ 1. — Ð. 51—58.

Код для цитирования: Скопировать