XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Генетически чужеродные вещества, попадающие в организм человека, способны вызывать специфические иммунологические реакции, направленные на их удаление из организма. В данных реакциях помимо чужеродных агентов – антигенов – принимают участие специфические белки крови – антитела, за синтез которых ответственна иммунная система. Наличие или отсутствие в крови человека антител является диагностическим признаком, позволяющим с точностью определить, болен ли человек тем или иным инфекционным заболеванием.

С целью диагностики различных заболеваний в лабораторной практике применяют иммуноферментный анализ – метод, в основе которого лежит специфическая реакция образования иммунного комплекса «антиген-антитело», при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом-меткой, который реагирует с соответствующим хромогенным субстратом. В результате этой реакции синтезируется окрашенный продукт, количество которого можно определить с помощью спектрофотометрических, флуориметрических, электрохимических и других методов. ИФА является методом количественного и качественного определения веществ в биологических образцах. Для этих целей существуют специальные наборы – диагностикумы, содержание все необходимые компоненты для проведения реакции.

Для определения антител в прямых иммунологических реакциях (либо антигенов в непрямых реакциях) существуют антигенные диагностикумы - препараты на основе бактерий, вирусов, токсинов и пр. Необходимым компонентом таких диагностических систем являются антигены тех или иных возбудителей. Это ставит необходимость их выделения из соответствующего возбудителя, а также обязательность их очистки.

Так, например, антигены возбудителя мелиоидоза получают в виде водно-солевых экстрактов путем добавления 60 мл 0,15 М раствора NaCl с фосфатным буфером (рН 7,2) и 0,05% азида натрия. Затем взвесь помещают на магнитную мешалку и перемешивают в течение суток при 4°С с последующей гомогенизацией и экстракцией антигенов с помощью дезинтегратора. Полученный материал центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 минут с охлаждением. Супернатант отделяют, концентрируют и диализуют, а затем спектрофотометрически определяют содержание белка. Полученные таким образом пробы можно хранить при -10°С.

Одним из методов выделения и очистки антигенов вируса-возбудителя бешенства является выделение их из 20% суспензии мозга крыс в 0,01 М фосфатно-буферном растворе. Мозговую ткань дезинтегрируют, осаждают низкоскоростным центрифугированием, а затем супернатант ультрацентрифугируют при 25000 g. Очистку проводят в ступенчатом градиенте сахарозы 15-50% с использованием ультрацентрифуги. Конечным этапом является определение концентрации на спектрофотометре.

Для выделения и очистки антигенов сибиреязвенного токсина, в частности, протективного антигена (ПА) и отечного фактора (ОФ), используют методику, схожую с описанной выше. Культуральный фильтрат концентрируют и сорбируют на гидроксилаппатите, после чего белки элюируют в нелинейном градиенте К-Иа-фосфатного буферного раствора с концентрацией фосфата от 0,005 до 0,3 М. При этом ПА элюируется со свободным объемом колонки, а ОФ – при концентрации фосфата 0,25 М.

Таким образом, антигены являются необходимым компонентом иммунодиагностических тест-систем. Их использование в ИФА сопряжено с необходимостью выделения и очистки, что в некоторых случаях может быть затруднено по разнообразным причинам. Но в большинстве случаев знание антигенного строения бактерий, вирусов и пр. и, соответственно, использование их антигенов в диагностикумах, позволяет с высокой точностью поставить диагноз в короткие сроки.