XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Для понимания различных процессов на разных уровнях организации, биологических функций и структур используют модельные объекты. Существует несколько видов моделей: химические, биологические, физико-химические. Вирусология - наука, изучающая природу вирусов, особенности химического состава, морфологии, механизмов размножения и генетики. Одним из основных модельных объектов в вирусологии является куриный эмбрион. Куриные эмбрионы вошли в вирусологическую практику в 30-х годах ХХ века.

Куриный эмбрион представляет собой зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития. Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снаружи твёрдой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка. Подскорлупная оболочка разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш окружён околоплодной жидкостью, заполняющей амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток располагается немного в сторону от центра и относительно зародыша по другую сторону продольной оси. Под подскорлупной оболочкой находится аллантоидная полость, покрывающая амнион и желточный мешок. В процессе развития аллантоидная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка(см. рисунок 1).

Рис 1. Строение куриного эмбриона.

В лабораторных условиях эмбрионы содержат в термостате при температуре 37^oC и влажности 60-70%. Качество яйца оценивается несколькими признаками: его размером, состоянием скорлупы, правильностью формы. При предынкубационном отборе отбраковываются крупные (свыше 65-70 г) и мелкие (45-47 г) яйца. Слишком крупные разбиваются во время инкубации, из мелких выводятся цыплята с пониженной жизнеспособностью и малой массы. К инкубации яйца с загрязненной скорлупой не допускаются. Скорлупная оболочка должна быть гладкой, матового тона, что свидетельствует о свежести яйца и целостности скорлупы. Яйца с тёмными пятнами не допускаются к исследованию, так как их наличие указывает на развитие микроорганизмов. Используются куриные эмбрионы от 5-го до 12-го дня инкубации. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в штативах, вентиляционные отверстия должны быть открыты.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению состоит из нескольких этапов: подготовку рабочего места, дезинфекцию скорлупы, овоскопирование.

Овоскопирование - просмотр яиц против яркого источника света, на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур. На скорлупной оболочке карандашом отмечают 3 участка: границу воздушной камеры, бессосудистую зоны размером 0,5 х 0,5 см и место расположения зародыша. В дальнейшем отметки используют в качестве ориентира при выборе места введения вируссодержащего материала. Также на этом этапе определяют погиб или жив зародыш посредством его активных движений. Заражение проводят в асептических условиях. В предбокснике скорлупную оболочку обеззараживают йодированным спиртом, затем в боксе повторно протирают, и иногда обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампоном.

Существуют несколько методов заражения эмбрионов. Выбор метода определяется видом вируса, целью заражения. При заражении вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала.

Заражение в аллантоидную полость. При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы ринопневмании лошадей, гриппа, везикулярного стоматита и др. Куриный эмбрион располагают вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу с вирус содержащим материалом вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. (см. рисунок 2) После инъекции её извлекают, а отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным стерильным парафином.

Рис 2. Заражение в аллантоидную полость.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод используется при культивировании чумы плотоядных, катаральной лихорадки овец и др. Эмбрион фиксируют в штатив вертикально тупым концом вверх, и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают отверстие диаметром 15-20мм(см. рисунок3). Пинцетом снимают подскорлупную оболочку, на обнажившийся участок ХАО вводят 0,2 мм вирус содержащей суспензии, отверстие закрывают лейкопластырем или покровным стеклом, укрепив его парафином.

Рис. 3. Заражение на хорионаллантоисную оболочку.

Заражение в желточный мешок. Этот метод используется для размножения катаральной лихорадки овец, хламидий, ринопневмонии лошадей и др. Эмбрионы закрепляют в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45 к вертикальной оси, (см. рисунок 4)

Рис 4. Заражение в желточный мешок.

В вирусологии существуют несколько признаков размножения вируса в курином эмбрионе. Одним из главных может служить гибель эмбрион в характерные для данного вируса сроки. Следующим признаком является патологоанатомические изменения, появляющиеся в различных структурах эмбриона (например, хорионаллантоисная оболочка может иметь кровоизлияния, узелки, может быть отечной). Существуют вирусы, которые, размножаясь в эмбрионах, не вызывают ни патологоанатомических изменений, ни гибели (например, вирус ньюкаслской болезни) Выявить такой вирус можно с помощью реакции гемагглютинации.

Гибель зародыша в течение первых 24 часов после инфицирования обусловлена размножением бактериальной микрофлоры, грибов или повреждением при заражении. Эмбрионы инкубируют до максимального накопления вируса. Срок инкубации является определенным и варьирует в пределах от 2 до 8 суток. Полученные образцы умерщвляют охлаждением при 4 в течение 3-4 ч и вскрывают.

Вскрывают куриные эмбрионы, с целью получения вируссодержащего материла, обнаружения признаков размножения вирусов. Все эти процессы требуют правила асептики при вскрытии. В зависимости от того, каким вирусом был заражен куриный эмбрион, вируссодержащим материалом могут быть: желточный мешок (его стенки), ткани зародыша, амниотическая жидкость и др. Перед вскрытием скорлупу эмбриона обрабатывают йодированным спиртом. Вскрытие совершают в боксе, используя стерильную посуду и инструменты. Скорлупу срезают над воздушной камерой, яйцо должны держать под определенным углом, чтобы скорлупа не упала. Инструменты не должны повреждать оболочку, лежащую под воздушной камерой. При вскрытии эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержащего материала посевом на МППБ, МПБ, МПА. Материал хранят при температуре - 26^oС и ниже.

Использование куриного эмбриона дало возможность успешнее решать задачи, стоящие перед вирусологией, в связи с тем, что имеют ряд преимуществ перед лабораторными животными:

1) относительно высокая чувствительность к широкому спектру вирусов;

2)скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от заражения со стороны внешней среды;

3) легкодоступный объект в связи с развитием инкубаториев и птицефабрик;

4) не требуют кормления и ухода.