XI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2019

Размножение вирусов происходит только в живых клетках. Поэтому в вирусологии культивирование осуществляется исключительно в живых клетках – в культурах или живых организмах, выращиваемых для подобных исследований. С 1931 года как средство для культивирования вирусов стали применяться куриные эмбрионы, в связи с доступностью и достаточной чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза и многим другим. На дынный момент куриные эмбрионы наиболее широко применяются при культивировании вирусов гриппа. Однако, их использование имеет недостатки, одним из которых является невозможность гарантировать стерильность, так как куриный эмбрион может нести в себе патогенные факторы. В середине XX века были предложены для культивирования вирусов клеточные культуры – изолированные культуры клеток многоклеточных организмов. Внедрение клеточных культур в вирусологическую практику породило новый этап в развитии вирусологии. Культуры клеток подвергаются стандартизации и чувствительны к большинству вирусных агентов.

Лабораторные животные.Использование лабораторных животных в вирусологической практике подразумевает:

Использование их для идентификации вируса в первичном материале;

Первичное выделение вируса;

Накопление биомассы вируса;

Поддержание вирусов в активном состоянии;

Титрование вируса;

Получение гипериммунных сывороток;

Как экспериментальные модели в вирусологической практике используются мыши (вирус бешенства, ящур), крысы (грипп свиней, б. Ауески), морские свинки (бешенство, ящур, чума плотоядных) и кролики (бешенство, миксомы кроликов).

К лабораторным животным, применяющимся в вирусологии как модельные объекты, предъявляются общие требования. Применяемое животные должно обладать достаточной чувствительностью к данному вирусу, возраст животного также играет роль в чувствительности к вирусу. Так, к большинству вирусов наиболее чувствительны молодые особи, в отдельных случаях используются новорожденные. Стандартная чувствительность достигается подбором лабораторных животных по возрасту и массе. Обычно в вирусологических исследованиях используются стандартизованные животные, так называемые чистые линии, полученные в результате инбридинга во многих поколениях. Наиболее важное требование, предъявляемое к используемым животным – животные должны быть здоровыми. В виварий вирусологической лаборатории должны поступать исключительно здоровые животные, которые должны содержаться на карантине и находиться под наблюдением. При наличии заболеваний животные уничтожаются.

Лабораторные животные размещаются в виварии таким образом, чтобы все системы органзма функционировали в пределах физиологической нормы, исключалась возможность взаимного заражения. Важно предотвратить распространение инфекции за пределы вивария. Для разных видов лабораторных животных применяют различные способы индивидуальной метки. Так, в случае с крупными животными и птицами используются металлические бирки с выбитым на них индивидуальным номером. Если в эксперименте применяется небольшая группа животных, или животные используются непродолжительное время, индивидуальный номер выстригается на шерсти на спине и бедрах. При использовании мелких грызунов возможна метка посредством ампутации отдельных пальцев на грудных и тазовых конечностях. Часто применяется метка нанесением цветных пятен на непигментированную шерсть.

Заражение лабораторных животных может быть осуществлено:

Подкожно – в спину;

Внутрикожно – в пятку тазовой конечности;

Внутримышечно – в бедро;

Внутривенно - в хвост, перед этим место ввода необходимо растереть горячей водой, хвост пережать;

Интранозально – через ноздри, в этом случае предварительно дается слабый эфирный наркоз с целью избежать чихание после ввода агента;

Интероцеребрально – в череп, отверстие аккуратно просверливается иглой при вводе.

Куриный эмбрион.Снаружи куриный эмбрион покрыт скорлупой – известковой оболочкой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. На тупом конце яйца скорлупа раздваивается, образуя таким образом воздушную полость. Под скорлупой распологается хорионаллантоисная оболочка, которая на тупом конце яйца примыкает к скорлупной оболочке, эта оболочка обладает обильным кровоснабжением и необходима для дыхания куриного эмбриона. Изнутри хорионаллантоисная оболочка сообщается с аллантоисной полостью, которая в свою очередь играет роль органа выделения, кроме того, выполняет защитную функцию. Она окружает эмбрион, находящийся в амниотической полости, заполненной амниотической жидкостью. Куриный эмбрион сообщается с желточным мешком через желточный канатик. Желточный мешок является источником питательных веществ.

Для осуществления культивирования с использованием куриных эмбрионов необходимо соблюдать температурный режим (36°-38°C), влажность (50-70%), обеспечить достаточную вентиляцию. Для заражения необходимы куриные эмбрионы определенного возраста, инкубированные 6-13 суток, что зависит от методики заражения и вида вируса. Необходимые материалы для осуществления метода включают в себя подставку, покровные стёкла, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы, спирт и йод, пробирку со стерильным парафином, пакетики стерильной ваты и марли. Инструменты в течение всей работы должны находиться в емкости со спиртом, после каждой выполненной манипуляции инструменты должны быть стерилизованны в пламени горелки. При работе нужно использовать стерильные перчатки и маску.

В работе используют жизнеспособные эмбрионы, для определения жизнеспособности куриные эмбрионы просвечивают в овоскопе – жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки заполнены кровью. После отбора яиц их необходимо тщательно дезифицировать. Для этого скорлупу растирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.

Культуры клеток. Клеточная культура представляет собой изолированные клетки многоклеточного организма, которые жизнеспособны и способны к делению в искусственных условиях in vitro. Иначе говоря, культура клеток — это любая система, в которой клетки способны жить и размножаться in vitro более 24 часов.

В целях создания клеточных культур могут использоваться разные ткани многоклеточных животных, в том числе человека, птиц, эмбриональные или зрелые. Часто используют и злокачественно пораженные клетки, получаемые из опухолей.

Как источник эмбриональной ткани могут использоваться эмбрионы человека, мышей, свиней, кроликов, и других животных. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются от нормальных тканей зрелого организма более активным ростом и лучшей выживаемостью. Среди зрелых тканей наибольшее распространение получили ткани печени различных животных.

Ткани берут в асептических условиях, промывают в солевом растворе Хенкса и затем подвергают измельчению. В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которые подразделяют на:

Культуры фиксированных кусочков тканей;

Однослойные культуры клеток:

первичные (неперевиваемые) культуры клеток;

перевиваемые (стабильные) культуры клеток;

культуры диплоидных клеток;

Культуры суспензированных клеток.

В практической вирусологии чаще используют однослойные культуры, клетки которых растут и размножаются, будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату (стеклу, пластику), образуя слой толщиной в одну клетку (монослой). Метод обработки однослойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами (обычно трипсином), разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клетки прикрепляются к стеклу сосуда и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визуально наблюдать возникающие изменения в динамике.

Выводы.Таким образом, в вирусологии с течением времени не теряют своей востребованности «относительно старые» методы, разработанные в начале XX века, в то же время разрабатываются новые. К таким «относительно старым» методам относится куриный эмбрион, который в силу своей экономичности и эффективности скорее всего никогда не потеряет своей востребованности в микробиологических исследованиях. Еще до куриных эмбрионов как модельные объекты использовались лабораторные животные. Недостатками культивирования вирусов в организме лабораторных животных являлись дороговизна и непрактичность исследований. В связи с этим большее распространение получили культуры клеток. Культуры клеток обладают большими возможностями для исследований, кроме того, они экономичны и стандартны.

Список использованных источников

Белоусова Р.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. - 3 изд. - М.: КолосС, 2006. - 248 с.

Корочкин Р.Б., Вербицкий А.А., Алешкевич В.Н., Сандул А.В. Культивирование вирусов в культурах клеток. - Витебск: ВГАВМ, 2010. - 43 с.

Строганова И.Я. Куриные эмбрионы и их использование в вирусологии: метод. указания к лабораторным занятиям / И.Я. Строганова; Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2013. – 19 с.

Код для цитирования: Скопировать