X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Введение

В 1961 г. Хайфлик и Мурхиад показали, что культура соматических клеток имеет ограниченный период жизни . В 1973 г. Оловников предположил, что укорочение концов хромосом (теломер) определяет возможное число делений клетки . Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотическом спаривании хромосом и в регуляции транскрипции генов прителомерной области. В клетках, способных размножаться бесконечно (бессмертных), должен существовать механизм, компенсирующий укорочение теломер. В 1985 г. Блекберн и Грейберг открыли фермент, удлиняющий теломеры, – теломеразу . Теломераза – рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из абсолютно необходимых для активности компонентов: молекулы РНК – tr и теломеразной обратной транскриптазы – tert; также в состав теломеразы может входить ряд ассоциированных с ними белков. tr является матрицей для tert при удлинении теломер с помощью теломеразы. Теломераза в клетках человека существует в видедимера и содержит две субъединицы обратной транскриптазы и две молекулы РНК . В теломеразе человека c htert связываются: p23/p90 – шаперон, отвечающий за сборку/ конформацию комплекса; 14-3-3, обеспечивающий ядерную локализацию; tP1 с неизвестной функцией. С htr связываются белки hGAr1, Dyskerin/nAP57, hnHP2, c1/c2, отвечающие за стабильность, созревание и локализацию РНК; La, hStau, вероятно, отвечающие за присоединение к теломерам; L22, участвующий в процессинге ядерной локализации; hnOP10, A1/uP1, tP1 с неизвестными функциями , tcAB1, отвечающий за локализацию htr в тельцах Кахаля и связывание с теломерами . Ферментативная активность теломеразы человека в лизате ретикулоцитов кролика детектируется при добавлении htr и htert . Заметим, что выполнение теломеразой своих функций in vivo не всегда совпадает с наличием теломеразной активности, измеренной in vitro. Например, добавление гемаглютининового эпитопа на С-конец htert при сохранении теломеразной активности препятствует удлинению теломер.

Актуальность

Понимание того, как работает теломераза, и регулирующих ее работу механизмов может быть использовано в онкодиагностике. cама теломераза и ее регуляторы могут быть важными мишенями антираковой терапии. На активность теломеразы влияют белки, имеющие множество функций в клетке, соответственно, их воздействие не обязательно специфично. Также встречаются случаи, когда регуляторы теломеразы действуют совместно либо несколько регуляторов объединены в каскад.

Целью данного обзора является обобщение и систематизация данных о регуляции теломеразы при онкогенезе.

Задачи

Выявление взаимосвязи системы регуляции теломеразы с другими онкогенами может помочь в разработке комплексной диагностики рака, позволяющей выявлять заболевание и определять тактику борьбы с ним на наименее агрессивной стадии.

Детектируемая in vitro теломеразная активность появляется в лейкоцитах в G1-фазе . С другой стороны, in vivo теломеры реплицируются во время S-фазы. В течение большей части клеточного цикла htr накапливается в тельцах Кахаля при помощи tcAB1 , в S-фазе совмещаясь с теломерами в клетках. htert также в S-фазе клеточного цикла перемещается на теломеры . Это свидетельствует о существовании регуляции на уровне пространственной локализации активной теломеразы (фермента) и теломеры (субстрата). Не всегда наблюдается корреляция активности теломеразы и длины теломер. Например, при лейкемии зависимость между длиной теломер и активностью теломеразы отсутствует. Активность теломеразы в зависимости от числа деленийхорошо описывается двухшаговой гипотезой клеточного старения и обретения бессмертия (иммортализации) – теорией М1/М2. В эмбриональных клеточных линиях теломераза активна, и длина теломер поддерживается на постоянном уровне. В стволовых клетках активность теломеразы ниже и позволяет лишь частично компенсировать укорочение теломер. В соматических клетках активность теломеразы отсутствует. Укорочение теломер приводит в момент М1 – достижение предела Хайфлика – к переходу клеток в состояние сенессенса (старения), которое может быть преодолено инактивацией (удалением) prB/p16 или p53. Клетки, преодолевшие М1, продолжают делиться и входят в состояние кризиса М2 (точка Б на рис. 2), сопровождающееся массовой клеточной смертью. Уцелевшие клетки перерождаются в раковые. Раковые клетки способны к неограниченному делению и поддержанию длины теломер (как правило, с помощью теломеразы). Если экспрессирующие htr соматические клетки трансфицировать геном htert до момента М2, в них, как и в раковых, происходит удлинение и стабилизация теломер. Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением. Показано ее наличие в репродуктивных тканях, а также в быстро обновляющихся тканях, например, в некоторых клетках крови, кишечном эпителии и базальном слое клеток кожи , при этом в соматических клетках с активной теломеразой уровень ее активности ниже, чем в раковых

Частота детекции теломеразной активности в различных опухолях. В большинстве опухолевых клеток (80–90 %) теломераза активна и является основным инструментом поддержания длины теломер. Доброкачественные опухоли и другие предраковые поражения представлены как опухолями, в которых теломеразная активность проявляется почти в 100 % случаев, так и опухолями, в которых активность теломеразы не определяется . Опухолевые клетки некоторых типов могут использовать альтернативный механизм поддержания длины теломер, основанный на рекомбинации . Хотя при трансфекции геном htert клеток с альтернативным механизмом поддержания теломер работают оба механизма, при объединении клеточных линий с разными механизмами в гибридах присутствует теломераза, а признаки альтернативного механизма удлинения теломер пропадают . Следует отметить, что сама по себе теломераза не является онкогеном. Клеточные линии, трансфицированные геном htert, долгое время не показывают признаков злокачественной трансформации . Активность теломеразы может появляться вследствие отбора клонов при критическом укорочении теломер (рис. 2, точка Б). Сначала клетки начинают усиленно делиться, при этом у них укорачиваются теломеры, затем выживают те из них, у которых активируется теломераза. В этом случае теломеразная активность может быть маркером опухолевой прогрессии и отрицательного прогноза. Так, при лимфогранулематозе основное увеличение активности теломеразы происходит при переходе от первой ко второй стадии . При другом варианте развития событий теломеразная активность появляется одновременно с другими ведущими к раку нарушениями метаболизма вследствие исходного клеточного поражения. В этом случае активность теломеразы появляется в самом начале заболевания и служит маркером начала онкологических процессов. Например, при раке шейки матки нет зависимости активности теломеразы от стадии рака – теломераза активна уже на первой стадии, а ее активация происходит во время предопухолевых заболеваний . Теломераза может быть исходно активна в исследуемом типе клеток, и эта активность лишь усиливается при переходе к раку, например, при гемобластозе. Также теломераза может быть исходно активна в случае перерождения стволовой клетки . В этом случае теломеразная активность будет обнаруживаться при начале роста опухоли, поскольку метод ее детекции не позволяет увидеть активность из одной клетки на фоне окружающей ткани, но уже небольшой пул теломеразаположительных клеток будет заметен. К сожалению, в большинстве исследований можно найти информацию лишь о наличии теломеразной активности в определенном типе рака. Механизмы активации теломеразы изучают, как правило, на клеточных линиях, и редко можно сказать, какой механизм и с какой частотой встречается в исследуемом типе рака in vivo.

Онкосупрессоры P53 И P73

Белок p53 регулирует множество генов, участвующих в контроле клеточного цикла и онкогенезе (p21, MDM-2, Bax, c-Fos/Jun, prB, 14-3-3σ, Bcl2 и ряд других) . p53 противодействует онкогенезу, включая механизмы ареста клеточного цикла и апоптоза в ответ на различные поражения клетки . Этот белок неактивен более чем в половине типов человеческих опухолей . Восстановление функционального р53 в раке шейки матки, лимфоме Беркитта, раках молочной и поджелудочной желез приводит к ингибированию теломеразной активности за счет подавления экспрессии htert . Этот эффект проявляется в течение нескольких часов после индукции p53, до того как происходит нарушение клеточного цикла и начинается апоптоз. Мутации в доменах р53, ответственных за связывание деацетилаз гистонов и корепрессора Sin3A, не влияют на угнетение htert, хотя деацетилазы участвуют в ингибировании транскрипции htert белком p53. Мутации р53 в домене связывания с ДНК, домене олигомеризации или домене активации транскрипции приводит к деактивации р53 по отношению к теломеразе. При этом p53 не связывается in vivo с промотором htert, т.е. его действие на промотор непрямое. p53 может использовать в качестве посредников белки р21, e2F и белки группы prB. Для проявления ингибирования р53 необходим Sp1. Мутации в участках связывания Sp1 ликвидируют подавление активности промотора htert с помощью р53 . Эксперименты в клетках Drosophila Schneider SL2 показали, что активация промотора htert, зависящая от эктопической экспрессии Sp1, аннулируется p53 дикого типа. p53 взаимодействует с Sp1 и предотвращает его связывание с промотором htert in vitro . р53, возможно, использует в качестве посредника белок р21 , хотя в аналогичных более ранних экспериментах обнаружено, что р21 не является посредником в действии р53 на теломеразу. Белок p73 проявляет онкосупрессорные функции, подобно р53. Изучение не вырабатывающих p53 клеток показало, что суперэкспрессия С-концевых изоформ p73 (α, β, γ, δ) приводит к уменьшению активности промотора htert. Угнетение экспрессии htert происходит при посредничестве эндогенного p73 после активации e2F1 в клетках. Мутации в участках связывания Sp1 в основной части промотора htert нивелируют репрессию промотора htert с помощью p73, свидетельствуя об участии Sp1 в этом процессе в качестве посредника. Кроме того, р73 связывается с Sp1, что подтверждает участие Sp1 в p73-зависимом угнетении экспрессии htert.

Клеточная локализации In vitro высокая активность теломеразы наблюдается в цитоплазматическом экстракте, а не в ядерном, хотя для работы теломеразы в клетке она должна быть локализована вместе с теломерами в ядре . При этом in vivo GFP-содержащая теломераза локализуется в ядре . При связывании nF-kB (р65 субъединица) с белком htert фактор некроза опухолей α (tumor necrosis factor α, он же tnF α) индуцирует перенос из цитоплазмы в ядро htert, связанный с nF-kB. Белок 14-3-3, отвечающий за ядерную локализацию, связывается с теломеразой. Доминант-негативный 14-3-3 направляет в цитоплазму htert, в норме локализованный в ядре. Мутантный htert, не способный связываться с 143-3, локализуется в цитоплазме. 14-3-3 мешает связываться белку crM1 с neS-мотивом (nuclear export signal, сигнал экспорта из ядра). Ингибирование crM1/экспортин1 пути ядерного экспорта, как и нарушение neS-мотива, приводит к уменьшению локализации htert в цитоплазме [170]. htert большую часть клеточного цикла не локализуется в нуклеолях, тельцах Кахаля или на теломерах. В S-фазе клеточного цикла htert перемещается в нуклеоли, затем в тельца Кахаля и затем на теломеры [15, 16].

Регуляция теломеразная РНК

В тканях взрослых людей высокий уровень экспрессии теломеразной РНК обнаружен в первичных сперматоцитах и клетках Сертоли, средний уровень экспрессии – в лимфатических фолликулах, слабый уровень экспрессии – в эпителии, а в клетках нервной системы и тканях, происходящих из мезенхимы, экспрессия htr отсутствует . Заметный уровень экспрессии обнаружен в тонком кишечнике, яичниках, селезенке, тимусе, почках и простате. Низкий уровень экспрессии htr наблюдается в мозге, печени, желудке, поджелудочной железе, легких и сердце.

В теломераза-положительных образцах опухолевых тканей наблюдали сильную экспрессию htr, а в теломераза-негативных саркомах мягких тканей только половина экспрессировала htr в различной степени. В теломераза-негативных опухолях нет связи между экспрессией htr и пролиферативным статусом, длиной теломер и экспрессией htert . Повышенная экспрессия htr не связана с теломеразной активностью, например, в раке легких . Методом in situ гибридизации определено, что в случае пищевода Баррета и дисплазии пищевода ранней стадии htr отсутствует или экспрессируется со средней эффективностью, а на поздних стадиях развития дисплазии или рака эффективность экспрессии htr велика . В образцах рака легких в случае применения ОТ-ПЦР (обратной транскрипции и ПЦР) htr выявляется в 90-100 % случаев образцов как раковых, так и нормальных тканей . При определении в раке легких методом гибридизации in situ htr обнаруживался всего в 26 % раковых тканей, определенных гистологическим анализом, для некоторых образцов хорошо определяется разница между раковыми и нормальными тканями. Этим же методом определена экспрессия htr в 41 % плоскоклеточной карциномы, 13 % и 17 % аденокарцином молочной железы и яичников, 43 % рака и 40 % предраковых поражений шейки матки . К сожалению, неизвестна дальнейшая судьба пациентов с предраковыми поражениями, поэтому невозможно говорить об экспрессии htr как о маркере развития онкогенного процесса. Для использования экспрессии htr в качестве ракового маркера необходимо проводить точный количественный анализ в отличии от экспрессии htert или определения теломеразной активности. При анализе нейробластом в 9 из 12 образцах раков средних стадий и только в 2 из 8 образцов раков ранних стадий обнаружен высокий или средний уровень экспрессии htr. Заболевание не прогрессировало у пациентов с низким уровнем экспрессии htr или без нее. В случае 8 образцов рака (от 7 пациентов) со средним или высоким уровнем экспрессии htr развитие болезни было неблагополучным. Следует отметить, что в случае поздней стадии болезни с обширными метастазами (4 образца) экспрессия htr была слабой. Экспрессия htr в ганглионейробластомах и ганглионейромах ограничена только нервными клетками, в леммоцитах она отсутствует. Таким образом, в неметастазирующих нейробластомах экспрессия htr оказалась хорошим прогностическим фактором . Для рака Вильямса именно экспрессия htr, но не htert, является предсказательным фактором дальнейшего развития. У 30 % пациентов с наибольшей экспрессией htr (количественную оценку проводили ОТ-ПЦР в реальном времени) вероятность рецидива вдвое выше по сравнению с пациентами с наименьшим уровнем экспрессии htr . Также высокий уровень экспрессии htr коррелирует с плохим прогнозом у пациентов с липосаркомой . Повышение экспрессии htr не всегда совпадает с появлением теломеразной активности. htr ингибирует протеинкиназу контрольных точек Atr. Подавление уровня экспрессии htr приводит к остановке клеточного цикла в G1- и G2-фазах в результате активации белка p53 и протеинкиназы контрольных точек cHK1. Этот эффект не зависит от теломеразной активности. Возрастание экспрессии htr в ответ на ультрафиолетовое облучение предотвращает активацию p53 и cHK1 в результате ингибирования активности Atr, тем самым ослабляя клеточный ответ на повреждение ДНК и позволяя клеткам проходить контрольную точку G2/M. Взаимодействия между htr и AtM не обнаружено, так что механизм этого ингибирования остается неизвестным .

Регуляция в ходе ответв на ионизирующие излучения

При изучении процессов, происходящих при онкогенезе, нельзя обойти вниманием последствия воздействия на клетки различных видов излучений. С одной стороны, они способны провоцировать онкогенные процессы (УФоблучение является провокатором рака кожи, проникающие ионизирующие излучения могут вызывать различные типы раков и т.д.), а с другой стороны, различные типы облучения применяются для борьбы с раком (β-частицы, нейтроны, γ- и рентгеновское облучение и т.д.). Поскольку активность теломеразы ассоциирована с большим числом раков, логичен вопрос, что же происходит с этой активностью при облучении. Также представляется интересным, может ли облучение вызывать активность теломеразы. При изучении воздействия ионизирующего излучения на клеточную линию HeLa обнаружено, что теломеразная активность и количество мРНК htert возрастают в первые 24 ч, вплоть до двукратного превышения по сравнению с необлученными образцами, а потом за 72 ч возвращаются к исходному значению . При воздействии на клетки гемопоэтической клеточной линии γ- и нейтрон/γ-излучения наблюдается увеличение теломеразной активности и количества мРНК htert, зависящее от дозы и интенсивности облучения. В случае нейтрон/γ-излучения сначала происходит уменьшение, а затем увеличение теломеразной активности. Влияние излучений разной энергетики различается по величине и кинетике, но одинаково по механизму воздействия на клетки. Изменения в теломеразной активности не связаны ни с изменением клеточного цикла, ни с индукцией клеточной смерти, а являются последствиями специфических регуляторных ответов на ионизирующие излучения . Клетки HeLa с укороченными теломерами после трансфекции Dn-htert (доминантно-негативный мутантный htert) становятся более восприимчивыми к воздействию ряда химиотерапевтических агентов и облучению. Клетки, трансфицированные htert дикого типа, с более длинными теломерами проявляют большую устойчивость к химиотерапевтическим агентам и облучению. УФ-облучение провоцирует теломеразную активность в различных типах клеток, включая клетки кожи. Кроме кожи, УФ-воздействию постоянно подвергаются глаза. Оказалось, что уровень теломеразной активности и количество мРНК htert и htr возрастают только при получении хрусталиком определенной энергии УФ-излучения.

Заключение

Знания о системе регуляции теломеразы позволят более эффективно разрабатывать методики и препараты для подавления теломеразной активности в раковых клетках. К сожалению, многие механизмы регуляции теломеразы тканеспецифичны. Выявление взаимосвязи системы регуляции теломеразы с другими онкогенами может помочь в разработке комплексной диагностики рака, позволяющей выявлять заболевание и определять тактику борьбы с ним на наименее агрессивной стадии. Теломеразная активность является маркером активно делящихся клеток и одним из наиболее универсальных маркеров рака.

Код для цитирования: Скопировать