В работе были использованы существующие коммерческие бактериофаги Listeria - L2А, L4A (ФИЦВИМ, г. Покров, Россия) и P100 (Голландия).
Штаммы фагов поддерживали на индикаторных культурах L.monocytogenes - 9-72, L.monocytogenes - 9-127, L.monocytogenes - 10522 в мясопептонном бульоне. Для повышения активности бактериофагов проводили пассажи.
Опытным путем определяли оптимальное соотношение между временем пассажа и активностью фагов [1-21]. Для этого в пробирки с 4,5 мл мясопептонного бульона добавляли по 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл изучаемого бактериофага. Параллельно ставили контроль: мясопептонный бульон, засеянный индикаторной культурой без фага. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 4, 6, 8, 10 или 12 часов. После наступления лизиса содержимое пробирок с фагами пропускали через бактериальные фильтры. Литическую активность полученных фаголизатов исследовали методами Аппельмана и Грациа. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Зависимость активности фагов от времени пассажа
Фаги |
Вариант |
Время пассажа, часов |
Литическая активность |
|
по методу Аппельмана |
по методу Грациа |
|||
L2A |
1 |
4 |
10-7 |
2 х 108 |
2 |
6 |
10-9 |
2 х 109 |
|
3 |
8 |
10-7 |
4 х 108 |
|
4 |
10 |
10-7 |
3 х 108 |
|
5 |
12 |
10-7 |
3 х 108 |
|
L4A |
1 |
4 |
10-8 |
1 х 108 |
2 |
6 |
10-9 |
1 х 109 |
|
3 |
8 |
10-8 |
1 х 109 |
|
4 |
10 |
10-7 |
3 х 108 |
|
5 |
12 |
10-7 |
2 х 108 |
|
P100 |
1 |
4 |
10-8 |
2 х 109 |
2 |
6 |
10-10 |
2 х 1010 |
|
3 |
8 |
10-9 |
4 х 109 |
|
4 |
10 |
10-9 |
3 х 109 |
|
5 |
12 |
10-8 |
2 х 109 |
Установлено, что оптимальное время пассажа при температуре 37°С для фагов L2A и L4A составляет 6 часов. За это время происходит лизис индикаторной культуры (просветление среды по сравнению с контролем), литическая активность фагов при этом составляет 10-9 по методу Аппельмана и 2 х 109 (L2A) и 1 х 109 (L4A) по методу Грациа. Для фага Р100 оптимальное время пассажа при температуре 37°С также составляет 6 часов, активность при этом 10-10 по методу Аппельмана и 2 х 1010 по методу Грациа.
Таким образом, оптимальное время пассажа для фагов L2A, L4A и P100 составляет 6 часов. Этот вариант соотношения активности фагов от времени пассажа является удобным для работы и был использован нами в дальнейших исследованиях.
Библиографическийсписок:
1. Васильев, Д.А.Разработка параметров количественного определения бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii на основе мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина, А.В. Мастиленко // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных». Покров. - 2014. - С. 91-96.
2. Разработка системы фаготипирования листерий / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. – 2014. – сентябрь, специальный выпуск – С. 87-88.
3. Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. – 2014. – сентябрь, специальный выпуск – С. 69-70.
4.Сульдина Е.В. Применение метода молекулярно-генетического анализа для видовой идентификации мяса/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 227-231.
5.Сульдина Е.В. Применение метода Real-time PCR для видовой идентификации мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова,С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 236-240.
6.Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах методом ДНК-диагностики/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 231-235.
7. Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мяса методом полимеразной цепной реакции в режиме «Реального» времени/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 241-244.
8. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом ПЦР в режиме реального времени / А.С. Гранкина, Е.В. Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 84-88.
9. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом классической ПЦР / А.С. Гранкина, Е.В.Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 89-93.
10. Сульдина Е.В. Выделение листериозных бактериофагов и изучение их основных биологических свойств / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Б.И. Шморгун, Д.А. Васильев // Аграрный научный журнал. Саратов. - 2015. № 3. С. 37-41.
11. Сульдина Е.В. Фаготипирование листерий / Е.В.Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва - 2014. с. 223.
12. Ковалева Е.Н. Вопросы биоконтроля пищевого листериоза / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина, И.Г. Швиденко, Б.И. Шморгун // Материалы VII Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва. - 2015. с. 157.
13. Сульдина Е.В. Количественное определение патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции "Инновации в пищевой технологии, биотехнологии и химии". Саратов. – 2017. - С. 202-204.
14. Сульдина Е.В. Разработка параметров количественного определения патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания методом Real-Time PCR / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С. 412-413.
15. Сульдина Е.В. Оптимизация эффективности мультиплексной ПЦР-тест-системы для детекции L. monocytogenes и L.ivanovii / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С. 425-426.
16. Гранкина А.C. Идентификация штаммов листерий коллекции 1960-1970 гг. методом ПЦР/ А.C. Гранкина, Е.В. Сульдина // Материалы Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. – Ульяновск. - 2017. - С. 66-71.
17. Ломакин А.А. Дифференциация бактерий видов Bordetella trematum и Bordetella petrii / Ломакин А.А., Мастиленко А.В., Васильева Ю.Б. и др.// Материалы Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. – Ульяновск. - 2017. - С. 83-86.
18. Сульдина Е.В. Выделение бактерий и бактериофагов Yersinia enterocolitica / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017. - № 3 (39). - С. 50-55.
19. Сульдина Е.В. Создание тест-системы на основе бактериофагов для детекции возбудителя пищевого листериоза и мониторинга листериозной инфекции // Молодежный инновационный форум Сборник аннотаций проектов. Ульяновск. - 2016. - С. 353-355.
20. Сульдина Е.В. Листериозные бактериофаги – как средство индикации и идентификации L. monocytogenes. /Сульдина Е.В., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. и др. // Материалы Третьей научно-практической конференции с международным участием Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. - 2016. с. 85.
21. Сульдина Е.В. Основные биологические свойства листериозных бактериофагов / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Материалы VI Международной научно-практической конференции Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения. Ульяновск. - 2015. - С. 125-127.