X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Цель работы – изучить литическую активность коммерческих бактериофагов бактерий рода Listeria.

В работе были использованы существующие коммерческие бактериофаги Listeria - L2А, L4A (ФИЦВИМ, г. Покров, Россия) и P100 (Голландия).

Литическую активность бактериофагов определяли методами Аппельмана (метод серийных разведений в жидких питательных средах) и Грациа (метод агаровых слоев на плотных питательных средах) [1-21].

Для титрования в жидкой питательной среде (по методу Аппельмана) двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл мясопептонного бульона, ставили в штатив в один ряд. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносили 0,5 мл исследуемого фага, содержимое пробирки перемешивали и 0,5 мл жидкости из 1-й пробирки переносили во 2-ю, из 2-й – в 3-ю и т.д. до 10-й включительно. Из 10-й пробирки лишние 0,5 мл выливали; 11-я и 12-я пробирки - контрольные. Жидкость переносили из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл. Таким образом, в 10 пробирках получали разведение бактериофага от 10^-1 до 10^-10.

Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносили по 0,2 мл 22-часовой бульонной индикаторной культуры L.monocytogenes. Пробирка 11-я - контроль культуры, содержит 4,5 мл бульона и 0,2 мл 22-часовой бульонной культуры L.monocytogenes. Пробирка 12-я - контроль на стерильность, содержит 4,5 мл бульона без добавления бактерий и фага. Штатив с пробирками помещали в термостат при 37°С на 6 - 8 часов.

Титром считали то максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдали полный лизис чувствительной к нему культуры - это соответствовало той последней пробирке в ряду, в которой бульон еще оставался совершенно прозрачным.

Определение литической активности бактериофагов на плотной питательной среде (по методу Грациа) основано на внесении различных разведений исследуемого бактериофага в соответствующую культуру бактерий и посеве смеси на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага.

Для этого в чашки Петри разливали 25 - 30 мл 1,5 % мясопептонного агара. Чашки со средой покрывали стерильной фильтровальной бумагой и подсушивали 30 мин в термостате или 2 - 3 ч при комнатной температуре, после чего закрывали крышкой и оставляли на ночь в комнате.

В день постановки опыта из жидкости, содержащей исследуемый фаг, готовили в пробирках ряд последовательных разведений. Для разведений фага использовали стерильный бульон.

Затем в пробирки с 2,5 мл 0,7 % мясопептонного агара, расплавленного в водяной бане и остуженного до 44 - 46°С, вносили по 1 мл фага каждого разведения. Одновременно с фагом в каждую пробирку вносили по 0,2 мл 22-часовой бульонной индикаторной культуры L.monocytogenes. Содержимое пробирок перемешивали, быстро вращая пробирки между ладонями, и выливали вторым слоем в чашки с 1,5 % агаром. После остывания среды чашки с посевами инкубировали при 37°С в течение 18 - 20 часов.

Титр фага определяли путем подсчета количества негативных колоний на чашках и умножением полученного числа на показатель разведения.

Литическая активность фагов составляла от 10^-8 до 10^-9 по методу Аппельмана и от 1 х 10⁸ до 2 х 10⁹ по методу Грациа (табл. 1).

Таблица 1 - Литическая активность коммерческих листериозных бактериофагов

Бактериофаги	Литическая активность
	по методу Аппельмана	по методу Грациа
L2A	10-8	2 х 108
L4A	10-8	1 х 108
P100	10-9	2 х 109

В результате проведенных исследований можно сделать вывод, что все штаммы коммерческих фагов обладют литической активностью, достаточной для использования их в качестве диагностических прапаратов.

Библиографическийсписок:

1. Васильев, Д.А.Разработка параметров количественного определения бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii на основе мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина, А.В. Мастиленко // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ «Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных». Покров. - 2014. - С. 91-96.

2. Разработка системы фаготипирования листерий / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. – 2014. – сентябрь, специальный выпуск – С. 87-88.

3. Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. – 2014. – сентябрь, специальный выпуск – С. 69-70.

4.Сульдина Е.В. Применение метода молекулярно-генетического анализа для видовой идентификации мяса/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 227-231.

5.Сульдина Е.В. Применение метода Real-time PCR для видовой идентификации мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова,С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 236-240.

6.Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мясного сырья в мелкоизмельченных полуфабрикатах и готовых мясных продуктах методом ДНК-диагностики/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 231-235.

7.Сульдина Е.В. Определение видовой принадлежности мяса методом полимеразной цепной реакции в режиме «Реального» времени/Е.В. Сульдина, О.Л. Колбасова, С.В. Мерчина//Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции. Ульяновск. -2012. -С. 241-244.

8. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом ПЦР в режиме реального времени / А.С. Гранкина, Е.В. Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 84-88.

9. Гранкина А.С. Идентификация листерий методом классической ПЦР / А.С. Гранкина, Е.В.Сульдина // Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии Материалы IX-й Международной студенческой научной конференции. Ульяновск. - 2016. - С. 89-93.

10. Сульдина Е.В. Выделение листериозных бактериофагов и изучение их основных биологических свойств / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Б.И. Шморгун, Д.А. Васильев // Аграрный научный журнал. Саратов. - 2015. № 3. С. 37-41.

11. Сульдина Е.В. Фаготипирование листерий / Е.В.Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва - 2014. с. 223.

12. Ковалева Е.Н. Вопросы биоконтроля пищевого листериоза / Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Е.В. Сульдина, И.Г. Швиденко, Б.И. Шморгун // Материалы VII Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням с международным участием. Москва. - 2015. с. 157.

13. Сульдина Е.В. Количественное определение патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы Международной научно-практической конференции "Инновации в пищевой технологии, биотехнологии и химии". Саратов. – 2017. - С. 202-204.

14. Сульдина Е.В. Разработка параметров количественного определения патогенных листерий в пищевом сырье и продуктах питания методом Real-Time PCR / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С. 412-413.

15. Сульдина Е.В. Оптимизация эффективности мультиплексной ПЦР-тест-системы для детекции L. monocytogenes и L.ivanovii / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев // Материалы IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. Москва. - 2017. - С. 425-426.

16. Гранкина А.C. Идентификация штаммов листерий коллекции 1960-1970 гг. методом ПЦР/ А.C. Гранкина, Е.В. Сульдина // Материалы Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. – Ульяновск. - 2017. - С. 66-71.

17. Ломакин А.А. Дифференциация бактерий видов Bordetella trematum и Bordetella petrii / Ломакин А.А., Мастиленко А.В., Васильева Ю.Б. и др.// Материалы Международной научной конференции Молодежь и наука XXI века. – Ульяновск. - 2017. - С. 83-86.

18. Сульдина Е.В. Выделение бактерий и бактериофагов Yersinia enterocolitica / Е.В. Сульдина, Д.А.Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017. - № 3 (39). - С. 50-55.

19. Сульдина Е.В. Создание тест-системы на основе бактериофагов для детекции возбудителя пищевого листериоза и мониторинга листериозной инфекции // Молодежный инновационный форум Сборник аннотаций проектов. Ульяновск. - 2016. - С. 353-355.

20. Сульдина Е.В. Листериозные бактериофаги – как средство индикации и идентификации L. monocytogenes. /Сульдина Е.В., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. и др. // Материалы Третьей научно-практической конференции с международным участием Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. - 2016. с. 85.

21. Сульдина Е.В. Основные биологические свойства листериозных бактериофагов / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев // Материалы VI Международной научно-практической конференции Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения. Ульяновск. - 2015. - С. 125-127.

Код для цитирования: Скопировать