X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Иммунохимический анализ объединяет методы, основанные на реакциях антиген-антитело. Такие реакции часто называют «серологическими», так как до недавних пор единственным источником антител служила сыворотка (лат. serum) крови иммуннизированных животных. Лишь с внедрением гибридомной технологии антитела стали получать в культурах клеток. Это существенно повысило специфичность анализа, так как каждая гибридома продуцирует антитела против единственного эпитопа.

С помощью иммунохимического анализа решаются две основных задачи: выявление антител и антигенов. Определение антител проводят в реакциях с известными антигенами, для обнаружения антигенов используют известные антитела. Например, выявление поверхностного антигена вируса гепатита В проводят при помощи антител против HВsAg, а наличие анти-HВs антител тестируют в реакциях с HвsAg.

Главным стимулом для совершенствования иммунохимических методов было (и остается) стремление к повышению их чувствительности: она тем выше, чем меньше концентрация выявляемых антител и антигенов. Другим мотивом служило изучение антигенных смесей, нацеленное на расшифровку входящих в их состав компонентов. Сюда примыкает анализ спектра антител, продуцируемых в ходе иммунного ответа, например инфекционного процесса1.

Взаимодействие антиген-антитело исследуют на двух уровнях – первичном и вторичном. В первом случае констатируют лишь сам факт образования иммунного комплекса. Это можно сделать, если антиген или антитело мечены подходящим маркером, например, изотопом. Такие анализы отличаются максимальной чувствительностью. Вторичный уровень характеризуется внешними (видимыми) проявлениями реакции. Они требуют для своего воспроизведения более высокой концентрации ингредиентов (антигенов и антител), т.е. менее чувствительны.

Методы, основанные на вторичных (внешних) проявлениях реакции антиген-антитело (реакции второго уровня).

Внешние (вторичные) эффекты, на которых базируется иммунохимический анализ, включают агглютинацию, преципитацию, связывание комплемента, нейтрализацию или усиление биологических эффектов антигенов.

Агглютинация (от лат. agglutinare – склеивать). Один из ингредиентов реакции (обычно антиген) находится в корпускулярной форме. Антитела выявляются по их способности агглютинировать антигенные частицы, например, бактерии, эритроциты, латекс и пр.

Антиген может быть собственным компонентом частицы либо искусственно сорбирован на ней. В первом случае говорят о прямой агглютинации, второй вариант называется непрямой, или пассивной агглютинацией. Чувствительность пассивной агглютинации выше, так как плотность антигенных молекул на частицах в этом случае больше, чем на естественных носителях. Одним из распространенных адсорбентов служат эритроциты – реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Преципитация (от лат. precipitare – осаждать). Оба ингредиента находятся в растворимой форме. При их взаимодействии (в определенных концентрациях и соотношениях) образуется осадок. Наиболее широко используется двойная (или встречная) иммунодиффузия в геле (агар, агароза). В этом случае антиген и антитело мигрируют навстречу друг другу, и каждая пара образует собственную линию преципитации. Исследуя количество и взаиморасположение линий, можно судить о числе ингредиентов реакции и степени их идентичности.

Разрешающую способность метода можно существенно повысить, если смесь антигенов предварительно (перед встречной иммунодиффузией) подвергнуть электрофорезу. В этом случае антигены распределяются на большем пространстве, что

повышает дискретность линий преципитации. Эта методика известна как иммуноэлектрофорез. Несмотря на низкую чувствительность иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез незаменимы для решения специальных задач.

Связывание комплемента. Реакция основана на том, что комплексы антиген-антитело (IgM и IgG), активируя (связывая) комплемент, снижают его содержание в сыворотке. Это происходит даже тогда, когда иммунные комплексы не обнаруживаются визуально, т.е. не образуют агглютинатов или преципитатов. Поэтому РСК отличается высокой чувствительностью.

О потреблении (связывании) комплемента судят по индикаторной системе, которая выявляет цитолитическую активность комплемента. Такой системой служат эритроциты барана, покрытые (сенсибилизированные) антиэритроцитарными антителами1, и сыворотка морской свинки (комплемент). Фиксируя комплемент, сенсибилизированные эритроциты (т.е. комплекс антиген-антитело) подвергаются гемолизу. Напротив, если их добавляют в среду, где произошла реакция антиген-антитело, гемолиз отсутствует, так как комплемент истощается «чужими» иммунными комплексами. На этом основании судят о присутствии антител (добавление известного антигена) или антигена (добавление известных антител).

Нейтрализация биологических эффектов антигена.Если антиген обладает биологической активностью, антитела можно выявить по ее подавлению. К такого рода реакциям относится нейтрализация бактериальных токсинов, иммобилизация бактерий, инактивация вирусов и бактериофагов. В диагностической иммунологии широко используется реакция торможения вирусной гемагглютинации. Она основана на способности антител блокировать агглютинацию эритроцитов антигенами (гемагглютининами) вирусов.

Усиление биологических эффектов антигена.Можно привести два примера, когда антитела усиливают (точнее проявляют) биологическую активность антигенов или их носителей. Внутрикожная апликация IgE-антител, содержащихся в сыворотке больных атопическими заболеваниями, предрасполагает к местной аллергической реакции на введение (в то же место) специфического антигена (диагностический тест Прауснитца-Кюстнера). Другой пример – опсонический эффект антител в реакциях с фагоцитами. Здесь антитела после связывания с объектом фагоцитоза (например, бактериями) напрямую или опосредованно (через комплемент) активируют фагоциты.

Методы, основанные на меченых антителах (реакции первого уровня)

К этой группе относятся иммунофлюоресцентный, радиоиммунный и иммуноферментный анализы. Они обладают наиболее высокой чувствительностью, так как не зависят от внешних (вторичных) эффектов, связанных с образованием иммунных комплексов.

Иммунофлюоресцентный (иммунолюминесцентный) анализ. Для обнаружения тканевых или микробных антигенов можно использовать антитела, конъюгированные с флюорохромами. Их свечение возбуждается ультрафиолетом и исследуется при помощи специального (люминесцентного) микроскопа. В качестве метки чаще всего применяют флюоресцеин. Поглощая ультрафиолет с длиной волны 290-495 нм, он испускает видимый свет (флюоресцирует) в зеленой части спектра (525 нм). При помощи иммунофлюоресцентного метода была впервые установлена природа клеток, синтезирующих антитела, определена локализация иммунных комплексов при аутоиммунной патологии, разработаны новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний.

Метод используется в двух основных вариантах – прямом и непрямом. В первом случае антитела, конъюгированные с флюорохромом, вступают в непосредственный контакт с антигенами, фиксированными на предметном стекле (мазки из инфицированного материала, тканевые срезы). В зонах локализации антигена возникает свечение, обнаруживаемое под люминесцентным микроскопом.

Непрямой, или сэндвич-метод может быть использован для определения как антигенов, так и антител. Реакцию проводят в два этапа. Сначала антигены, фиксированные на предметном стекле, обрабатывают немечеными антителами. После отмывания связавшиеся с антигеном антитела выявляют при помощи антииммуноглобулиновых антител, меченых флюоресцеином. Это дает возможность пользоваться унифицированным реагентом (меченые антиантитела) для выявления антител к разным антигенам.

Радиоиммунный анализ. Меткой служат изотопы, обычно радиоактивный йод. Одним из распространенных вариантов является количественное определение антигенов по конкурентному связыванию с антителами. Принцип основан на ослаблении реакции между антителами и меченым антигеном в присутствии того же, но немеченого антигена. Чем больше антигена в исследуемом образце, тем больше антител будет им заблокировано и тем меньше антител останется для связывания меченого антигена, вносимого в ту же систему. Измеряя радиоактивность иммунных комплексов, можно судить о содержании антигена в исследуемом материале.

Для отделения иммунных комплексов от непрореагировавших ингредиентов предложены разные способы. Самый популярный основан на принципе твердофазных сорбентов. В этом случае антитела фиксируются на инертных частицах, которые легко осаждаются при центрифугировании. Вместе с ними будут оседать и связанные (в том числе меченые) антигены.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Неудобство работы с радиоактивными изотопами побудило к разработке реакций, основанных на антителах и антигенах, конъюгированных с ферментами, чаще с пероксидазой (ее получают из хрена). Присутствие энзиммеченых молекул можно обнаружить визуально или спектрофотометрически по изменению цвета хромогенного субстрата, чувствительному к данному ферменту1. Реакция отличается высокой чувствительностью, так как для ее выявления достаточно ничтожной концентрации фермента (10^-15 моль/л и ниже).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА2. Он основан на том, что один из ингредиентов (антиген или антитело) фиксируется на инертном носителе (обычно полистироле), выполняя роль иммуносорбента. Существуют разные модификации метода. В их основе лежат принципы, о которых уже говорилось в связи с иммунофлюоресцентным и радиоиммунным анализами.

Иммуноблоттинг («Western Blot”). На основе ИФА разработан один из самых специфичных и чувствительных методов иммунохимического анализа – иммуноблоттинг (от англ. blot – промокать, пятно). Он сочетает ИФА с электрофорезом и предназначен для изучения спектра антител к антигенным смесям. Кроме решения научных задач, это имеет важное значение в диагностике некоторых инфекций (таких как гепатит С и СПИД) для исключения ложноположительных результатов «обычного» ИФА (они изредка возникают за счет перекрестно реагирующих («неспецифических») антител).

Принцип метода (на примере выявления антител к вирусу иммунодефицита человека) . Смесь антигенов, экстрагированных из исследуемого объекта (в данном случае ВИЧ), разделяют на фракции при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и, используя электрофорез, воспроизводят на ней точную копию белковых фракций, полученных в полиакриламидном блоке1. На заключительном этапе полоски (стрипы) нитроцеллюлозы анализируют в реакции ИФА с исследуемой сывороткой. Количество выявленных фракций (пятен) отражает спектр антител к антигенам анализируемой смеси. Наличие антител к двум и более антигенам предполагаемого возбудителя не может быть случайным, подтверждая диагноз заболевания.

В последние годы разрабатываются методы, позволяющие одновременно дифференцировать множество (несколько тысяч) антигенов. Они основаны на использовании наборов (библиотек) рекомбинантных антител, принципиально новых микросорбентов (чипсов, англ. chips) и методов ультраточечной регистрации реакций (лазерная десорбционно-ионизационная масс-спектроскопия, плазмоновый резонанс и др.). Это открывает новые перспективы для функциональной генетики (расшифровка протеома, т.е. всех белков, закодированных в геноме клеток), сравнительного картирования белков нормальных и патологических (в частности, раковых) клеток, изучения фармакологических воздействий и пр.

Иммунохимические методы, основанные на использовании меченых реагентов, широко применяют дпя определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток. Внедрение гомогенного варианта ИФА в область клинической биохимии содействовало созданию высокочувствительных методов определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ. Большим преимуществом этого метода является возможность использования малых объемов анализируемой пробы (5—50 мкл) и отсутствие стадии пробоподготовки. 

Таким образом, иммунохимические методы анализа можно применять при:

Генетической склонности к иммунным патологиям. Анализ позволяет выявить малейшие сбои в функциональности иммунитета. Такие нарушения в скором времени провоцируют развитие иммунодефицита, истинную причину которого определить очень трудно. Нередко иммунные заболевания имеют генетическую предрасположенность и внезапно проявляются в любом возрасте.

Подозрениях на онкологические патологии. Анализ охватывает и онкомаркеры. Он показывает не только присутствие злокачественных клеток, но и показывает процентную предрасположенность пациента к образованию опухолей.

Проблемах с зачатием. Семейные пары, которые испытывают трудности в зачатии ребенка на протяжении длительного времени, могут пройти анализ на половые гормоны, чтобы определить причину и степень совместимости с партнером.

Список литературы:

http://meddaily.info/?cat=article&id=715

http://chem21.info/info/187715/

https://studopedia.su/10_97768_lektsiya--immunohimicheskiy-analiz.html

http://zodorov.ru/annotaciya-v2.html?page=40

http://ru-ecology.info/post/100162500040037/

http://lechiserdce.ru/analiz-krovi/10398-immunohimicheskogo-analiza.html

Код для цитирования: Скопировать