X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Актуальность.

Молекулярно-генетические механизмы развития и работы глаза человека крайне интересны для биомедицины. Межклеточные взаимодействия и экспрессия генов в морфогенезе глаза занимают важное место. Нарушения в работе регуляторных генов на эмбриональной стадии могут приводить к значительным патологиям зрительной функции. Некоторая патология глаза (глаукома, пигментный ретинит и др.) затрагивает в той или иной степени гистогенез и структуру составляющих его тканей и приводит к ретинопатии. В связи с этим изучение молекулярно-генетических механизмов формирования тканей глаза в эмбриональном развитии человека не теряет своей актуальности. В настоящей работе мы исследовали экспрессию регуляторных генов, принадлежащих к «генам глазного поля»: сигнального белка TGFbeta2 и транскрипционных факторов PITX2, FOXC1, PAX6 в ходе развития сетчатки и пигментного эпителия, важных составляющих глаза человека. Интерес к транскрипционному фактору PAX6/Pax6 обусловлен тем, что он находятся в числе основных регуляторов морфогенеза глаза позвоночных [5]. Мультифункциональный сигнальный белок TGFbeta, выполняет функцию ингибитора пролиферации, участвует в регуляции пролиферации, апоптоза, дифференцировки клеток глаза [6, 7]. Регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2/Pitx2 и FOXC1/Foxc1 контролируют в составе общего сигнального пути морфогенез переднего сегмента глаза позвоночных в эмбриональном развитии и вовлечены в патогенез глаукомы [8, 9].

Цель работы состояла в детальном сравнительном исследовании динамики экспрессии генов TGFbeta2, PITX2, FOXC1, PAX6 и их белковых продуктов в сетчатке и ретинальном пигментном эпителии человека в пренатальном развитии человека.

Материал и методы

В настоящем исследовании охвачен пренатальный период развития человека, с 9.5 до 22-й нед. гестации. Абортивный материал получали из лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательства РФ об охране здоровья граждан, в соответствии с утвержденным перечнем медицинских показаний. Возраст плодов соответствует срокам, установленным врачом-акушером. Для оценки распределения мРНК исследуемых генов были использованы молекулярно— биологические методы (обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция, ОТ— ПЦР). Тотальную РНК выделяли из изолированных сетчатки и пигментного эпителия с помощью TRI^® Reagent (Sigma, США). Другие ткани глаза в данной работе не анализировали. Синтезировали кДНК— библиотеки из тканей, взятых с разных стадий развития глаза, проводили ПЦР с использованием набора реактивов для амплификации (Силекс М, Россия). кДНК— библиотеки нормировали по уровню экспрессии гена, кодирующего рибосомальный белок RPL19. Белки локализовали на криосрезах глаза методом флуоресцентной иммунохимии. Использовали антитела к TGFbeta2 (Abcam, Англия, 1:20), PITX2 (Sigma, США, 1:200), PAX6 (Abcam, Англия, 1:200), FOXC1 (Abcam, Англия, 1:180) и вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромами Aleksa 488 или Aleksa 546 (Molecular Probes, США, 1:1000). Срезы заключали в среду Vectashield (Vector, США). Отрицательным контролем служила реакция без первичных антител. Иммунореакцию анализировали с помощью микроскопа DM RXA2 (Leica, Германия), программ Leica for Windows, ImageJ.

Методом ПЦР мы обнаружили мРНК TGFbeta2, PITX2, FOXC1 и PAX6 в сетчатке и пигментном эпителии глаза человека 9.5, 11, 13-14, 17-18 и 21-22 нед. гестации. Методом иммунохимии белки PITX2, FOXC1 были локализованы во внутреннем и наружном нейробластических слоях сетчатки 9.5 недели, ранней из анализируемых стадий гестации. Во внутреннем витреальном слое сетчатки PITX2 и FOXC1 были выявлены в ядрах дифференцирующихся ганглиозных клеток центральной области сетчатки. Известно, что в ходе гистогенеза сетчатки дифференцировка клеток распространяется от центра к периферии, а ганглиозные клетки начинают дифференцироваться первыми [10]. Локализация белка TGFbeta2 на 9.5 нед. развития имеет сходные черты: TGFbeta2 выявлен во внутреннем безъядерном слое сетчатки, образованным отростками формирующихся ганглиозных клеток и клеток глии Мюллера. На 9.5 нед. белки PITX2, FOXC1, TGFbeta2 также обнаружены в однослойном пигментном эпителии. На стадии переходной от эмбрионального к плодному периоду пренатального развития человека (11— 12 нед.) выявлен в сетчатке транскрипционный фактор PAX6. Другими авторами методом иммунохимии PAX6 был обнаружен на 8.5 нед. развития человека в нейробластах сетчатки, а на поздней стадии (21 нед.) — в ганглиозных клетках и в клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки [11].Эти данные находятся в соответствии с полученными нами методом ПЦР результатами об экспрессии гена PAX6 в пренатальной сетчатке человека на 8.5-9.5 и 22 нед. гестации [12]. Мы локализовали белок PAX6 в дифференцирующихся ганглиозных клетках центральной области сетчатки и отдельных клетках внутренней части внутреннего ядерного слоя (амакриновых, горизонтальных) на 11-12 нед. развития. Обнаруженный градиент экспрессии транскрипционного фактора PAX6: от внутреннего к наружному ядерному слою сетчатки, а также от ее центра к периферии, отражает пространственную динамику дифференцировки клеток. Белок PAX6 локализовали не только в сетчатке, но и в ретинальном пигментном эпителии. В свете недавних сведений, полученных на модели развития глаза мыши, наши результаты согласуются с бифункциональностью транскрипционного фактора PAX6 в этих тканях глаза, имеющих общее эмбриональное происхождение из нейроэпителия глазного пузыря. Проявление функций гена PAX6 в тканях глаза зависит от влияния межтканевых взаимодействий и взаимодействий между компонентами регуляторных генных сетей [13]. На стадии переходной от эмбрионального к плодному периоду сохраняется сходство локализации экспрессии регуляторных факторов PAX6, FOXC1, PITX2 и TGFbeta2 в формирующихся ганглиозных клетках и клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки (предположительно амакриновых). С 13-й по 17-ю нед. гестации человека белки PITX2 и FOXC1 экспрессируются в обоих ядерных слоях сетчатки, а также в ганглиозных клетках, которые к этому времени образуют отдельный слой. Белок TGFbeta2 к 17-й нед. локализуется в ганглиозных клетках, слое нервных волокон, образованном отростками ганглиозных клеток в формирующемся внутреннем сетчатом слое, на границе внутреннего ядерного слоя, где находятся амакриновые клетки. Наши результаты свидетельствуют об участии TGFbeta2 в контроле дифференцировки ганглиозных и амакриновых клеток. Белки PITX2, FOXC1 и TGFbeta2 локализованы и в пигментном эпителии. На 22-й нед. развития человека локализация белков PITX2 и FOXC1 существенно меняется, в сетчатке оба белка выявлены только в ядрах ганглиозных клеток, а в пигментном эпителии не детектируются. Локализация TGFbeta2 на этой стадии также смещается в витреальную часть сетчатки и обнаруживается в нервных волокнах, сформированных аксонами ганглиозных клеток, дифференцировка которых близка к завершению. В пигментном эпителии на этой стадии мы выявили единичные клетки, экспрессирующие TGFbeta2. Известно, что функция TGFbeta2 в пигментном эпителии глаза взрослых млекопитающих связана с предотвращением прорастания кровеносных сосудов в сетчатку [14]. В развивающемся глазу человека TGFbeta2 может выполнять аналогичную функцию. На поздней стадии развития человека область экспрессии PITX2 и FOXC1 в сетчатке совпадает только в ядрах клеток ганглиозного слоя, а TGFbeta2 — в цитоплазме и аксонах ганглиозных клеток, формирующих зрительные пути. Источниками сигнального белка TGFbeta2 могут быть клетки пигментного эпителия, сосудистая оболочка, Мюллеровская глия [6, 15]. Предполагаем, что в развивающейся сетчатке человека TGFbeta2 поддерживает баланс между пролиферирующими, вступившими в апоптоз и дифференцирующимися клетками. Основные результаты нашего исследования, демонстрирующие солокализацию TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в ганглиозных клетках формирующейся сетчатки человека отражены на схеме (рис. 1).

Заключение

Таким образом, функция факторов PITX2 и FOXC1 связана не только с контролем формирования тканей переднего сегмента глаза, как считалось ранее, но также с участием в регуляции гистогенеза сетчатки и ретинального пигментного эпителия человека. Результаты по локализации транскрипционного фактора PAX6 в дифференцирующихся ганглиозных клетках и клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки (амакриновых, горизонтальных) на 11–12-й нед. развития человека согласуются с участием РАХ6/Pax6 в контроле дифференцировки этого типа нейронов в сетчатке позвоночных. Полученные нами результаты также дополняют сведения об экспрессии РАХ6 в сетчатке человека в ходе эмбриогенеза [11, 16]. Пространственно-временная динамика экспрессии регуляторных факторов PAX6, TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 коррелирует с дифференцировкой ганглиозных клеток сетчатки в ходе пренатального развития человека. Предполагаем, что в дифференцирующихся ганглиозных клетках исследуемые регуляторные факторы функционируют в общем сигнальном пути. Полученные результаты являются основой для изучения взаимодействий регуляторных генов в ходе формирования сетчатки в развитии и при патологиях глаза, в частности глаукоме, характеризующейся гибелью ганглиозных клеток сетчатки.

Работа выполнена при поддержке научного фонда ДВФУ, в рамках государственного задания 17.5740.2017/6.7

ЛИТЕРАТУРА

1. Adler R., Canto-Soler M.V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: Complexities, ambiguities and controversies // Dev. Biol. — 2007. — Vol. 305. — P. 1-13.

2. Cvekl A. and Mitton K.P. Epigenetic regulatory mechanisms in vertebrate eye development and disease // Heredity. — 2010. — Vol. 105. — P. 135-151.

3. Reis L.M. and Semina E.V. Genetics of anterior segment dysgenesis disorders // Curr. Opin. Ophthalmol. — 2011. — Vol. 22, № 5. — P. 314-324.

4. Acharya M., Huang L.J., Fleisch V.C. et al. A complex regulatory network of transcription factors critical for ocular development and disease // Hum. Mol. Genet. — 2011. — Vol. 20, № 8. — P. 1-15.

5. Andreazzoli M. Molecular regulation of vertebrate retina cell fate // Birth Defects Research. 2009. — Vol. 87. — P. 284-295.

6. Close J.L., Gumuscu B. and Reh T.A. Retinal neurons regulate proliferation of postnatal progenitors and Muller glia in the rat retina via TGF beta signaling // Development. — 2005. — Vol. 132. — P. 3015—3026.

7. Duenker N. Transforming growth factor beta (TGF beta) and programmed cell death in the vertebrate retina // Int. Rev. Cytol. — 2005. — Vol. 245. — P. 17-43.

8. Ittner L.M, Wurdak H., Schwerdtfeger K. et al. Compound developmental eye disorders following inactivation of TGFβ signaling in neural-crest stem cells // J. Biol. — 2005. — Vol. 4, № 3. — P. 11.

9. Gould D.B., John S.W. Anterior segment dysgenesis and the developmental glaucomas are complex traits // Hum. Mol. Genet. — 2002. — Vol. 11. — P. 1185—1193.

10. Mann I. The development of human eye // University Press. Cambridge. British J. Ophthalmology. — 1928. — P. 306.

11. Nishina S., Kohsaka S., Yamaguchi Y. et al. PAX6 expression in the developing human eye // Br. J. Ophthalmol. — 1999. — Vol. 83, № 6. — P. 723-727.

12. Markitantova Yu.V., Smirnova Yu.A., Panova I.G. et al. Analysis of expression of regulatory genes Pax6, Prox1 and Pitx2 in differentiating eye cells in human fetus // Izv. Akad. Nauk. Ser Biol. — 2006. — Vol. 4. — P. 421-429.

13. Bharti K., Gasper M., Ou J. et al. A regulatory loop involving PAX6, MITF and WNT signaling controls retinal pigment epithelium development // PLoS Genet. — 2012. Vol. 8, № 7. — e. 1002757.

14. Bian Z.M., Elner S.G., Elner V.M. Regulation of VEGF mRNA expression and protein secretion by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells // Exp. Eye Res. — 2007. — Vol. 84, № 5. — P. 812-822.

15. Tan J., Deng Z.H., Liu S.Z. et al. TGFbeta2 in human retinal pigment epithelial cells: expression and secretion regulated by cholinergic signals in vitro // Curr. Eye Res. — 2010. — Vol. 35, №1. — P. 37-44.

16. Ferreiro-Galve S., Rodríguez-Moldes I., Candal E. Pax6 expression during retinogenesis in sharks: comparison with markers of cell proliferation and neuronal differentiation // J. Exp. Zool. B Mol Dev Evol. — 2012. — Vol. 318, № 2. — P. 91-108.

Код для цитирования: Скопировать