X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Когда речь заходит о флуоресцентных белках, люди сразу же вспоминают разноцветные клетки, интересные узоры бактерий на чашках Петри. С каждым годом диапазон применения флуоресцентных белков становится все шире и шире, — как и разнообразие самих белков. Без этого замечательного инструмента исследования достаточно трудно представить современную науку.

Зелёный флуоресцентный белок (GFP) выделен из медузы Aequorea victoria, он флуоресцирует в зелёном диапазоне при освещении его синим светoм. В настоящее время ген, отвечающий за синтез этого белка, используется в качестве светящейся метки в клеточной и молекулярной биологии для изучения белковой экспрессии. Разработаны модификации белка для применения в биосенсорах[1].

Зелёный флуоресцентный белок обладает двумя пиками поглощения при длинах волн 395 нм и 475 нм и пиком флуoресценции на 498 нм. Белок имеет в своем составе 238 аминокислот с молекулярной массой 26,9 кДа. Белок – это типичная бета-складчатая структура, формирующая «бочонок» или «цилиндр» из 11 повoротов первичной последовательности, внутри которого находится флуорофор. Оболочка данного цилиндра защищает флуорофор от тушения его флуоресценции компонентами микроокружения. Внутренняя структура молекулы вызывает специфические реакции циклизации трипептида Ser65–Tyr66–Gly67, что приводит к образованию флуорофoра. Данный процесс носит название созревания и таит в себе несколько этапoв, каждый из которых формирyет промежуточный или терминальный продукты с различными спектральными свойствами.

Зелёный флуоресцентный белок был выделен в 1960—1970-е года в Принстонском университете из медузы Aequorea victoria японским ученым Осаму Симомурой. Он изучал механизм свечения экворина и зеленого флуоресцентного белка. Оказалось, что в A. victoria взаимодействие Са²⁺ с экворином приводит к голубому свечению белка, а часть этой биолюминесценции переносится на зелёный флуоресцентный белок, который поглощает синий свет и затем испускает флуоресценцию зелёного цвета, в результате чего можно наблюдать зеленое свечение медузы.

В 1992 году американский микробиолог Дуглас Прэшер проклонировал и просеквенировал ДНК белка. В 1994 году Мартин Чалфи экспрессировал последовательность остатков аминокислот в Escherichia coli и Caenorhabditis elegans. Месяц спустя были опубликованы независимые результаты из лаборатории Фредерика Тцуи. Оказалось, что GFP принимал нативную конформацию и образовывал флуорофор при комнатной температуре и без добавления каких- либо дополнительных кофакторов, что обеспечило возможность использования белка в качестве маркёра в клетках не только различных систем органов, но и абсолютно в разнообразных организмах. В дальнейшем Роджер Тсиен усовершенствовал этот белок. За работу над флуоресцентным белком Сикомура, Чалфи и Тсиен получили в 2008 году Нобелевскую премию по химии[2].

Работа над флуоресцентными белками продолжилась. Были получены белки, дающие излучение других спектров: красного, желтого, голубого и т. д. В эту работу большой вклад внесла группа выдающихся ученых под руководством Сергея Анатольевича Лукьянова.

Так флуоресцентные белки дали ученым возможность увидеть процессы, протекающие в организме, и даже проконтролировать результаты своих исследований и наблюдений. Это стало доступным благодаря генной инженерии: вставив в определенное место генома ген, кодирующий флуоресцентный белок, исследователь по появлению флуоресценции может определять, когда и как данный участок генома «работает».

Когда в распоряжении исследователя есть несколько разных флуоресцентных белков, их можно внедрить в один организм или в одну клетку и наблюдать одновременно ряд процессов. С помощью такого многоцветного мечения можно сделать так, чтобы ядро клетки, к примеру, светилось зеленым, цитоскелет – синим, митохондии – красным и так далее.

Для наблюдений с использованием GFP и других флуоресцентных белков требуются специальные приборы. В флуоресцентных микроскопах на образец – клеточную культуру или зафиксированный живой организм – направляется поток фотонов, чтобы исследователь мог увидеть явление флуоресценции. Проточный флуориметр освещает образец клеток различными лазерами и подсчитывает число клеток, отреагировавших на то или иное излучение флуоресценцией.

Флуоресцентные белки используют для визуализации активности промоторов. Промоторы – это последовательности нуклеотидов в цепи ДНК, предшествующие основной, кодирующей последовательности гена. По промотору РНК-полимераза «узнает», когда начинать считывание последовательности нуклеотидов для синтеза информационной РНК, а затем – соответствующего белка. Если поставить после нужного промотора ген, кодирующий GFP, то вместо белка, за синтез которого отвечал ген, клетка будет синтезировать GFP. В результате по зеленой флуоресценции исследователь может определить, когда включается данный промотор, в каких условиях, сколько работает и т. д. Поскольку есть промоторы, которые включаются только в конкретных типах клеток, можно наблюдать флуоресценцию лишь клеток данного типа. Можно, допустим, увидеть под микроскопом свечение чувствительных нейронов личинки мухи дрозофилы или стволовые клетки мозга мыши.

С помощью флуоресцентных белков можно изучать и расположение определенных белков в клетке и в организме. Тогда последовательность нуклеотидов, отвечающую за кодирование флуоресцентного белка, вставляют в ДНК вместе с той, которая кодирует белок, интересующий ученого. В результате по флуоресценции возможно определять, какие белки локализуются в ядре, а какие в комплексе Гольджи. Жан Ливе с коллегами в 2007 году предложили даже метод, получивший название Brainbow. Он состоит в том, что в результате определенных манипуляций каждая клетка мозга получает случайный набор флуоресцентных белков. А, как известно, из сочетания трех цветов: красного, зеленого и синего – можно получить любой цвет. В результате нейроны приобретают индивидуальную уникальную окраску, что позволяет увидеть каждый отдельный нейрон мозга мыши

Видеозаписи, полученные на живых организмах с использованием флуоресцентных белков, завораживают и заставляют удивляться. Наблюдению подвергается каждая отдельная клетка в развивающейся личинке дрозофилы. Вспышки свидетельствуют об активности нейронов в мозге малька рыбки Danio rerio, тело которого практически прозрачно, что делает их особенно удобным объектом для исследования с помощью флуоресцентных белков.

Флуоресцентные белки используются и в исследованиях в области фармацевтической химии[3], когда из огромного множества кандидатов подбирается вещество, дающее необходимый эффект, это удобно делать на клеточных культурах, модифицированных так, что эффект сопровождается экспрессией флуоресцентного белка Тогда по наличию и интенсивности свечения можно быстро определить подходящее вещество.

Безусловно, в своей статье мы рассмотрели лишь малую часть возможностей использования флуоресцентных белков. На сегодняшний день это одна из наиболее динамично развивающихся областей молекулярной биологии как фундаментальной науки, с одной стороны, а с другой — как прикладной методологии. Флуоресцентные белки продолжают активно изучаться, благодаря чему они становятся все более совершенными инструментами как для самих исследований, так и для практического использования в биотехнологиях и медицине. Поиск и создание новых интересных форм и разнообразных методов, основанных на использовании флуоресцентных белков, наверняка, приведут к неожиданным долгожданным открытиям.

Список литературы:

1. Ю. А. Лабас, А. В. Гордеева, А. Ф. Фрадков «Флуоресцирующие и цветные белки», журнал «Природа» № 3, 2003 г. (Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований. Проект 02—04—49717)

2. Сайт нобелевской премии. Код доступа: http://nobelprize. org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/

3. Использование зеленого флуоресцентного белка. Интернет ресурс: https://micromed.pro/articles/issledovaniya-s-fluorestcentnim-.html

Код для цитирования: Скопировать