Цели и задачи
Нами была поставлена цель разработать систему детекции патогенных штаммов C. ulceransс применением метода ПЦР в режиме «реального времени». Для этого были поставлены следующие задачи: 1) Провести анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей гена дифтерийного токсина и его регулятора; 2) Провести подбор олигонуклеотидов для их детекции; 3) Оптимизировать программу амплификации фрагментов гена дифтерийного токсина и его регулятора
Материалы и методы
Работа была выполнена в лаборатории молекулярно-генетических исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГАУ им П.А. Столыпина.
В работе были использованы штаммы C. ulcerans, C. ulceranstox. (токсигенный), C. xerosis, C. minutissimum, C. jeikeium, C. diphtheriae, C. diphtheriae tox. (токсигенный)из музея кафедры, олигонуклеотиды DT-f ata-ggg-gcc-cca-cct-tca-g, DT-r tct-tcc-gtt-ccg-act-tgc-tc, toxR-f aga-cga-act-cgg-tgt-ttc-cc, toxR-r gcc-aat-tcg-aat-gtc-tgc-gt. Для амплификации в работе использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с интеркалирующим красителем EvaGreen, Taq–ДНК–полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами» («Синтол», Москва), а также детектирующий амплификатор ДТ-96 («ДНК-Технология», Москва).
Результаты исследований
При помощи ресурса NCBI Blast нами были проанализированы и выровнены нуклеотидные последовательности генов дифтерийного токсина и его регулятора. Затем были разработаны олигонуклеотиды для детекции дифтерийного токсина DT и регулятора toxR. После подбора, выравнивания и оптимизации олигонуклеотидов была оптимизирована программа амплификации для проведения ПЦР в режиме «реального времени»:
95°С – 5 мин. – 1 цикл
95°С – 10 сек.
60°С – 20 сек. – 35 циклов
72°С – 1 мин. – 1 цикл.
После ряда проведенных экспериментов было определено оптимальное количество праймеров в реакциях: 8 пмоль на реакцию объемом 25 мкл – для детекции участка дифтерийного токсина, 10 пмоль – для детекции участка ДНК гена-регулятора экспрессии дифтерийного токсина. Результаты амплификации отражены в таблице 1.
Таблица 1 – Сp Fam при RT-PCR проб с содержанием ДНК
штаммов коринебактерий
Идентификатор |
Сp Fam |
Сp Fam |
DT |
toxR |
|
C. ulcerans C125 |
- |
- |
C. ulcerans tox. 1568 |
24,3 |
18,5 |
C. xerosis 2455 |
- |
- |
C. minutissimum Cm36 |
- |
- |
C. jeikeium 25/14 |
- |
- |
C. diphtheriae 74 |
- |
- |
C. diphtheriae tox. 1981 |
25,2 |
20,6 |
C. ulcerans 2415tox. |
28,6 |
27,3 |
C. ulcerans 2214 tox. |
22,4 |
19,2 |
C. diphtheriae 168 tox. |
26,1 - |
24,5 |
Отрицательный контроль |
- |
- |
Отрицательный контроль |
- |
- |
Выводы
В результате проведенных экспериментов нами были выявлены участки гена дифтерийного токсина у вирулентных штаммов C. ulcerans и C. diphtheriae с использованием разработанной праймерной системы, фланкирующей консервативный участок гена данного токсина. Также в результате проведенных исследований была разработана система праймеров для детекции участка гена-регулятора экспрессии дифтерийного токсина и оптимизирована программа амплификации для прибора ДТ-96 с детекцией в режиме «реального времени». Совместное использование данных систем при детекции штаммов C. ulcerans и C. diphtheriae позволяет определить как специфический участок дифтерийного токсина, так и его регулятор. Также в результате экспериментов установлена аналогия участков отжига разработанных систем праймеров на культурах как C. ulcerans, так и C. diphtheriae, что может свидетельствовать об их гомологичности в структуре оперона дифтерийного токсина.
Библиографический список:
Comparison of phenotypic and genotypic methods for detection of diphtheria toxin among isolates of pathogenic corynebacteria / Efstratiou A., Engler K.H., Dawes C.S., Sesardic D. / J Clin Microbiol. – 1998. – №36(11). – P.3173.
Taylor, D. J. / Diphtheria toxin production by Corynebacterium ulcerans from cats / D. J. Taylor, A. Efstratiou, and W. J. Reilly // – Vet. Rec. – 2002. – V.150. – P.355.
Infection of the skin caused byCorynebacterium ulcerans and mimicking classical cutaneous diphtheria / J. Wagner et al. // – Clin. Infect. – 2001. – №33. – P.1598-1600.