X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

CRISPR/Cas системы представляют собой особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены спейсерами, они выполняют функцию адаптивного иммунитета бактерий и архей.

Все известные системы CRISPR-Cas можно подразделить на два основных класса, 5 типов и 16 подтипов на основании наличия или отсутствия определённых генов, строения оперона, аминокислотных последовательностей белков Cas и механизмов, обеспечивающих работу CRISPR-опосредованного иммунитета [1].

Осенью 2015 года группой исследователей из лаборатории FengZhang была продемонстрирована возможность использовать нуклеазу Cpf1, соседа Cas9 по классу (тип V), для осуществления редактирования ДНК. Для функционирования CRISPRCpf1 необходима только 1 молекула гидовой РНК (гРНК), в отличие от CRISPRCas9, в составе которой должны существовать 2 молекулы. Для распознавания целевого участка ДНК в его составе должны быть PAM последовательности (ProtospacerAdjacentMotif), которые определяют место взаимодействия ДНК и редактирующей системы. Cpf1 использует иные PAM последовательности, а также может произвести разрез на большем расстоянии от PAM, что расширяет возможности взаимодействия с различными участками ДНК. Кроме этого, при разрезании Cpf1 участка ДНК, возникают выступающие 5′-концы, которые, в отличие от тупых концов, формирующихся при действии Cas9, позволяют произвести более эффективную достройку нового участка. [2]

	CRISPRCas9	CRISPRCpf1
Структура	2 РНК (crRNA+tracrRNA=gRNA)	1 РНК (crRNA)
Тип разреза	Острые концы	Тупые концы (выступающие)
PAM	NGG	TTN

Другая потенциально полезная особенность Cpf1 заключается в том, что Cpf1 разрезает таргетную ДНК с дистального конца протоспейсера, вдали от затравочного региона (seed-регион), что может способствовать внесению новых последовательностей ДНК: Cpf1-индуцируемые инсерционно-делеционные мутации будут расположены далеко от таргетного сайта, который таким образом сохранится для последующих этапов Cpf1 разрезания. С Cas9 любые инсерционно-делеционные мутации, возникающие вследствие доминантного пути репарации с помощью негомологичного соединения концов, будут разрушать таргетный сайт, эффективно устраняя возможность вставки новой ДНК в конкретном сайте в этой конкретной клетке. В случае Cpf1 кажется возможной такая ситуация: если первый цикл таргетинга заканчивается инсерционно-делеционной мутацией, то следующий уровень таргетинга может быть исправлен с помощью гомологической репарации. Ожидается, что дальнейшие исследования этой и других стратегий использования Cpf1, и других эффекторов класса 2, помогут найти решения для некоторых трудностей редактирования генома.

В мае 2016 была представлена новая система для геномного редактирования, построенная по аналогичному CRISPRCas9 принципу гид-нуклеаза. Несмотря на общий принцип работы, NgAgo-gDNA имеет ряд значительных отличий. В основе системы – белок Argonaute, выделенный из Natronobacteriumgregoryi, который, как и Cas9, участвует в механизме защиты от чужеродных ДНК у бактерий. Второй элемент – одноцепочечнаягидовая ДНК (оцДНК), что также рознит эту систему с CRISPRCas, где гидом является РНК. Эта ДНК может состоять из 24 нуклеотидов, в отличии от CRISPR-РНК, лимит которой составляет 20 нуклеотидов, для функционирования системы требуется 5’ фосфорилированнаяоцДНК, крайне редко встречающаяся в клетках человека, к тому же свойством нуклеазы NgAgo является феномен, обозначенный в зарубежной литературе как «преданность одному гиду». Внедрение гДНК возможно только в период, когда в клетке происходит синтез этой нуклеазы, поэтому вероятность нецелевого действия посредством аналогичных присутствующих молекул практически исключена.

Еще одним плюсом является высокая чувствительность к замене даже одного нуклеотида в гидовой последовательности, так как нежелательная нуклеотидная замена может привести к нецелевому разрезу. Экспериментально показано снижение эффективности разрезания участка целевой молекулы до 85%-100% при замене одного нуклеотида.

ФенгГао с коллегами провели сравнительный анализ эффективности двух систем на гене DYRK1A, количество разрезов, осуществленных CRISPRCas9 и NgAgo-gDNA оказалось практически одинаковым (31.97% для NgAgo и 32.2% для Cas9). Тем не менее в участках генов HBA2 и GATA4, c часто встречающимися нуклеотидами гуанином и цитозином, новая система показала себя более эффективной.

На клетках HEK293T успешно протестировано редактирование ДНК с использованием донорского участка, NgAgo-gDNA показала свою эффективность в восстановлении целостности ДНК посредством механизмов гомологичной репарации. Оценка работоспособности системы на клетках линии HeLa, рака груди MCF7, а также миелоидных клетках человека К562 показала наличие вставок-делеций в гене DYRK1A (последствие разрыва цепи ДНК под действием нуклеазы) в 11,2%, 13,7% и 24,8% случаев соответственно, что говорит о работоспособности системы при применении в различных культурах клеток.

Вывод

Естественное разнообразие систем CRISPR открывает массу возможностей для понимания происхождения и эволюции приобретенного иммунитета прокариот, а также для использования биотехнологических инструментов, способных изменяться. Нет никакого сомнения, что вне уже классифицированного и охарактеризованного разнообразия типов CRISPR/Cas есть другие системы со своими особенностями; эти системы ждут своего открытия и в дальнейшем помогут наращивать темпы редактирования генома, развивать иные области биотехнологии, а также прольют свет на эволюцию этих защитных систем.

Литература

Barrangou R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines // Genome Biology. — 2015. — Глава. 16. — Стр. 247—257.

David Cyranoski. Chinese scientists to pioneer first human CRISPR trial, http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302

Zetsche B., Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 2015; 163(3), 759 – 71

Gao F., Shen X.Z., Jiang F et al. DNA-guided genome editing using the NatronobacteriumgregoryiArgonaute.Nature Biotechnology. 2016; 34: 768–773

Karen L. Maxwell. (2017). The Anti-CRISPR Story: A Battle for Survival. MolecularCell. 68, 8-14.

https://biomolecula.ru/articles/anti-crispr-otvet-virusov

Код для цитирования: Скопировать