X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Резюме. Поверхность остается одним из самых интересных объектов живой и неживой природы. Функционализированные коллоидные частицы диоксида кремния играют большую роль в современной науке и различных отраслях промышленности. Поверхностно-модифицированные материалы широко используются в качестве неподвижных фаз в хроматографии, биологических и медицинских препаратов химических катализаторов и т.д. [1].

Одним из наиболее перспективных направлений в создании привитых слоев на твердой поверхности частиц является метод поверхностной сборки. Не все классы органических веществ могут быть привиты в одну стадию. В первую очередь, это связано с невозможностью прививки соединений, функциональные группы которых несовместимы в одной молекуле с якорными или сами обладают якорными свойствами, также для некоторых соединений сложно подобрать растворитель, в котором будет происходить модифицирование твердой поверхности.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в области разработки технологий иммобилизованных ферментных препаратов. Иммобилизованные ферменты внедряются в медицину, пищевую и фармацевтическую промышленности [2]. Химическая иммобилизация ферментов в целом является искусством, уровень которого определяется умением экспериментатора. Поэтому нельзя выделить конкретную практическую методику при химической иммобилизации ферментов [3].

Целью в настоящей работе является изучение процесса сорбции пепсина на аминированных частицах диоксида кремния со средним размером 160 нм. Экспериментальные методы, используемые в данной работе: микроэлектрофорез с определением дзета-потенциала, определение количества пепсина методом УФ-спектроскопии.

Реагенты и растворители

В работе использовались следующие реагенты и растворители: этиловый спирт (Вектон, чистота 98%), тетраэтоксисилан (TEOS) (Acros, чистота 98%), 3-аминопропилтриэтоксисилан (АПТЭС) (Acros, чистота 98%), водный раствор аммиака (25%,Вектон, чистота ч.д.а.), пепсин (Вектон).

Оборудование, используемое в работе

Распределение частиц по размерам проводили методом динамического лазерного светорассеяния с использованием прибора Malvern Zetasizer Nano S.

Изменение ζ – потенциала золей контролировали с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano Z.

Определение остаточного пепсина после сорбции проводилось методом УФ-спектроскопии на спектрофотометре Varian Cary 5000:

Синтез наночастиц диоксида кремния по методу ШтобераФинкаБона

Наночастицы диоксида кремния получали методом ШтобераФинкаБона. В колбе на 1 литр охлаждали 500 мл этилового спирта до 20C, добавляли 15 мл водного раствора аммиака, который является катализатором формирования сферических частиц, и 30 мл тетраэтоксисилана. Реакционную смесь оставляли на 5 часов для синтеза частиц.

Для измерения характеристик частиц (значение ζ-потенциала, размер) очищали золь от аммиака (промывали и центрифугировали), так как при титровании соляной кислотой в присутствие NH₃ образуется нерастворимое соединение NH₄Cl, которое создает определенную погрешность при измерениях.

Средний размер частиц составил 160 нм. График распределения размера частиц по объему представлена на рисунке 1.

 

Рис. 1. График распределения размера немодифицированных частиц по объему

 

Модификация наночастиц диоксида кремния 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС)

В качестве модифицирующего соединения на первом этапе был выбран 3-аминопропилтриэтоксисилан (АПТЭС). Выбор в качестве модификатора 3-аминопропилтриэтоксисилана обусловлен наличием аминогрупп в составе его молекулы, которые могут легко протонироваться, изменяя заряд поверхности кремнезема.

Расчет количества АПТЭС производили исходя из предположения, что одна -OH-группа взаимодействует с одной молекулой модификатора. В силу того, что молекула модификатора содержит три якорные группировки, возможность взаимодействия по оставшимся якорным группам была учтена и признана стерически маловероятной ввиду расположения -OH-групп на поверхности SiO₂ ( 4,8 OH-групп/нм² [1]). Исходя из удельной площади поверхности частиц дисперсной фазы, рассчитали максимально возможные количества модификатора для одной частицы. Расчет также показал, что для частиц размером 160 нм на 50 мл количество АПТЭС составляет 9,2  10^-5 моль. На рисунке 2 представлена простейшая схема взаимодействия гидроксилированной поверхности наночастиц диоксида кремния с молекулой модификатора.

 

Рис. 2. Механизм взаимодействия поверхности наночастиц диоксида кремния с молекулой АПТЭС

 

Химическая модификация поверхности наночастиц АПТЭС проводилась 4 часа (исходя из работы [4], при времени модификации 4 часа получается предельно «аминированная» поверхность частиц), при температуре 60 C, медленном перемешивании реакционной смеси и в присутствии NH₃.

После синтеза трехкратно промывали и центрифугировали частицы SiO₂ водой от избытка прекурсоров и модификаторов и переводили их в воду для дальнейших определений характеристик (размер, ζ-потенциал).

Измерение -потенциаланемодифицированных и аминированных частиц

Полученные дисперсии были охарактеризованы по изменению ζ-потенциала и положению pH изоэлектрической точки (pH_ИЭТ). На рисунке 3 представлен график зависимости дзета-потенциала от pH дисперсий.

 

Рис. 3. График зависимости дзета-потенциала от pH дисперсий модифицированных и немодифицированных частиц

 

pH_ИЭТ модифицированных частиц составляет 5,76; немодифицированных частиц  2,5. Сдвиг pH_ИЭТ вызван специфической сорбцией модификатора, содержащего аминогруппы. pH_ИЭТ равна 3,26. Таким образом, поверхностные силанольные группы замещаются аминогруппами, способными в кислой среде протонироваться с образованием катиона.

Иммобилизация пепсина на аминированном кремнеземе

Выбор пепсина в качестве иммобилизирующего соединения обусловлен тем, что он, с одной стороны, является активным ферментом, используется в различных отраслях хозяйства [5]; с другой стороны, пепсин, как и другие белки, содержит в своей молекуле различные функциональные группы (-NH₂, -COOH), способные взаимодействовать с твердой поверхностью [6].

Для подбора оптимального времени иммобилизации фермента, мы исследовали кинетику сорбции пепсина. С этой целью приготовили растворы пепсина с концентрацией 2 г/л, смешивали золь с раствором пепсина в соотношении 1:1. Временные промежутки синтеза составили: 1, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 и 72 часов. По завершению процессов сорбции пепсина дисперсионная фаза отделялась от дисперсной среды. Центрифугат (надосадочная жидкость) исследовался на количество иммобилизованного пепсина.

Кинетика сорбции пепсина исследовалась тремя методами: по сдвигу pH_ИЭТ в зависимости от времени синтеза, определение сорбционных слоев методом окситермографии, определение остаточного пепсина методом УФ-спекроскопии (анализ надосадочной жидкости).

Измерение электроповерхностных свойств аминированных частиц в комплексе с пепсином

Для исследования кинетики сорбции пепсина на аминированной поверхности частиц SiO₂ дисперсии с различным временем модификации исследовались на сдвиг pH_ИЭТ.

На рисунке 4 представлены графики зависимости дзета-потенциала от pH дисперсии модифицированных частиц.

 

Рис. 4. Графики зависимости дзета-потенциала от pH аминированного кремнезема и в комплексе с иммобилизованным пепсином при времени модификации 8 часов

 

График 4 свидетельствует о сорбции катионной формы пепсина, поскольку кривая SiO₂-АПС-пепсин сдвигается в основную область. В ходе работы установлено, что начиная с времени модификации 6 часов pH_ИЭТ практически не изменяется. Однако, как показано в таблице 1, максимальный сдвиг pH_ИЭТ наблюдается при времени синтеза 8 часов.

В таблице 1 отображена зависимость pH_ИЭТ от времени сорбции пепсина. В ходе работы установлено, что начиная с времени модификации 6 часов pH_ИЭТ практически не изменяется. Дальнейшее изменение возле положения равновесия свидетельствует о динамическом характере сорбционных процессов. Однако, как показано в таблице 1, максимальный первоначальный сдвиг pH_ИЭТ наблюдается при времени синтеза 8 часов, что свидетельствует о максимальном заполнении сорбционного слоя.

Таблица 1. Значения рН_ИЭТ и соответствующие им времена сорбции пепсина на аминированных наночастицах

Время сорбции, ч	pH(ИЭТ)
0*	5,76
1	7,33
3	7,37
4	7,45
6	7,56
8	7,6
12	7,52
24	7,51
72	7,62

* — аминированные частицы

Из рисунка 5 видно, что максимальный сдвиг pH_ИЭТ наблюдается при временем сорбции пепсина 8 часов

 

Рис. 5. График зависимости pH_ИЭТ от времени модификации пепсином

 

Таким образом, время, при котором pH_ИЭТ практически перестает изменяться, является временем окончательной модификации (8 часов).

УФ-спектроскопия для контроля сорбции пепсина на аминированном SiO₂

Характерными для нуклеиновых кислот полосами поглощения в УФ - области спектра являются полосы с _max (длина волны, при которой наблюдается максимальное поглощение энергии света) при 200—290 нм. Спектры поглощения однокомпонентных неокрашенных белков (сывороточный и яичный альбумины, гамма-глобулин, трипсин, пепсин и др.) так же располагаются в области от 200—290 нм, включая две полосы поглощения: одну с _max ~220 нм, вторую с _max ~ 278 нм. Полоса поглощения с _max = 275 нм обусловлена поглощением энергии света электронами ароматических аминокислот (триптофан, тирозин, фенилаланин) [7].

Были сняты УФ-спектры поглощения пепсина различной концентрации при длине волны 275 нм. Готовили растворы пепсина с различными концентрациями (0,05; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2 г/л) и построили градуировочный график. В таблице 2 представлены значения оптических плотностей и соответствующие им концентрации.

Таблица 2. Значения оптических плотностей пепсина

Оптическая плотность	С, г/л
0,0015	0,05
0,0043	0,1
0,0160	0,5
0,0277	1
0,0419	1,5
0,0593	2

На основании экспериментальных данных был построен градуировочный график по пепсину, который дает возможность количественного определения пепсина в растворе после сорбции. Построенный градуировочный график соответствует данным, представленным в работе [8].

 

Рис. 6. Градуировочный график по пепсину

 

Определение остаточного пепсина после сорбции проводилось методом УФ-спектроскопии. Для этого реакционная смесь белка и аминированного кремнезема после сорбции подвергалась центрифугированию на центрифуге в течение 15 минут при скорости 13000 об./мин. Максимум поглощения также наблюдался при _max = 275 нм. Наименьшая оптическая плотность свидетельствует о том, большее количество белка перешло в сорбционные слои аминокремнезема.

Результаты представлены в таблице 3 и на графике 7 зависимости оптическая плотность-время сорбции.

Таблица 3. Значения оптических плотностей пепсина после сорбции

Время синтеза, ч	Оптическая плотность
1	0,084
3	0,1309
4	0,1139
6	0,1075
8	0,0628
12	0,0912
24	0,1074
48	0,0774
72	0,0569

 

Рис. 7. График зависимости оптическая плотность-время сорбции пепсина

 

Метод УФ-спектроскопии также подтвердил, что наибольшее количество пепсина адсорбируется за 8 часов. Этот факт подтверждается значениями оптических плотностей — при данных промежутках синтеза оптические плотности минимальные.

Выводы

В данной работе получены частицы кремнезема модифицированные 3-аминопроплтриэтоксисиланом и пепсином;

На основании методов динамического светорассеяния и микроэлектрофореза, УФ-спектроскопии исследована кинетика сорбции пепсина на аминированных частицах кремнезема;

Данные, полученные различными методами, довольно точно согласуются между собой;

На основании проведенной экспериментальной работы установлено оптимальное время сорбции пепсина на аминированных частицах — 8 часов.

Список литературы

Лисичкин Г.В. Химия привитых поверхностных соединений. М.: Физико-математическая литература, 2003. 592 с.

Л. С. Солдатова, О. О. Бабич, А. Ю. Просеков. Нанокомпозитный материал для иммобилизации ферментов в молочной промышленности // Переработка молока. 2010. № 10, с. 56.

Березин И.В., Клячко Н.Л. Биотехнология. Иммобилизованные ферменты. М.: «Высшая школа», 1987. 159 с.

Пискунова В.С. Бакалаврская работа // Университет «Дубна», Дубна. 2016.

Коротько Г.Ф. Организация желудочного пищеварения // Вестник хирургической гастроэнтерологии. – 2006. – № 1. – с. 17–25.

Фёртш Э. Структура и механизм действия ферментов. Пер. с англ. М.: «Мир», 1980. —с. 383;

Абрамова З.И. Исследование белков и нуклеиновых кислот. Учебное пособие. Казань — 2006;

Т.Э. Липатова, С.М. Лоос. Взаимодействие полиэфируретанов с физиологически активными средами // Высокомолекулярные соединения. Том (А) ХII, № 9, 1970, с. 2051-2056

Код для цитирования: Скопировать