X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Культуры клеток на микроносителях (МН) оказались весьма перспективными при производстве вирусных вакцин, а также других продуктов клеточного и вирусного происхождения. Этот метод широко применяют в биологической промышленности многие высокоразвитые страны. Культуры различных клеток на микроносителе оказались достаточно эффективными для выращивания многих опасных вирусов человека и животных [1].

В 1967 г. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160-230 мм может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до 50 см²/мл [2].

Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к поверхности частиц МН и, размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной частице.

Основными преимуществами этого метода являются:

создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р02 и др.);

получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл;

культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток;

введение постоянного контроля за динамикой роста клеток;

снижение роста контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культурального сосуда;

значительная экономия питательных сред;

возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах;

возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками;

возможность пассирования культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций микроносителя [2].

Микроносители должны иметь:

• небольшой положительный заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г. В связи с тем, что большинство клеток животных имеют слабо отрицательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН;

• плотность 1,05-1,15 г/см; указанная плотность является оптимальной для поддержания МН во взвешенном состоянии;

• диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади для роста нескольких сотен клеток;

• гладкую поверхность;

• прозрачность;

• отсутствие токсичности компонентов для клеток;

• незначительное впитывание компонентов среды;

• универсальность, обеспечивающую возможность использования их для первичных, диплоидных и гетероплоидных клеток. Немаловажное значение имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.

Проведено исследование многих гранулированных препаратов различной химической природы, в том числе из поперечно-сшитого (ПС) декстрана, ПС-агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, пористого селикагеля, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью использования их как микроносителей.

Пригодными являются только некоторые из них, главным образом имеющие в своей основе ПС-декстран.

Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты микроносителей, готовые к употреблению: Цитодекс-1, 2, 3 (Франция, Швеция), Супербит (США, Англия), Биосилон (Дания). Стоимость перечисленных препаратов довольно высока, поэтому необходимо проводить исследования по разработке и производству отечественных МН [2].

Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не должно быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.

Для контроля за окружающими культуру условиями такими, как рН и кислород, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания суспензии с носителем должна быть 40-60 об/мин. Для выращивания на МН применяются различные типы клеток.

Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мг/мл. Однако, при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конечную концентрацию цитодекса, не превышающую 1 мг/мл. Повышение концентрации до 3 мг/мл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью перфузии питательной среды и частичной ее замены, что осложняет технологический процесс.

Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные параметры для пролиферации и максимального накопления клеток. Показано, что посев 10 клеток/мл перевиваемой линии почек обезьян (Vero) и диплоидных клеток фибробластов эмбриона человека (MRC-5) в уменьшенном до 1/3 объема питательной среды и при периодическом включении мешалки (30 об/мин) на одну минуту через каждый час в течение 4 часов, с последующим добавлением питательной среды до конечного объема, ведет к увеличению пролиферации клеток и их количества по сравнению с контролем (полный объем питательной среды в момент посадки клеток и непрерывная работа мешалки с начала культивирования) [2].

Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная среда. Правильный подбор питательной среды также будет способствовать оптимизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ (посадочная концентрация клеток 105 мл) но сравнению со средой ВМЕ и 199. Если же количество клеток при посадке снизить до 104, то лучшие результаты дает среда 199. Все испытуемые среды содержали 10% фетальной сыворотки [2].

Библиографический список

Культуры клеток на микроносителях. Применение культуры клеток на микроносителях в вирусологии [Электронный ресурс]: Режим доступа: http://meduniver.com/Medical/Microbiology/919.html Дата обращения: 15.12.2017

Культивирование клеток на микроносителях [Электронный ресурс]: Режим доступа: https://studfiles.net/preview/5164260/page:6/ Дата обращения: 15.12.2017

Код для цитирования: Скопировать