X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Белки или протеины – это высокомолекулярные органические соединения, которые входят в состав всех животных и растительных организмов и составляют продукты их жизнедеятельности. Протеин состоит из остатков α-аминокислот. Различный аминокислотный состав влияет на структуру белка, выполняемые ими свойства, способность к набуханию, гидратации. Аминокислотный состав белков определяется сложными физико-химическими методами: капиллярным электрофорезом, бумажной, тонкослойной, ионообменной хромотографией, УФ-спектрофотометрией, ИК-спектроскопией, электронной микроскопией, термогравиметрией. Содержание и структура белков в биожидкостях относятся к значимому диагностическому критерию. Разработка простых, экспрессных методов определения белков и ориентировочно аминокислотного скора является важной аналитической задачей. Известно применения пьезокварцевого микровзвешивания для изучения развития микроорганизмов (бактерий, грибов) во времени в процессе их жизнедеятельности, старения тонких пленок [1]. Из-за высокой чувствительности по массе современных пьезовесов (10^-16 г) и малого объема растворов, достаточного для анализа (1-10 мкл), возможно положительно оценить применение пьезокварцевого микровзвешивания для изучения дегидратации растворов высокомолекулярных соединений, в том числе природных.

Цель работы оценить возможность применения пьезокварцевых микровесов для изучения дегидратации растворов различных белков при комнатной температуре.

В качестве объектов исследования выбраны дистиллированная вода и яичный белок: куриный и перепелиный белок в нативном состоянии, яичный сухой протеин. Яичный белок на 90 % состоит из воды и на 10 % – из белков. Яичный и перепелиный белок находятся в нативном состоянии (третичная структура, глобула), на поверхности молекул расположены остатки аминокислотных радикалов. Углеводородные радикалы, которые являются гидрофобными, расположены внутри молекул. Яичный сухой белок по своему составу является стандартным порошковым протеином, который состоит из натурального яичного порошка, витаминов, аминокислот, минералов и подсластителей.

Исследования растворов различных белков проводили методом абсолютного взвешивания, путем самопроизвольного испарения свободной воды из раствора белка V = 1 мкл при t = 23 ± 1 ^оС и регистрации изменения массы с шагом в 1 сек.

В отличие от термогравиметрии метод позволяет провести дифференцированное исследование в каждой точке испарения воды при комнатной температуре. Оценивали возможность установления отличий в количестве слабо-связанной воды в стандартных растворах белков равной концентрации. Количество (масса) связанной воды определяется аминокислотным составом, наличием полярных групп и структурой белка, которое будет отличаться для нативного белка и высушенных белковых препаратов. Готовили серию растворов каждого белка различной концентрации (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5,0 г/л). Подготовка растворов протеина для исследования заключалась в фильтровании через бумажный фильтр «Синяя лента».

В качестве чувствительных микровесов использовали пьезорезонаторы ОАВ-типа с базовой частотой 10,0 МГц на длинных ножках и серебряными электродами диаметром 5 мм. В восьмиканальные нановесы «NanoWeight» (производство ООО «СНТ», Россия), подключённые с компьютером и ПО, помещали пьезорезонаторы. Фиксировали в программном обеспечении их исходную частоту колебаний. На одну (верхнюю) сторону серебряных электродов наносили микрошприцем по 1 мкл растворов анализируемого белка без взвесей и высушивали при комнатной температуре 23 ± 1 ^оС, чтобы избежать денатурации белка, в течение τ = 1300 сек. Снимали кинетическую кривую свободного испарения воды в режиме реального времени. Анализ заканчивали, когда колебания частоты пьезорезонатора не превышала ± 1 Гц/сек. Число повторений n = 3. После измерения проводили удаление остатка с поверхности электрода вымачиванием в воде и, если требовалось, легкой механической очисткой, далее прогревали очищенный резонатор. Полноту удаления остатка контролировали по восстановлению исходной частоты колебаний F₀. Изменение частоты колебаний пьезорезонаторов ОАВ–типа связана с изменением массы вещества (раствора) на электроде прямо пропорционально и описывается уравнением Зауэрбрея [1]:

,

где Δm_i – масса вещества на электроде в момент времени τ, мкг; ΔF_i – изменение колебаний кварцевой пластины в момент времени τ от начала сушки, Гц; F₀ - собственная частота вибрации чистого кварца, Гц; S - площадь электродов резонатора, см²

В идентичных условиях были получены интегральные и дифференциальные кривые дегидратации для стандартных растворов белка и дистиллированной воды. Для дистиллированной воды на дифференциальной кривой сушки пика не обнаружено, в отличие от растворов белков, что свидетельствует о связи его появления с дегидратацией белка (рис. 1).

Рассчитаны площади пиков на дифференциальных кривых высушивания (ΔF/Δτ = f(τ)) для растворов белков разной концентрации. Получены линейные зависимости площади пиков от концентрации растворов белков в интервале концентраций от 0 до 1 г/л, которые описываются уравнениями:

- для перепелиного белка S_переп = 313,03·с(R² = 0,90);

- для куриного белка S_кур = 294,55·с(R² = 0,99);

- для яичного сухого белка S_сух= 49,07·с(R² = 0,99).

Рисунок 1 – Дифференциальная кривая высушивания а) дистиллированной воды, б) яичного сухого протеина (с = 1 г/л).

Установлено, что тангенс угла наклона линейных участков кривых зависимости площади пика на дифференциальной кривой сушки раствора от концентрации белка различен. Для растворов перепелиного белка он максимален, а для растворов яичного сухого – минимален. Что связано с сильно различающейся доле слабо-связанной воды в гидратный оболочке белка нативного и предварительно высушенного и повторно растворенного. Хорошо растворимая форма протеинов максимально удерживает воду, в отличие от куриного и перепелиного нативного белков.

По теоретическим сведениям о химическом строении выбранных нативных белков установлено, что состав куриного и перепелиного протеина по аминокислотному составу не отличается. Но у перепелиного белка количественное содержание аминокислот выше, по сравнению с куриным. Поэтому на поверхности перепелиного протеина больше ионизированных групп, которые притягивают диполи воды и образуют большую гидратную оболочку. В отличие от нативных белков, молекула сухого яичного протеина развернута (не в глобуле) и на ней расположены гидрофобные радикалы. Поэтому на поверхности сухого яичного протеина мало ионизированных групп. Таким образом, у перепелиного белка слабо-связанная гидратная оболочка будет больше, чем у куриного, а у сухого яичного эта оболочка минимальная. Поэтому считаем, что по тангенсу угла наклона линейной части зависимости площади дифференциальных кривых от концентрации белка можно оценить различия в гидрофильных свойствах: чем больше угловой коэффициент, тем больше гидрофильных групп содержит белок.

Высота пика в дифференциальных кривых пропорциональна скорости реакции дегидратации белка.

Для оценки порядка и константы скорости дегидратации растворов белка изучены зависимости высоты пика дифференциальных кривых от концентрации белка в логарифмических координатах. Согласно полученным данным, реакция дегидратации белков имеет нулевой порядок и скорость дегидратации сухого яичного протеина имеет наибольшее значение, а перепелиного – наименьшее. Это может объясняться различием в величине гидратной оболочки. Чем больше гидратная оболочка, тем быстрее идёт реакция дегидратации слабо-связанной воды.

Применение пьезокварцевых микровесов позволяет определить гидрофильные свойства молекулы белка, оценить порядок и скорость реакции не изменяя условия проведения реакции без дорогостоящего оборудования при любых температурах термической устойчивости системы (от 0 до 60 ^оС).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Кучменко, Т. А. Применение методов пьезокварцевого микровзвешивания в аналитической химии [Текст] / Т. А. Кучменко. – Воронеж: Воронеж. гос. технол. акад., 2001. – 280 с.

Код для цитирования: Скопировать