X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

В работах, посвященных проблемам загрязнения окружающей среды, на сегодняшний день к тяжелым металлам относят более 40 металлов периодической системы Д.И. Менделеева с атомной массой свыше 50 атомных единиц. По классификации Н.Реймерса, тяжелыми следует считать металлы с плотностью более 8 г/см³ [1-3].

Тяжелые металлы обладают высокой способностью к многообразным химическим, физико-химическим и биологическим реакциям. Часть органических соединений, с которыми связываются металлы, представлена продуктами микробиологической деятельности. Ртуть и другие металлы характеризуется способностью аккумулироваться в звеньях «пищевой цепи». Микроорганизмы почвы могут давать устойчивые к металлам популяции. [4,5].

На основании вышеизложенных данных перед нами была поставлена следующая цель: изучить влияние катионов тяжелых металлов на представителей факультативно-анаэробной кишечной нормофлоры крыс в условиях invitro.

Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:

определить видовой состав микрофлоры лабораторных крыс;

определить минимальные подавляющие концентрации тяжелых металлов на рост и изучить их влияние на динамику роста микроорганизмов, входящих в состав нормофлоры кишечника лабораторных животных

В качестве материалов выступала факультативно-анаэробная нормофлора лабораторных крыс: E. faecalis, E. cloacae, E. coli, L. acidophilus. В качестве источника катионов тяжелых металлов использовались соли с высоким уровнем диссоциации в водных растворах: FeSO₄ – сульфат железа, ZnSO₄ – сульфат цинка, Pb(NO₃₎₂ – нитрат свинца, CdSO₄×8H₂O – восьмиводный сульфат кадмия, CuSO₄×5H₂O – пятиводный сульфат меди.

Для определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) тяжелых металлов мы использовали метод последовательных разведений, что позволило нам получить различные концентрации начального 0,02 М/л раствора солей исследуемых металлов.

Получение ряда разведений растворов тяжелых металлов (таблица 1), было необходимо с целью определения ингибирующих и субингибирующих концентраций, в отношении исследуемых микроорганизм, а также концентраций, которые не оказывают влияния на рост популяции. Это позволило создать оптимальные условия для культивирования исследуемых микроорганизмов в присутствии солей тяжелых металлов.

Из таблицы 1 следует, что концентрации солей свинца расположенные в анализируемом диапазоне до концентрации 0,005 М/л оказывали бактерицидный эффект на E. coli иE. faecalis. Такой же эффект оказывали концентрации солей железа, меди и цинка расположенные в анализируемом диапазоне до концентрации 0,0025 М/л (в случаеE. faecalis до концентрации 0,0025, 0,0003 и 0,0006 М/л соответственно), концентрации кадмия до концентрации 0,0003 М/л (в случаеE. faecalis до 0,00001 М/л).

Таблица 1 – Минимальные подавляющие концентрации тяжелых металлов, влияющие на рост исследуемых микроорганизмов

В молях на литр

Штамм	Соли металлов	Концентрация
		0,02	0,01	0,005	0,0025	0,00125	0,000625	0,0003	0,0001
E.coli	FeSO4·H2O	-	-	-	±	+	+	+	+
	ZnSO4	-	-	-	±	+	+	+	+
	Pb(NO3)2	-	-	±	+	+	+	+	+
	CdSO4·8H2O	-	-	-	-	-	-	±	+
	CuSO4·5H2O	-	-	-	±	+	+	+	+
E.faecalis	FeSO4·H2O	-	-	-	±	+	+	+	+
	ZnSO4	-	-	-	-	-	±	+	+
	Pb(NO3)2	-	-	±	+	+	+	+	+
	CdSO4·8H2O	-	-	-	-	-	-	-	-
	CuSO4·5H2O	-	-	-	-	-	-	±	+
E. cloacae	FeSO4·H2O	-	-	±	+	+	+	+	+
	ZnSO4	-	-	-	-	±	+	+	+
	Pb(NO3)2	-	-	±	+	+	+	+	+
	CdSO4·8H2O	-	-	-	-	-	-	+	+
	CuSO4·5H2O	-	-	-	-	±	+	+	+
L. acidophilus	FeSO4·H2O	-	-	-	±	+	+	+	+
	ZnSO4	-	-	-	-	±	+	+	+
	Pb(NO3)2	-	-	-	±	+	+	+	+
	CdSO4·8H2O	-	-	-	-	-	-	±	+
	CuSO4·5H2O	-	-	-	-	-	-	±	+
«–» – ингибирующие концентрации «±» – субингибирующие концентрации «+» – концентрации не оказывающие ингибирующего действия на рост популяции

Так же представленные данные следуют, что бактерицидный эффект на L. acidophilus оказывали концентрации солей железа и свинца, расположенные в диапазоне до концентрации 0,0025 М/л. Концентрации солей цинка оказывали бактерицидный эффект на L. acidophilus до концентрации 0,00125 М/л, концентрации солей меди и кадмия до 0,0003 М/л. Концентрации находящиеся ниже перечисленных значений не оказывали негативного влияния на рост популяции данного микроорганизма.

Бактерицидный эффект на E. cloacea оказывали концентрации солей железа и свинца, расположенные в диапазоне до 0,005 М/л. Концентрации солей цинка и меди оказывали бактерицидный эффект до 0,00125 М/л, концентрации солей кадмия до концентрации 0,0003 М/л. При меньших концентрациях наблюдался обильный рост данной культуры.

Концентрации солей металлов, располагающиеся между бактерицидными и концентрациями при которых наблюдался рост исследуемых микроорганизмов, являлись бактериостатическими или оказывали субингибирующее действие. Определение данных концентраций позволяло судить о степени биотоксичности катионов исследуемых металлов.

Обобщая и интерпретируя полученные данные можно констатировать, что из всех исследуемых микроорганизмов наиболее чувствительным штаммом по отношению ко всем используемым металлам является L. acidophilus. Металлами, проявляющими наименьшую токсичность в отношении E.coliявлялись железо, цинк, свинец и медь, в отношенииE. faecium, E. cloaceae и L. acidophilus только свинец и железо. Наиболее токсичным металлом в отношении исследуемых микроорганизмов является кадмий.

Процесс аккумуляции катионов металлов бактериальными штаммами происходит в стационарной фазе роста. Данный процесс связан с тем, что в данной фазе происходит истощение субстрата и аккумуляция токсичных продуктов, что в свою очередь вынуждает микроорганизмы к поиску других источников энергии, а так же детоксикации среды обитания. На основании изложенного следующим этапом нашей работы являлось изучение роста популяций, с целью выявления оптимального времени роста в периодической культуре, и оценка влияние катионов тяжелых металлов на динамику роста исследуемых микроорганизмов.

Определение оптимального времени роста на периодической культуре осуществлялось путем культивирования исследуемых штаммов в периодической культуре на жидкой питательной среде с измерением оптической плотности каждые 3 часа. Измерения велись до получения не менее трех одинаковых значений оптической плотности, что свидетельствовало о наступлении стационарной фазы роста. По полученным результатам для каждого штамма были выстроены кривые роста.

Исходя из полученных данных следует, что лаг-фазаE. coli (рисунок 1) длилась около 3 часов, E. faecium 9 часов, а у L. acidophilus – 12 часов. Продолжительность эспоненциальной фазы роста составляла для E. coliи E.faecalis6 часов, для L. acidophilus 12 часов. Время наступления стационарной фазы происходило у E.coliчерез 24 часа культивирования, у E. faecium через 27 часов, у L. acidophilus через 36 часов.

Изучение влияния солей тяжелых металлов на динамику роста исследуемых бактерий проводилось аналогично, для этого в среду культивирования вносилась рабочая концентрация исследуемого металла и осуществлялось культивирование до наступления стационарной фазы роста.

Анализ полученных данных свидетельствует, что влияние солей тяжелых металлов на время наступление и продолжительность фаз роста неоднозначно, при этом стимулирующее действие на рост E.coliоказывали ионы свинца и железа (рисунок 1). При этом продолжительность лаг-фазы составляла 2 часа, экспоненциальной фазы – 13 часов, фазы замедленного роста – 3 часа. Стационарная фаза наступала через 18 часов культивирования.

Рисунок 1 - Влияние катионов солей тяжелых металлов на рост E.coli

Обобщая полученные данные можно констатировать, что наиболее чувствительным представителем нормофлоры кишечника по отношению ко всем используемым металлам является L. acidophilus. Металлами, проявляющими наименьшую токсичность в отношении E.coliявлялись железо, цинк, свинец и медь, в отношенииE. faecium, E. cloaceae и L. acidophilus только свинец и железо. Наиболее токсичным металлом в отношении исследуемых микроорганизмов является кадмий.

Список литературы:

1. Северин, Е. С. Биохимия : учебник / Е. С. Северин. – Москва. : Гэо-тар-мед, 2004. – 784 с.

2. Quigley, J.G. Identification of a human heme exporter that is essential for erythropoiesis. /J.G. Quigley, Z. Yang, Mark T. Worthington // Cell. – 2004. – V. 118. – № 6. – P. 757-766.

3. Портал фундаментального химического образования России [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.chem.msu.ru/

4. Collins, M. D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approach for modulating the microbial ecology of the gut / M. D. Collins, G. R. Gibson // Am.J.Clin.Nutr. – 2003. – V. 69. – № 5. – P. 1052-1057.

5. Сизенцов, А.Н. Способность пробиотических препаратов на основе бактерий рода bacillus к биоаккумуляции ионов тяжелых металлов в организме лабораторных животных/ Сизенцов А.Н., Барышева Е.С., Бабушкина А.Е.// Российский иммунологический журнал. - 2015.- Т. 9.- № 2(1) (18).- С. 753-755.

Код для цитирования: Скопировать