X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Введение

Изучение особенностей репликации хромосом в эмбриогенезе человека является актуальной темой, которая подлежит изучению и рассмотрению для современной медицины. Эмбриональное развитие возможно лишь при оптимальном сочетании внутренних и внешних условий. Каждая последующая стадия развития эмбриона или плода вытекает из предыдущих и имеющихся в данный момент условий развития. Если какого-либо внешнего или внутреннего условия недостаточно или возникает необычный внешний фактор, способный кардинально повлиять на ход развития плода, эмбриогенез может отклониться от нормального пути.

Целью моей работы является изучить особенности репликации хромосом в эмбриогенезе человека.

В своей работе я решила раскрыть следующие вопросы:

Организацию хромосом человека

Информационное содержание генома человека

Репликационный метод

Глава 1. Организация хромосом человека

Все гены в геноме человека, а также детерминанты их экспрессии организованы в 46 хромосом, расположенных в ядре, плюс митохондриальное хромосома. Каждая хромосома состоит из единственной двойной спирали непрерываемой ДНК; т.е. каждая хромосома в ядре - длинная, линейная спиральная двойная молекула ДНК, и ядерный геном состоит, следовательно, из 46 молекул, включающих более чем 6 млрд нуклеотидов.

Хромосомы, тем не менее, не просто двойная спираль ДНК. В каждой клетке геном упакован в виде хроматина, в котором ДНК объединена с несколькими классами хромосомных белков. За исключением фазы деления клетки, хроматин распределен по всему ядру и под микроскопом представляется сравнительно гомогенным. Когда клетка приступает к делению, геном конденсируется, и появляются видимые под микроскопом хромосомы. Хромосомы, таким образом, видны как дискретные структуры только в ходе деления клеток, хотя они сохраняют свою целостность и между делениями.

В хромосоме молекула ДНК существует в виде хроматина, в комплексе с семейством основных хромосомных белков, называемых гистонами, и с разнородной группой негистоновых белков, значительно хуже охарактеризованных, но, как установлено, определяющих соответствующие условия для нормального поведения хромосом и влияющих на экспрессию генов[2,с20]

Дополнительно к основным типам гистоновых белков множество специалированных гистонов могут заменять Н3 и Н2А, придавая при этом геномной ДНК специфические характеристики. Гистоны Н3 и Н4 также могут модицироваться в закодированные белки.Эти так называемые посттрансляционные модификации могут изменять свойства нуклеосом. Набор основных и специалированных гистоновых белков и их модификаций часто называют гистоновым кодом,котроый может изменяться в разных типах клеток,вследствие чего полагают,что он определяет характер упаковки ДНК и доступность ее для регулирующих факторов, определяющмх экспрессию генов или другие функции генома.

Таким образом, один уровень управления экспрессией генов может зависеть от того, как ДНК и гены упакованы в хромосомах и как они ассоциированы с белками хроматина в ходе упаковки.

Глава 2. Информационное содержание генома человека

Как обсуждалось в главе 1,продукт большинства генов — белок, структура которого, в конечном счете, определяет его конкретные функции в клетке. Однако если бы существовала простая взаимнооднозначная связь между генами и белками, мы могли бы получить максимум 25 000 различных белков. Это число представляется недостаточным, принимая во внимание обширную массу функций, выполняемых белками в клетках. Ответ на дилемму находится в двух характеристиках структуры и функции генов. [2,с37]

Многие гены способны генерировать несколько различных белков. Такое возможно, благодаря альтернативным кодирующим сегментам гена и последующей биохимической модификации полученного белка. Эти две характеристики генома значительно увеличивают его информационное содержание. Подсчитано, что таким образом 25000 генов человека могут кодировать до миллиона отличающихся белков.

Индивидуальные белки не функционируют сами по себе сами. Они формируют сложные функциональные сети, включающие множество различных белков и согласованно отвечающие на массу различных сигналов, как генетических, так окружающей среды. Комбинаторная природа генных сетей приводит к резкому увеличению разнообразия возможных функций клеток.

Гены распространены по всему геному, но тяготеют к объединению в отдельные группы или хромосомы и могут сравнительно редко встречаться в других регионах или в других хромосомах. Проиллюстрируем данное положение на примере хромосомы 11,сравнительно богатой генами-около 1300 генов, кодирующих белки. Гены не рассеяны вдоль хромосомы произвольно, их концентрация особенно велика в двух регионах с плотностью до одного гена на каждые 10 килобаз. Некоторые гены организованы в «семейства» родственных генов. Другие области бедны генами, и есть несколько так называемых «генных пустынь», размеров в миллион пар оснований и более, в которых нет никаких известных генов.

Гены, расположенные на аутосомах, имеют две копии: одна хромосоме, унаследованной от отца. В большинстве случаев обе копии аутосомных генов экпрессируются и генерируют конечный продукт.

Однако некоторые гены генома- исключения из этого общего правила, и у них экспрессируется только одна из двух копий. Такая необычная форма регуляции генов получила название геномного импритинга.

Глава 3. Репликационный метод

Репликация (репродукция) хромосом, состоящая в воспроизведении клеткой в каждом цикле деления полного набора хромосом, происходит на молекулярном уровне и касается двух основных компонентов хромосомы — ДНК и гистонов.

Подходы к анализу репликации ДНК хромосом на цитологическом

уровне, основаны на введении в пролиферирующие клетки предшественников ДНК в период синтеза(S-фазы) и изучении особенностей их включения в отдельные сегменты хромосом на стадии метафазы после завершения репродукции. Обычно в качестве модифицированного основания ДНК используют аналог тимидина — 5-бромдезоксиуридин (БДУ). Репликационный метод сегментации хромосом позволяет изучать синхронность репликации сегментов хромосом, обусловленную особенностями работы репликационного комплекса, как внутри одного клеточного цикла, так в нескольких делениях клетки. Так, долговременная инкубация клеток с БДУ используется для регистрации сестринских хроматидных обменов [1,с64] и оценки продолжительности клеточного цикла [1,с849]. Введение БДУ в S-периоде и регистрация результатов на стадии метафазы того же клеточного цикла позволяет изучать порядок репликации отдельных хромосом и их сегментов [1,с221, с320, с495]. Наиболее детальная характеристика паттерна репликации может быть получена при кратковременном введении БДУ в разные отрезки времени на протяжении S-периода. Регистрация участков хромосом, включивших БДУ, основана на изменениях структуры хроматина и способности к окрашиванию некоторыми

флуорохромами или красителем Гимза после УФ-облучения. Наибольшей чувствительностью обладает иммуноцитохимический метод детекции БДУ с помощью специфических антител, которые связываются с доступными эпитопами на однонитевой ДНК независимо от структуры хроматина [1,с320].Эти цитологические подходы позволили установить основные закономерности репликации сегментов хромосом и выявить взаимосвязь

процесса репликации с другими матричными процессами в хромосомах эмбрионов человека.

R-сегменты реплицируются в ранней S-фазе, в то время как G- и С-сегменты — в поздней [1,с474]. Показано, что в период R/G-перехода, когда прекращается репликация R-сегментов и инициируется репликация G-сегментов, некоторые R- и G-сегменты реплицируются одновременно [1,с276]. Инициация времени репликации в индивидуальных сегментах хромосом находится под жестким генетическим контролем, гомологичные сегменты могут реплицироваться асинхронно, т. е. с некоторым интервалом во времени [1,с371]. Следовательно, контроль над репликацией сегмента в каждой отдельной хромосоме осуществляется более строго по сравнению с регуляцией репликации гомологичных сегментов [1,с777]. Асинхронная репликация наиболее выражена для импринтированных локусов, которые характеризуются различным функциональным статусом хроматина в гомологичных хромосомах [1,с575]. Так, если асинхронная репликация сегментов, содержащих импринтированные локусы, наблюдается в 40–90 % клеток в разных тканях, то для остальных сегментов этот показатель не превышает 10 % [1,с371].

Время репликации, жестко взаимосвязанное с транскрипционной активностью хроматина, можно рассматривать как маркер функционального статуса сегмента хромосомы. Поэтому, изучая особенности репликации отдельных хромосомных сегментов в клетках эмбриональных и экстраэмбриональных тканей на разных сроках развития, можно косвенно оценить их роль в процессе дифференцировки клеток эмбриона и хорион-аллантоидной плаценты.

Следует отметить, что при изучении порядка репликации хромосомных сегментов хромосом необходимо иметь представление о продолжительности клеточного цикла в целом и S-фазы в частности. Известно, что длительность стадий клеточного деления варьирует в разных тканях и на разных этапах онтогенеза.

БДУ в высоких концентрациях способен приводить к замедлению процесса

репликации вплоть до полного ее блокирования, что сопровождается

изменением длительности S-фазы [1,с64, с320,с 903].

Стратегия исследования заключалась в анализе метафазных пластинок из спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта и эмбриональных тканей, которые находились на разных стадиях клеточного цикла после 24-часовой инкубации в питательной среде, лишенной синхронизирующих агентов. При инкубировании фрагментов тканей в каждый культуральный флакон с определенной периодичностью импульсно добавляли БДУ. Следовательно, в течение 24 часов клетки прошли фазы G2, М, G1, S, G2 и снова вошли в митоз. С учетом литературных данных о временных параметрах фаз М и G2 можно предположить, что суммарная продолжительность фаз G1 и S в митотическом цикле клеток цитотрофобласта составляет 15–17 часов [1,с137].

Характер репликационного рисунка, полученного в результате включения аналога тимидина в начале или конце S-фазы, может служить косвенным маркером времени репликации того или иного сегмента.

Сравнение репликационной структуры хромосом 1, 2, 3, 4, 5, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 21 и 22 показало, что различия во времени репликации G-сегментов более выражены между цитотрофобластом и эмбриональными клетками у эмбрионов 5–7 недель, чем 12–13 недель развития (52 и 16 сегментов соответственно, Р < 0,05) [1,с701].

Незначительное число таких «рано реплицирующихся» G-сегментов в эмбриональных клетках в срок 5–12 недель, возможно, связано с необходимостью функционирования многих генов в этот период активного органогенеза. С другой стороны, возможно, что репликация гетерохроматина в цитотрофобласте хориона начинается раньше, чем в эмбриональных клетках. Если последнее предположение справедливо, то следует признать, что в гетерохроматиновых районах, по крайней мере, некоторых хромосом локализованы гены, функционально активные только в эмбриональный период развития и именно в цитотрофобласте хориона.

Таким образом, различия в характере репликации районов гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16 являются ткане- и стадиоспецифичными и подтверждают различный функциональный статус этих районов в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях на разных стадиях эмбриогенеза человека.

Заключение

Все методы изучения репликации хромосом основаны на введении в клетку в период синтеза ДНК (S-период) предшественников ДНК—нуклеозидов, меченных радиоактивным изотопом водорода — тритием (3Н). Определение включения метки проводят либо на интерфазных ядрах, либо на митотических хромосомах. По предложению Тейлора, в качестве радиоактивной метки почти повсеместно используют специфический предшественник ДНК 3H-тимидин. Для выявления его включения в хромосому применяют метод авторадиографии. Однако этот метод в изучении репродукции целых хромосом все более вытесняется методом включения предшественников ДНК, меченных нерадиоактивным бромом. Для этой цели используют главным образом аналог тимидина 5-бромдезоксиуридин. Включение 5-бромдезоксиуридина в участки хромосом может быть выявлено на препаратах метафазных хромосом по их измененной окрашиваемости. В качестве красителей применяют некоторые флюорохромы или основные красители. Использование 5-бромдезоксиуридина вместо 3H-тимидина значительно повысило разрешающую способность методов оптического изучения репликации хромосом.

Список используемой литературы

Баранов В.С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научно-практические аспекты.: СПб: Издательство Н-Л,2007.640 с.: 141 ил.

Медицинская генетика : учеб. пособие / Роберт Л. Ньюссбаум, Родерик Р. Мак-Иннес, Хантингтон Ф. Виллард ;пер. с англ. А. Ш. Латыпова ; под ред. Н. П. Бочкова. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 624 с. : ил.

Клиническая генетика: учебник/Н. П. Бочков, В.П. Пузырев, С.А. Смиринихина ; под ред. Н. П. Бочкова- 4-е изд., доп. И перераб.-М.ГЭОТАР-Медиа,2013.-592с.: ил.

Медицинская генетика : учебник / под ред. Н. П. Бочкова. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 224 с. : ил.

http://бмэ.орг/index.php/РЕПРОДУКЦИЯ_ХРОМОСОМ

(Дата обращения 17.12.2017)

Код для цитирования: Скопировать