X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018
ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ НА РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИЙ ШТАММ ESCHERICHIA COLI K12 TG1 И STYLONYCHIA MYTILUS
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Увеличение уровня загрязнения окружающей среды такими наноразмерными формами требует подбора чувствительных и специфичных методов обнаружения и оценки опасности этих загрязнений. Для определения влияния такого типа токсических воздействий на окружающую среду наряду с химическими и физическими методами анализа был разработан ряд биологических тест-систем. В связи с этим целью настоящей работы стала оценка воздействия биологических эффектов наночастиц на рекомбинантный штамм Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Vibrio fischeri и на одноклеточных гидробинтов Stylonychiamytilus.
Анализ полученных данных выявил эффекты воздействия наночастиц на исследуемые тест-объекты. При этом по степени подавления свечения, характеризуемой величиной EC50, наночастицы металлов располагались в последовательности Zn > Cu-Zn (сплав) > Cu-Zn (смесь) > Сu. Результаты исследования действия наночастиц металлов на Stylonychia mytilus показали, что наночастицы металлов могут быть расположены в ряду токсичности следующим образом: Cu-Zn (смесь) > Zn > Cu > Cu-Zn(сплав).
Ключевые слова: наночастицы, люминесцентные микроорганизмы, простейшие, биотоксичность.
В последние годы интерес к изучению наноразмерных частиц существенно возрос. Это связано с тем, что открылись новые перспективные возможности использования наночастиц во многих областях науки и техники, в частности, для биохимии и микробиологии. Разработка и внедрение дешевых и быстрых биологических тест-систем для оценки токсичности наночастиц и до настоящего времени остается актуальной задачей. При этом одними из наиболее востребованных в настоящее время биосенсоров являются люминесцирующие микроорганизмы и одноклеточные гидробионты [1]-[2].
В связи с этим целью настоящей работы стала оценка воздействия биологических эффектов наночастиц на рекомбинантный штамм Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Vibrio fischeri и на одноклеточных гидробинтов Stylonychiamytilus.
При проведении исследований нами были использованы пять лабораторных препаратов наночастиц металлов, произведенных в Институте физики металлов имени М.Н. Михеева Уральского отделения РАН. Список включал наночастицы цинка (Zn, d=90 нм), меди (Cu, d=97 нм), а так же сплав этих металлов (Cu-Zn, d= 65 нм) и их смесь (Cu+Zn) в соотношении 60 % к 40 % [3].
Оценку воздействия наночастиц на Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Vibrio fischeri проводили с использованием методики проведения теста на ингибирование бактериальной люминесценции. Использованный бактериальный штамм выпускается ЗАО НВО «Иммунотех» (Россия) в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм». Методика биотестирования включала приготовление суспензий анализируемых соединений, их смешивание и совместную инкубацию с сенсорными микроорганизмами [3].
Биолюминесцентный анализ с использованием E. coli K12 TG1 проводился в течение трех часов и включал количественное измерение биолюминесценции в опытных и контрольных пробах на 60, 120 и 180 минуте с помощью микропланшетного анализатора Infinite PROF200 («Tecan Group, Ltd», Швейцария), по результатам которого рассчитывали индексы токсичности испытуемых наноматериалов.
Подготовка гидробионтов включала предварительное культивирование в течение 7 дней на среде Лозина-Лозинского с использованием дрожжей [4]. Затем полученные пробы наночастиц в объеме 100 мкл вносили в соответствующие ячейки. Далее производилось внесение культуры Stylonychia mytilus по 10 особей со 100 мкл дистиллированной воды. Подсчет выживаемости особей производился в течение 3-х часов при помощи микроскопа (БИОЛАМ-1, ОАО «ЛОМО» Россия) [4].
Полученные результаты выполнены минимум в трех повторностях и обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета компьютерных программ «Statistica» V8 («StatSoftInc.», США). Подсчет гидробионтов начался спустя 60 минут воздействия наночастиц, а выживаемость фиксировалась в течение 15 часов.
Общий анализ полученных данных выявил различные эффекты воздействия наночастиц на культуру клеток гидробионтовStylonychiamytilusи бактерий Escherichia coli.
При этом по степени подавления свечения, характеризуемой величиной EC50, наночастицы металлов располагались в следующей последовательности: Zn > Cu-Zn (сплав) > Cu-Zn (смесь) > Сu. Результаты исследования действия наночастиц металлов на Stylonychia mytilus показали, что наночастицы металлов могут быть расположены в ряду токсичности следующим образом: Cu-Zn (смесь) > Zn > Cu > Cu-Zn (сплав).
Таким образом, установлено, что среди наночастиц чистых металлов Zn, а среди двухкомпонентных систем Cu-Zn (сплав) оказали наиболее токсичное воздействие как на одноклеточных гидробионтов, так и на бактерии.
Исходя из этого можно подвести итог, на основании которого ряды токсичности наночастиц металлов для гидробионтов и для бактерий выглядят следующим образом для наночастиц чистых металлов: Zn>Cu и для двухкомпонентных систем: Cu-Zn (смесь) > Cu-Zn (сплав).
Библиографический список источников:
Методические указания 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза» – М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.
Belkin S. Microbial wholecell sensing systems of environmental pollutants // Curr. Opin. Microbiol. – 2003. – V. 6. – № 3. – P. 206–212.
Алешина Е. С. Оценка биотоксичности углеродных нанотрубок с использованием биотестов на основе люминесцирующих микроорганизмов [Электронный ресурс] / Алешина Е. С., Дроздова Е. А. // Вестник Оренбургского государственного университета,2015. – № 10. – С. 126–129.
Handy R.D., Owen R., Valsami-Jones E. The ecotoxicology of nanoparticles and nanomaterials: current status, knowledge gaps, challenges, and future needs // Ecotoxicology. – 2008. – V. 17. – № 5. – P. 315–325.