X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2018

Введение

Данная тема актуальна, так как картирование генов болезней имеет непосредственное клиническое применение, обеспечивая информацию о позиции гена, используемую для разработки методов косвенного анализа сцепления в пренатальной и пресимптоматической диагностике и выявлении носительства, в связи с обширным развитем науки в этой области. Картирование генов болезни критически важно для начального поиска гена болезни. Картирование фокусирует внимание на ограниченном регионе генома для выполнения систематизации всех имеющихся в нем генов, так что мы можем найти мутации или варианты, которые содействуют болезни (позиционное клонирование). Позиционное клонирование гена болезни обеспечивает возможность охарактеризовать заболевание по степени локусной гетерогенности, спектру аллельной гетерогенности, частоте различных патогенных или предрасполагающих к болезни вариантов в различных популяциях, пенетрантности и ожидаемой частоте мутаций, доле общего генетического вклада в болезнь, соотнесенных с вариантами в разных локусах и природе болезни у бессимптомных пациентов группы риска.

Цель: изучить Картирование генов человека и идентификацию генов болезней, описание генов и мутаций для ясного понимания патогенеза заболеваний, которые способствуют развитию таких направлений, как:

- чувствительная специфическая диагностика прямым обнаружением мутации;

- популяционный скрининг на носительство для выявления групп риска по болезни у обследуемых или их потомства;

- клеточные и животные модели;

- лекарственная терапия для профилактики и лечения болезни или замедления ее протекания;

- лечение заменой гена.

Задачи: Для изучения данной темы придется разобрать такие аспекты как: выбор стратегии картирования гена, идентификация генов наследственных болезней, идентификация невыявленных мутаций.

Выбор стратегии картирования гена определяется имеющейся информацией о продукте гена и о функции гена.

Существует две основных стратегии: «прямая генетика» — основанная на принципе «от белка к гену», и «обратная генетика» — «от гена к белку» и «от нормального гена к мутантному аллелю». Естественно, что первыми были исследованы те гены человека, продукт которых был охарактеризован на уровне белка, а метод картирования, основанный на стратегии «прямой генетики» получил название функционального картирования. В большинстве случаев ни о природе конкретного гена, ни о его продукте, ни о механизме патологии , вызываемой мутацией этого гена, ничего не известно. Это привело к необходимости разработки новых подходов к картированию генов, основными из которых являются кандидатное, позиционное и позицианно-каидидатное картирование. Однако независимо от используемого подхода необходимо подтверждение ассоциации гена с данным заболеванием путем обнаружения у больных изменений нуклеотидной последовательности этого гена, отсутствующие у здоровых.¹

Функциональное картирование

Используется при известном продукте гена и включает следующие этапы: определение аминокислотной последовательности белка (или выделение мРН К) и реконструкция кДН К; синтез олигонуклеотидного зонда и скрининг кДНК-библиотек для выделения кДНК-клона; установление хромосомной локализации гена-мишени (методом гибридизации in situ или др.); скринирование контигов, охватывающих район локализации гена-мишени, для определения клонов, гибридизующихся с данным кДНК-клоном; секвенирование позитивных клонов и характеристика гена-мишени (выявление мутаций). С использованием этого подхода у человека были картированы гены гемоглобина и факторов свертывания крови.

Кандидатное картирование

Основано на выборе белка-кандидата, аномалии которого могут привести к симптомам изучаемого наследственного заболевания. Далее выбирают ген(ы)-кандидат(ы), исходя из данных о нуклеотидной последовательности всех клонированных генов, и вырабатывают стратегию поиска мутаций для подтверждения/опровержения ассоциации гена-кандидата и изучаемого заболевания. Данная стратегия не очень эффективна для картирования генов болезней человека, что обусловлено недостатком информации о них. С другой стороны ценность отрицательного результата определяется возможностью исключить данный ген из списка ответственных за данное заболевание. Наиболее успешно этот метод применяется при картировании генов мультифакториальных заболеваний: так были исследованы некоторые гены, продукты которых участвуют в патогенезе сосудистых заболеваний и диабета.

Позиционное картирование (клонирование)

Наиболее перспективный метод картирования локусов различных наследственных заболеваний с неизвестным биохимическим дефектом. Этот метод, предложенный в 1980 г., основан на анализе сцепления между геном заболевания и аллелями полиморфных ДНК-маркеров в семьях, что стало возможным лишь при построении подробной генетической карты генома человека. По сути метод является генетическим картированием, необязателен и последующий скрининг на мутации в генах-кандидатах, лежащих внутри картированной области (позиционных кандидатов). Именно таким способом в настоящее время выявляют гены, ответственные за наследственные заболевания, и изучают генетические механизмы сложных мультифакториальных заболеваний, в том числе и рака. Можно с уверенностью утверждать, что с помощью этого метола при наличии сиквенса всего генома человека будет достигнут значительный прогресс в дальнейших исследованиях по генетике человека, как в норме, так и при патологии.

Применение метода позиционного картирования имеет и свои ограничения. При наличии карт сцепления с разрешающей способностью 1сМ и использовании дополнительных маркеров из области сцепления на практике критический размер области локализации патологического гена составляет 3—5 сМ. Это связано с ограниченным числом мейозов, доступных для анализа. Для регистрации рекомбинаций между повреждением в ДНК, приводящим к заболеванию, и аллелем полиморфного маркера, удаленного на расстояние 1 сМ, в среднем необходимо проанализировать 100 мейозов, а в большинстве работ по картированию анализируется меньшее число. К тому же в интервале 3-5 сМ может находиться от 30 до 50 генов, что значительно затрудняет выявление конкретного гена заболевания. Таким образом, классическая схема полногеномного скрининга позволяет определить локус заболевания, но не обладает разрешающей способностью, достаточной для последующей идентификации патологического гена.

Генетические технологии, обеспечивающие более точную локализацию генов называют тонким генетическим картированием. Тонкое генетическое картирование основано на определении гаплотипов (сцепленных групп аллелей) в популяциях больных и здоровых индивидов по нескольким полиморфным маркерам, которые наиболее тесно сцеплены с геном, ответственным за заболевание. Этот метод эффективен, если среди мутаций, приводящих к заболеванию, имеются одна или несколько частых. Хромосомы, несущие мажорные мутации, в большинстве случаев представляют собой потомки одной мутантной хромосомы — т.е. наблюдается так называемый «эффектоснователя». Очевидно, что изначально все потомки хромосомы-основателя имели один и тот же гаплотип, который постепенно размывался в последующих поколениях за счет рекомбинационных событий.

Анализ производных гаплотипа хромосомы-основателя, специфического для данной мутации, позволяет локализовать древние сайты рекомбинаций, которые привели к распаду гаплотипа и, таким образом, уточнить место мутационного повреждения в гене. Параллельно данный подход позволяет определять порядок тесно сцепленных полиморфных маркеров, В отличие от традиционного генетического картирования, где для каждой семьи выявляются рекомбинации, произошедшие в течение нескольких мейозов, при таком подходе анализируются рекомбинации, произошедшие за времена, сравнимые со временем жизни мутации в популяции. Соответственно значительно возрастает и разрешающая способность метода.

Эффективность этого подхода определяется, прежде всего, наличием мажорной мутации и ее возрастом. Если такой мутации не существует, имеет смысл провести аналогичные исследования в других популяциях.

Позиционно-кандидатиое картирование

Основано на выявлении кодирующих последовательностей (кДНК или внутригенных еSТS) в области хромосомной локализации гена с неизвестным биохимическим продуктом путем анализа генетических и транскрипционных карт. Вероятность того, что одна из таких последовательностей окажется геном данного заболевания, достаточно высока. При наличии молекулярных характеристик гена-каццидата проводят его мутационный анализ. В ряде случаев для выделения геномного клона используют «кандидатные» маркеры экспрессируюшихся последовательностей (EST — от англ. expressed sequences tags) в качестве зондов. Вьшеленный клон секвенируют и проводят его мутационный анализ. Этот метод очень эффективен при наличии высокоразрешающих физических и транскрипционных карт.

Использование для картирования локусов наследственных заболеваний EST предполагает предварительные исследования по их скринингу. Скрининг ДНК-маркеров, распределенных по геному, может быть оптимизирован, если принять во внимание особенность организации генома, заключающуюся в том, что картированные EST распределяются по хромосомам неравномерно — имеются «богатые» и «бедные» генами участки. На основании этого рекомендуется в первую очередь использовать для картирования микросателлитные маркеры, лежащие в EST-богатых участках хромосом.

Идентификация генов наследственных болезней

В первую очередь патологическая анатомия генома позволила идентифицировать и охарактеризовать гены моногенных наследственных заболеваний . Результатом этих работ стало не только получение громадной по объему информации о вызывающих менделирующие заболевания мутациях, но и разработка новых эффективных технологий типирования ДНК, создание и хранение информационных баз данных, способов обработки больших массивов результатов. Дальнейшее развитие работ по изучению патологической анатомии генома связано с поиском и анализом генетических факторов, играющих роль в определении сложных и количественных признаков - в том числе с поиском генов предрасположенности к мультифакториальным (многофакторным) заболеваниям .К числу таких заболеваний относятся все наиболее частые заболевания - такие как болезни сердечно-сосудистой системы , астма , сахарный диабет , многие неврологические и нейропсихиатрические заболевания.

Методы идентификации мутаций генов наследственных болезней

К методам идентификации мутаций генов наследственных болезней относятся: идентификация известных мутаций, идентификация невыявленных мутаций, идентификация мутаций и генетических полиморфизмов.

Идентификация известных мутаций

В настоящее время идентифицированы сотни генов, мутации в которых вызывают моногенные и мультифакториальные заболевания. Созданы банки данных об этих генах, отражающие спектр, классификации и механизмы возникновения мутаций, а также методы их диагностики. Во многих генах выделены мажорные (наиболее часто встречающиеся) мутации, разработаны алгоритмы молекулярной диагностики.

Кроме того, созданы коммерческие наборы, выявляющие в автоматическом режиме сразу несколько диагностически значимых мутаций в генах разных заболеваний, например миодистрофии Дюшенна- Беккера, МВ, серповидно-клеточной анемии и ФКУ.

Из известных точковых мутаций наиболее просто диагностируются однонуклеотидные замены, которые приводят или к исчезновению, или к образованию сайта узнавания эндонуклеаз (рестриктаз) после обработки этими ферментами амплифицированного фрагмента ДНК, содержащего мутацию. Сайт узнавания (рестрикции) - это специфическая область ДНК размером в 5-6 нуклеотидов.

К методам выявления известных мутаций также относятся следующие:

Амплификации рефрактерной мутационной системы

Метод амплификации рефрактерной мутационной системы (ARMS) предложен C.R. Newton et al. и C.D.K. Bottema et al. в 1989-1990 гг.

Суть метода состоит в параллельной постановке двух ПЦР, для одной из которых праймером служит аллельспецифическая мутантная ДНК, а другой - нормальные олигонуклеотидные последовательности ДНК. При этом в качестве второго праймера в двух реакциях выбирают одну и ту же олигонуклеотидную последовательность, чтобы могли амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяженности.

В исследуемой ДНК амплифицированные фрагменты образуются только в том случае, если в качестве аллельспецифичного праймера выбирается мутантная последовательность, тогда как нормальный олигонуклеотидный праймер блокируется.

Метод нашел широкое применение при идентификации мутаций в генах МВ, бета-талассемии, ФКУ и для типирования генов HLA- системы.

При применении этого метода возможно полное автоматическое сканирование.

ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез

Метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза предложен H.G. Eiken et al. и I.S.L. Ngo et al. в 1991 г. Суть метода состоит в том, чтобы выбор амплифицируемого участка ДНК соответствовал следующим требованиям:

• 3'-конец одного из праймеров должен примыкать непосредственно к мутантному сайту;

• один из нуклеотидов со стороны 3'-конца следует изменить так, чтобы он в сочетании с нуклеотидом мутантного сайта мог создать (или не создать) в этом месте сайт рестрикции для какойлибо нуклеазы.

Таким образом, обязательным условием является то, что ПЦР-продукты с нормального и мутантного аллелей должны отличатьсяпо наличию индуцированного сайта рестрикции. В результате на электрофореграмме у гомозигот будет присутствовать два фрагмента, содержащих мутацию, а у гетерозигот - один фрагмент, и все они должны соответствовать по длине рестрифицированным участкам молекулы ДНК. К сожалению, из-за наличия этого обязательного условия данный метод почти не востребован в диагностике наследственных болезней.

Аллельспецифические олигонуклеотиды

Метод аллельспецифических олигонуклеотидов (ASO) предложен J. Reiss в 1991 г. Суть метода состоит в амплификации фрагментов ДНК и последующей гибридизации с мечеными аллельспецифическими олигонуклеотидами, к которым обычно относятся последовательности размером 19 н.п., имеющие в центре мутантный сайт. При этом каждый из двух зондов должен быть комплементарным к нормальному или мутантному вариантам ДНК. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы стабильные дуплексы образовывались при полной комплементации гибридных пар. В таких условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибридизироваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот с мутацией - только с мутантным зондом, а ДНК гетерозигот - с обоими маркерными зондами. В 1994 г. И.В. Лебедева и соавторы предложили модифицированный вариант этого метода с использованием аллельспецифических ДНК-зондов, меченных биотином или пероксидазой хрена (метод применяется для автоматической регистрации мажорных мутаций при муковисцидозе и серповидноклеточной анемии). В модификации F.F. Chebaba (1993) для автоматического анализа используется принцип ленточного фильтра (стрипта) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соответствует определенной мутации. Стрипт помещают в раствор со смесью меченых амплифицированных фрагментов и создают условия для гибридизации, после чего выявляют тестируемые мутации. Именно этот принцип использован в ряде новых технологий исследования мутаций и генетических полиморфизмов (см. ниже).

Лигирование синтетических однонуклеотидных зондов

Метод лигирования синтетических однонуклеотидных зондов (OLA) был предложен U.N. Landergren в 1993 г. Суть метода состоит в том, что ДНК-зонды для лигирования подбирают так, чтобы они были полностью комплементарными нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. После гибридизации синтезированные нуклеотидные фрагменты сшиваются ДНК-лигазами, выделенными из термофильных микроорганизмов. В результате при наличии мутаций в анализируемом участке ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Сшивки между зондами в этом случае не происходят.

Метод включает несколько циклов гибридизации, лигирования и денатурации с последующим электрофоретическим анализом меченых однонитевых фрагментов ДНК. Метод был успешно применен для тестирования глобиновых генов при серповидноклеточной анемии и мутации F508 при МВ.²

Идентификация невыявленных мутаций

Как оказалось, с помощью ПЦР выявляются не только протяженные делеции амплифицированных фрагментов ДНК, но и небольшие делеции и вставки единичных нуклеотидов, которые влияют на размеры этих фрагментов. Например, такие изменения можно зарегистрировать при электрофорезе в агарозном или полиакриламидном гелях при исследовании наиболее часто встречающихся мутаций в гене МВ (делеции трех нуклеотидов или del F508).

Вместе с тем, при замене одного или нескольких нуклеотидов в гене длина амплифицированного фрагмента остается неизменной, тогда как некоторые физико-химические свойства мутантной молекулы меняются. Разработаны разные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точковых мутаций. Основными из них являются следующие методы.

Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК или выявление точковых мутаций

Метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК или выявления точковых мутаций (метод SSCP), предложен М. Orita et al. (1989) и D. Clavac, M. Dean (1993). Метод получил широкое распространение. Метод включает амплификацию фрагментов размером от 50 до 300 н.п., их денатурацию и электрофорез в полиакриламидном геле. Эффективность обнаружения (детекции) мутаций при размерах фрагмента менее 200 н.п. составляет 70-95%, а при длине более 400 н.п. уменьшается до 50%. Метод основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов молекулы ДНК (одинаковых по величине, но разных по пространственной ориентации) вследствие имеющихся в них разных нуклеотидных замен, что влияет на конформацию (скручивание) небольших однонитевых фрагментов.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGCE) был предложен Р. Майерс и др. (1990), а также R. Fodde и М. Losekoot (1994). Метод основан на зависимости свойств денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности (соотношение АТ-пар и ГЦ-пар). Различия выявляются при сравнении подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в условиях денатурации благодаря разности температур при создании градиента концентрации мочевины или формальдегида в геле. Метод пригоден для анализа крупных фрагментов ДНК. Его разрешающая способность при исследовании фрагментов до 600 н.п. составляет 95%. Метод эффективно применяется при анализе индуцированных точковых мутаций, возникающих в одной из 100 клеток, обработанных мутагеном. Однако он технически сложен и отличается высокой стоимостью.³

Гетеродуплексный анализ

Метод гетеродуплексного анализа (НА) предложен W. Hiao и P.J. Oefner в 2001 г. Позволяет идентифицировать мутации, локализованные в одной из нитей матричной ДНК и находящиеся в гетерозиготном состоянии. В амплифицированной смеси наряду с двумя типами гомодуплексов (нормальная и мутантная последовательности нуклеотидов) возникают гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепочками ДНК. У мутантных гетеродуплексов иная подвижность, чем у гомодуплексов (за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов - mismatch), что выявляется при электрофорезе в полиакриламидном геле. Разрешающая способность метода при исследовании фрагментов менее 300 н.п. достигает 80-95%.

Имеются модифицированные варианты этого метода, например, дополненные конформационно-чувствительным гель-элекрофорезом в сочетании с флуоресцентными красителями - метод CSGE (широко используется для поиска мутаций в разных генах); метод жидкостной хроматографии - метод DNPLC ⁴

Химическое расщепление некомплементарных сайтов

Метод химического расщепления некомплементарных сайтов или метод СМС, предложен М. Grompe в 1993 г. Информативность - 95-100%. Метод основан на способности ряда химических соединений или ферментов специфически разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания.

В частности, высокой чувствительностью к гидроксиламину отличается неспаренный цитозин, а к тетраоксиду осмия - неспаренный тимин. Последующая обработка такой молекулы ДНК пиперидином ведет к ее полному разрыву в модифицированном сайте.

Суть метода СМС заключается в выявлении мутаций с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих нормальным вариантам молекулы ДНК. Такими зондами служат синтезированные олигонуклеотиды, клонированные участки ДНК или амплифицированные фрагменты. При применении метода эталонную меченую ДНК смешивают с избытком тестируемой ДНК или РНК. К тестируемым образцам ДНК относятся клонированные ДНК, обработанные соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и после этого охлаждают, чтобы создать условия для образования дуплексов.

При наличии мутаций в тестируемых образцах ДНК (в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК) образуются места негомологичного спаривания.

После обработки соответствующими химическими агентами на основе электрофореза и радиоавтографии проводится идентификация и локализация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК. Появление укороченных фрагментов ДНК на электрофореграмме указывает на наличие мутантного сайта, а определение размера укороченного фрагмента выявляет локализацию этого сайта в тестируемой молекуле ДНК.

Большими преимуществами метода СМС являются:

• возможность исследовать протяженные участки ДНК (до 2 тыс. н.п.);

• возможность одновременно выявлять (локализовать) несколько мутаций в одном фрагменте ДНК;

• возможность использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций (при мультиплексном варианте метода).

В последние годы для идентификации точковых нуклеотидных замен широкое применение получил флуоресцентный вариант этого метода.⁵

Заключение

Картирование фокусирует внимание на ограниченном регионе генома для выполнения систематизации всех имеющихся в нем генов, так что мы можем найти мутации или варианты, которые содействуют болезни (позиционное клонирование). Патологическая анатомия генома позволила идентифицировать и охарактеризовать гены моногенных наследственных заболеваний . Результатом этих работ стало не только получение громадной по объему информации о вызывающих менделирующие заболевания мутациях, но и разработка новых эффективных технологий типирования ДНК, создание и хранение информационных баз данных, способов обработки больших массивов результатов.

Список используемой литературы

http://medbiol.ru/medbiol/slom/00051b9d.htm

http://vmede.org/sait/?id=Genetika_klin_mutovin_2010&menu=Genetika_klin_mutovin_2010&page=22

http://dommedika.com/201.html

Научно-практический журнал «Медицинская генетика», Главный редактор: Гинтер Е. К., д.м.н., профессор академик РАН, 2015г. с.20-27

International Journal of Plant and Animal Cytogenetics, Karyosystematics, and Molecular Systematics, 2012 i.e. Elater ferrugineus L., Germany, etc.,pages 33-48.

Код для цитирования: Скопировать