IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Фагосодержащие препараты достаточно слабо распространены на рынке косметических средств по уходу за кожей лица и тела.

Тогда как их основное преимущество заключается в том, что они не содержат в своём составе антисептиков и антибиотиков, а значит, не оказывают раздражающего влияния на кожу, гипоаллергенны и экологически безопасны.

Фагосодержащие препараты перспективны в использовании, как средства профилактики угревой сыпи и как противовоспалительные вещества при повреждениях кожи.

Целью нашей работы является разработка фитобальзама с бактериофагами.

В задачи проекта входят:

• Выделение бактериофагов.

• Изучение биологических свойств, выделенных бактериофагов.

• Разработка оптимальной композиции смеси бактериофагов

• Подбор оптимальной фитокомпозиции

• Выбор дополнительных компонентов.

• Конструирование фитобальзама

• Создание и испытание лабораторного образца.

• Разработка научно-технической документации.

Работа выполнялась на базе научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ» ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА.

Бактериологические исследования проводили по общепринятым в микробиологии методам (Д.А. Васильев, 2007).

В работе нами были использованы 10 референс-штаммов пиогенных бактерий. Бактерии обладали типичными для данных видов биологическими свойствами.

Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), буфер фосфатный (pH-7,6), Oxford-agar (Oxoid, Англия).

Лабораторная посуда и оборудование: термостат ТС-80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42, холодильник бытовой, дистиллятор, лабораторные центрифуги СМ-6М, набор для фильтрации фагов (Millipore – Millivac), лампа ультрафиолетовая Phillips с длинной волны 254 нм, мерные цилиндры, флаконы, чашки Петри, пробирки, пипетки мерные, колбы, штативы, спиртовки.

Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным М. Адамсом, Д.М. Гольдфарбом, С.Н. Золотухиным, M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski.

С целью получения чистых линий фагов и повышения их литической активности проводили пассажи выделенных изолятов на индикаторных культурах с периодическим клонированием типичных негативных колоний до получения их однородной популяции.

Одним из важных этапов борьбы с заболеваниями кожи является ранняя диагностика. Это многоступенчатый процесс, включающий несколько этапов:

1. Забор проб и их транспортировка

2. Получение чистой культуры возбудителя

3. Дифференциация и идентификация выделенных культур.

Каждый микроорганизм характеризуется специфическим спектром ферментов, поэтому изучение биохимической активности играет важную роль в лабораторной практике при идентификации микроорганизмов.

Для выделения бактериофагов из культур пиогенной флоры, были проведены бактериологические исследования соскобов с кожи, а также проведены мазки-отпечатки.

Для изучения микрофлоры тела человека мы использовали агаровые пластинки площадью 2-2,5 см², вырезая их с помощью стерильного ножа в близи пламени горелки.

Прикладывали их на кожу на 3-5 секунд и возвращали в чашку, после чего культивировали посевы в термостате при 37°С в течении суток. Результат представлен на рисунках 2-4. На агаре в местах соприкосновения его с телом человека образовалось множество колоний различных форм и размеров. По характерному росту колоний можно предположить, что большая часть выросших микроорганизмов относится к родам Streptococcus и Staphylococcusи бактериям группы кишечной палочки.

Для подтверждения этого из наиболее типичных колоний мы приготовили мазки и окрасили их по Грамму и микроскопировали.

Микроскопия мазков.

Окраска по Граму
Проба №2, 3. Обнаружены различные микроорганизмы, в основном грамотрицательные палочки различной длины
Проба № 1. Кокковая флора

Таким образом, при проведении исследования микрофлоры тела человека на основании роста микроорганизмов на питательных средах и окраски мазков по Граму нами были выявлено присутствие условно-патогенных бактерий родов Streptococcus и Staphylococcusи кишечной микрофлоры.

Для биохимической дифференцировки мы использовали системы СИБ.

СИБ представляют собой диски или полоски хроматографической бумаги, содержащие определенные количества субстрата в сочетании с индикатором, стабилизированные пленкообразующим покрытием.

СИБ-диски, полоски помещают в пробирки (за исключением СИБ на оксидазу) с соответствующей тесту средой (0.9% раствор натрия хлорида, фосфатно-солевой буферный раствор), в которые суспендируют полную петлю суточной агаровой культуры микроорганизмов и инкубируют при температуре 37^оС. Исследования проводят с чистой культурой.

Выделение культуры на дифференциально-диагностической среде

Посев на скошенный

питательный агар

Петля культуры

Залить вазелиновым

маслом (10,11)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Инкубация при 37^оС

Добавить реактивы

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Идентификация

Биохимические свойства

Тесты СИБ		Проба № 1	Проба № 2	Проба № 3
Уреаза		Бесцветный(-)	Бесцветный(-)	Бесцветный(-)
Аргинин		Интенсивно зелёный(+)	Интенсивно зелёный(+)	Интенсивно зеленый(+)
Сахароза		Оранжевый	Малиновый	Малиновый
Маннит		Малиновый	Малиновый	Малиновый
Сорбит		Малиновый	Малиновый	Малиновый
Рамноза		Бесцветный	Бесцветный	Бесцветный
Ксилоза		Бесцветный	Бесцветный	Бесцветный
Манноза		Желтый	Малиновый	Малиновый
Инозит		Малиновый	Малиновый	Малиновый
В-галактоза		Бесцветный	Желтый(+)	Бесцветны(-)
Лактоза		Розовый	Желто-оранжевый	Малиновый
Трехалоза		Бесцветный	Бесцветный	Бесцветный
Дульцит		Бесцветный	Бесцветный	Бесцветный
Фенилаланин		Светло желтый	Бесцветный	Светло желтый
Цитрат натрия		Оранжевый	Малиновый	Малиновый
Сероводород	Желтый с черной точкой(-)		Черный(+)	Желтый(-)

В результате проведения комплекса тестов мы выделили стрептококки, кишечную палочку и протей.

Выделения бактериофагов из лизогенных культур

Исследования на наличие свободного фага в культурах бактерий проводили методом предложенным С. Лурия и Д. Дарнелом (1970). В литровую колбу, содержащую 0,5 литра мясопептонного бульона, добавиляли по 1,0 мл 18-ти часовых культур, всех имеющихся у нас штаммов пиогенной флоры. Культуру помещали в термостат на 24 часа при температуре 37 ºС. Затем смесь бактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, прогревали на водяной бане при 58-60 ºС в течение 30 минут. Надосадочную жидкость исследовали на наличие фага методом агаровых слоев по A. Gracia на имеющихся у нас штаммах пиогенной флоры. Бактериофаги, полученные из культур, обладают большей специфичностью, чем фаги, выделенные из объектов окружающей среды. Вследствие этого, первоначально мы исследовали штаммы пиогенной флоры на наличие профага.

Результаты исследований свидетельствуют, что культуры пиогенной флоры не проявляют лизогенных свойств без воздействия на них индуцирующего фактора.

Выделение профаговиз бактерий при помощи индуцирующего фактора.По методу, предложенному Ганюшкиным (1988) на культуры, исследуемые как “лизогенные”, воздействовали индуцирующим фактором, одну из пробирок с фильтратом обрабатывали хлороформом (в разведении 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата) в течение 15 минут, а вторую прогревали в водяной бане при 58-60ºС в течение 30 минут.

В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами, с различной продолжительностью времени и расстоянием от лампы до поверхности чашки Петри при помощи ультрафиолетовой лампы Phillips длина волны которой приходится на область 253 нм. Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся маститогенных культурах методом «стекающей капли».

Данные нашего эксперимента показывают, что облучение бактерий УФЛ по предложенной схеме способствует выходу профагов из бактериальных клеток. В процессе работы по выделению бактериофагов с применением облучения рентгеном фаги выделены не были.

Повышение литической активности умеренных фагов

С целью получения чистых линий фагов и повышения их литической активности проводили селекцию клонов бактериофагов методом пассирования выделенных изолятов на индикаторных культурах с 5-ти кратным клонированием типичных негативных колоний до получения их однородной популяции по методике, описанной С.Н. Золотухиным (2007).

В результате проведенных опытов, нами было выделены и пассированы стрептококковый, эшерихиозный, протейный и цитробактерийный фаги.

Далее были изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов. Для определения морфологии негативных колоний мы высевали фаг в разведении 10^-8–10^-9 на чашки Петри методом агаровых слоев. Это было необходимо, чтобы в используемом разведении содержание фаговых корпускул в 1 мл не превышало 10–15. Для формирования газона роста культуры на поверхности агара использовали референс-штаммы. Посевы культивировали в термостате при температуре 37ºС. Изучение морфологии негативных колоний проводили через 24 ч культивирования (рис. 4, 5). Индикаторные культуры выращивали на стандартном МПБ (рН 7,4–7,6) при температуре 37 ºС в течение 18 ч. Результаты изучения морфологии бактериофагов представлены на рисунках 4 и 5.

Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний можно разделить на два типа (Борисов, 1976).

К первому типу относятся негативные колонии круглые прозрачные или мутные диаметром более 3 мм с зоной неполного лизиса по периферии шириной 0,5 – 4 мм.

Колонии второго типа круглые прозрачные или полупрозрачные с ровными краями имеют диаметр до 2 мм с отсутствием зоны неполного лизиса.

Литическую активность бактериофагов оценивали в конкретных стандартных условиях. Индикаторные культуры выращивали на стандартном мясопептонном бульоне (рН 7,4–7,6) при температуре 37ºС 18 ч. Литическую активность выделенных фагов определяли по методам Аппельмана и Грациа.

Литическая активность исследуемых бактериофагов по методу Аппельмана варьировала от 10^-7 до 10^-9. По исследованным параметрам принято решение для конструирования диагностического набора фагов отобрать наиболее активные из них.

Таблица – Литическая активность фагов

№ п/п	Фаг	Активность по Аппельману, степень разведения	Активность по Грациа, количество корпускул в 1 мл
1	1 фаг	10-8	7,1х107±5,4х107
2	2 фаг	10-7	3,3х108±0,1х108
3	3 фаг	10-7	1,5х107±1,5х107

Литическую активность выделенных и селекционированных изолятов изучали на плотных и в жидких питательных средах (методом агаровых слоев по Грациа и методом серийных разведений по Аппельману).

Умеренные фаги мы пассировали на индикаторных культурах для повышения их литической активности. Установили, что при 10-15 кратном пассировании повышение их литического титра не происходило. Поэтому по показателю литической активности эти изоляты явились бесперспективными и не могут быть использованы для изготовления фаговых биопрепаратов. Поэтому в дальнейших исследованиях у названных изолятов мы не изучали другие биологические свойства.

Для дальнейшего изучения биологических свойств и отбора фагов для конструирования препарата мы использовали 4 фага.

По результатам проведенных исследований пришли к выводу, что для создания биопрепарата необходимо использовать бактериофаги в равном соотношении.

Анализ литературных и Интернет-источников показали перспективность включения в состав фитокомпозиции следующие компоненты: экстракты календулы, ромашки, алоэ, мята, облепиховое масло.

В результате проведенных исследований нами проведено бактериологическое исследование кожи, выделены и пассированы стрептококковый, эшерихиозный, протейный методом обработки бактериальной массы УФ-лучами. При пассировании выделенных штаммов фагов мы получили популяцию со схожей морфологией и требуемыми показателями по литической активности. Для дальнейших исследований нами было отобрано 3 фага. Для создания фитокомпозиции было решено использовать следующие компоненты: экстракты календулы, ромашки, алоэ, мята, облепиховое масло.

Библиографический список:

1. Васильев Д.А. Бордетеллёз животных: характеристика заболевания и возбудителя, разработка методов диагностики / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Семанина, О.Ю. Борисова, С.Н. Золотухин, И.Г. Швиденко И.Г. - Ульяновск, 2014.

2. Васильев Д.А. Индикация Bordetella bronchiseptica из объектов внешней среды и клинических образцов / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Е.Н. Семанина, Е.Г. Семанин / Материалы V Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». Ульяновская ГСХА - 2013. - С. 18-22.

3. Васильева Ю.Б. Алгоритм использования тecт-cистемы индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, Р.Р. Бадаев, С.В. Мерчина, И.Г. Швиденко, Е.И. Суркова / Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 5. - С. 606.

4. Васильева Ю.Б. Биотехнологический подход в разработке метода идентификации Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина, Е.Г. Семанин / Материалы V Международной научно-практической конференции. Ульяновская ГСХА «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». - 2013. - С. 15-18.

5. Васильева Ю.Б. Детекция бактерий Bordetella bronchiseptica в мультиплексной полимеразно-цепной реакции / Васильева Ю.Б., Мастиленко А.В., Семанин А.Г., Скорик Д.С., Суркова Е.И. / Сборник статей «Аграрная наука - сельскому хозяйству». - 2014. - С. 253-257.

6. Васильева Ю.Б. Наборы для детекции бактерий вида В. Bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, А.Г. Семанин, Е.И. Суркова, А.С.Скорик, А.Н. Пирюшова, Н.Р. Уралов / Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ «Актуальные в опросы контроля инфекционных болезней животных». - 2014. - С. 48-53.

7. Васильева Ю.Б. Разработка методов выделения и селекции бактериофагов Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина / Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». - 2013. С. 28-32.

8. Васильева Ю.Б. Технология конструирования диагностического биопрепарата на основе бактериофагов Bordetella bronchiseptica и перспертивы его применения / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина / Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». - 2013. - С. 99-103.

9. Васильева Ю.Б. Эффективность иммунохимических методов для анализа антигенного состава Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 10-1. - С.100-104.

10. Васильева Ю.Б. Эпизоотология и инфекционные болезни животных / Васильева Ю.Б., Богданов И.И. – Ульяновск. - 2015. – 25 с.

11. Ломакин А.А. Чувствительность к антимикробным средствам бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А.А. Ломакин, А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева / Материалы I международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С. 144-147.

12. Мастиленко А.В. Подбор праймеров для выявления генов бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Н.А. Феоктистова / Материалы I международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С.109-112.

13. Мастиленко А.В. Разработка методики серологической идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью иммуноэлетрофореза / А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Е.Г. Семанин, Ю.Б. Васильева / Материалы III-й Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века». - 2010. - С. 47-49.

14. Мастиленко А.В. Разработка протокола проведения ПЦР для детекции бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Н.А. Феоктистова / Материалы I Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С. 113-116.

15. Мастиленко А.В. Определение эффективности разработанных зондов в реакции ОТ-ПЦР для повышения специфичности выявления Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверкалова // - Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т.3. - № 2. - С.152.

16. Методические указания по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. М., 1981.

17. Никульшина Ю.Б. Выделение бактерий рода Bordetella brovchiseptica от домашних животных / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина, Д.Н. Хлынов / Материалы Международной научно-практической конференции «Роль молодых ученых в реализации национального проекта "Развитие АПК"». - 2007. - С. 281-284.

18. Никульшина Ю.Б. Культивирование Bordetella bronchiseptica на различных селективных средах / Ю.Б. Никульшина, Д.А. Сверкалова, А.В. Мастиленко, Д.Н. Хлынов, Д.А. Васильев / Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». - 2008. - С. 57-59.

19. Никульшина Ю.Б. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, выделенных у домашних животных / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4. - С. 103-106.

20. Пирюшова А.Н. Особо опасные инфекции из-за рубежа / А.Н. Пирюшова, Ю.А. Журавкова, Ю.Б. Васильева / Студенческий научный форум. – 2015. - VII Международная студенческая электронная научная конференция, электронное издание. 2015.

21. Райчинец Ю.А Методика выделения Paenibacillus larvae / Ю.А. Райчинец, Н.А. Феоктистова, М.А. Лыдина, Р.Р. Бадаев, Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, С.В. Мерчина, И.Г. Швиденко / Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 5. - С. 599.

22. Сверкалова Д.Г. Создание транспортной и накопительной сред для Bordetella bronchiseptica / Д.Г. Сверкалова, А.В. Мастиленко, Д.Н. Хлынов, Ю.Б. Никульшина, Д.А. Васильев / Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». - 2008. - С. 134-136.

23. Семанин А.Г. Анализ распространения бордетеллеза домашних животных / А.Г. Семанин, А.С. Скорик, Е.И. Суркова, Ю.Б. Васильева, О.Н. Марьина / Студенческий научный форум – 2014. - VI Международная студенческая электронная научная конференция: Электронное издание. 2014.

24. Семанин А.Г. Комплексный биопрепарат на основе фагов / А.Г. Семанин, Е.И. Суркова, А.С. Скорик, Ю.Б. Васильева / Материалы I-й международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С. 79-82.

25. Семанин А.Г. Разработка селективной добавки для выделения возбудителя респираторной инфекции / А.Г. Семанин, Ю.Б. Васильева, А.В. Загуменнов, Е.Б. Мухин / Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны 2015. - С. 196-197.

Код для цитирования: Скопировать