IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Цель работы - исследование показателей кислородзависимой микробицидности лейкоцитов крови и перитоеального смыва крыс с помощью люминолзависимой хемилюминисценции (ЛЗХЛ).

Материалы и методы. Эксперимент проводили на нелинейных белых крысах-самцах 3-6 месячного возраста. Для индукции перитонита животным вводили стерильную суспензию зимозана (Zymosan A from Sacharomyces cerevisiae, Fluka, 97340) внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Для приготовления суспезии 100 мг зимозана суспендировали в 4 мл изотонического официнального раствора хлорида натрия, прогревали полученную суспензию в течение 60 мин на кипящей водяной бане, после чего взвесь диспергировали на ультразвукой бане и на Vortex-Genie‑2 (Scientific Industries, США). Через 12 ч после введения зимозана животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Кровь получали из сосудов хвоста в пробирку Эппендорф с предварительно внесенным туда гепарином (50 ЕД/мл). Лейкоциты крови выделяли с помощью метилцеллюлозы по ранее описанному методу [1, 2, 3]. Концентрацию лейкоцитов доводили до 25×10⁶ клеток/мл. Лейкоциты перитонеального смыва получали промыванием брюшной полости 10 мл 199 среды с 20 ЕД/мл гепарина, концентрацию клеток доводили до 25×10⁶/мл после подсчета с помощью гемоцитометра. В стимулированном варианте ЛЗХЛ в лунке 96-луночного непрозрачного планшета (3915 Assay Plate 96 Well Flat botton Black Polysterene, Corning Inc. Costar) вносили 10 мкл лейкоцитов (25×10⁶/мл), 70 мкл раствора Хенкса без индикатора, 10 мкл натриевой соли люминола (Sigma, США, A4686, конечная концентрации - 2×10^-4 М), 10 мкл опсонизированного или неопсонизированного зимозана (Fluka, в конечных концентрациях 15, 150 и 1500 мкг/мл). В спонтанном варианте вместо зимозана вносили раствор Хенкса. Измерения проводили при 37⁰С на люминометре Luminoskan Ascent® Thermo Labsystems c автоматическим замером интенсивность люминесценции на протяжении 3 ч (тип измерения – kinetic, integration time – 1000 ms, интервал – 3 мин, meas. count – 60) [1]. Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминисценции за весь период измерения (integral, RLU).Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики.

Результаты. Установлено, что показатели ЛЗХЛ в очаге воспаления (брюшная полость) существенно выше, чем в периферической крови (таблица). При этом лейкоциты как периферической крови, так и перитонеального смыва дозозависимо отвечают как на опсонизированный, так и на неопсонизированный зимозан.

Таблица. Интегральные показатели хемилюминисценции через 12 ч после индукции зимозанового перитонита

Зимозан и его концентрация, мкг/мл	Лейкоциты крови	Клетки перитониального смыва
Без зимозана	20,0±7,5	171,2±61,1
Опсонизированный, 15	166,3±44,2	1139,2±262,8
То же, 150	273,7±129,6	2210,9±741,9
То же, 1500	199,8±78,4	2130,4±701,4
Неопсонизированный, 15	111,9±57,5	529,1±149,4
То же, 150	163,7±91,7	753,5±198,4
То же, 1500	112,0±56,3	1022,6±467,8

Заключение. Таким образом, метод люминолзависимой хемилюминисценции может быть использован для оценки кислородзависимой микробицидности фагоцитирующих клеток при воспалении.

Список литературы

1. Шавшукова О.А., Хлызова Л.А., Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Виноградов А.Б., Четвертных В.А. Изменения показателей люминолзависимой хемилюминисценции у цыплят-бройлеров в условиях крупной птицефабрики // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т. 9 (18), № 2 (1). - С. 348-350.

2. Шилов С.Ю., Жукова А.Е., Петухова А.А., Барков С.Ю., Шилов Ю.И. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных клеток и лейкоцитов крови крыс с использованием маркера ацидификации фагосом pHrodo^TM // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т. 9(18), № 2(1). - С. 352-354.

3. Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Жукова А.Е., Барков С.Ю., Петухова А.А. Изменение уровня ацидификации фагосом у крыс в зависимости от фазы эстрального цикла // Российский иммунологический журнал. - 2016. - Т. 10 (19), № 2 (1). - С. 183-184. https://www.researchgate.net/publication/304625476_Changes_in_level_of_phagosomal_acidification_in_rats_depending_on_the_phase_of_the_estrous_cycle_Article_in_Russian

Код для цитирования: Скопировать