IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Аннотация: Состав среды оказывает важное влияние на выживаемость штаммов бактерий. Чтобы снизить воздействие множества повреждающих факторов в процессе замораживания используют защитные вещества и среды (криопротекторы). Микроорганизмы, особенно относящиеся к неустой­чивым видам, при высушивании в суспензиях, не содер­жащих защитных веществ, подвержены значительным изменениям, которые сопровождаются не только утра­той жизнеспособности, но и разрушением их клеточной структуры.

Цель: изучить влияние стабилизатора на грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий.

Материалы и методы. Штаммы бактерий:Alcaligenessp. B-5269; Acinetobacterbaumannii B-10246, Pseudomonas putida 18 (B-1827), Escherichia coli B-25422, Bacillus mycoides 537, Bacillus сereus 96.

Питательные среды: мясопептонный бульон, мясопептонный агар, сухое обезжиренное молоко ГОСТ Р 52791-2007, сахароза, лактоза, сорбит, желатин пищевой ГОСТ 11293-89.

Хорошими защитными свойствами обладает обезжирен­ное молока Микроорганизмы при высушивании в моло­ке сохраняют высокую выживаемость: Staphylococcus и Е. coli - до 70% (Lambin и др., 1958), фитопатогенные бактерии -до 60-80% (Е. В. Самосудова, 1965), Past, pestis -до 60% (Heckly и др., 1958). Культура Hemoph. pertussis, по сообщению Flosdorf и Kimball (1940), при высушивании в молоке сохраняла жизнеспособность и все свои первоначальные свойства при хранении в тече­ние более 2 лет.

Сахарозо-желатиновая среда считается одним из луч­ших стабилизаторов при высушивании вирусов . По данным А.А. Смородинцева и др. (1958), активность противопаротитной живой вакцины при высушивании в этой среде снижа­лась незначительно и была практически стабильной при хранении сухих препаратов в условиях температуры + 2-4°С.

Нами было подобрано 4 состава сред представленных в таблице №1. Основными компонентами сред послужили полисахарид агар-агар, сахара лактоза и сахароза, белковые компоненты сухое обезжиренное молоко и желатин.

Таблица 1 - Состав сконструированных защитных сред (стабилизаторы)

№ защитной среды	Состав защитной среды
Среда №1	0,1 гр - агара, 5 гр - желатина, 10 гр – сахарозы, 85 мл - дист. воды
Среда №2	0,1 гр - агара, 1,5 гр - желатина, 10 гр – сахарозы, 85мл - дист. воды
Среда №3	5 гр – лактозы, 5 гр – сахарозы, 8 гр – сухого обезжиренного молока, 82 мл - дист. воды
Среда №4	1 гр. – лактозы, 20 гр - сухого обезжиренного молока, 80 мл - дист. воды

Подсчет титра культур бактерий до лиофилизации. Первоначально мы исследовали титр бактериальной массы, полученной при смыве с чашек Петри до смешивания ее со стабилизатором, в соотношении 1:1. При подсчете выросших колоний результат половинили с учетом того если бы исследовали 1 мл суспензии стабилизатора и бактерий.

Подсчет титра культур бактерий после лиофилизации. Концентрацию микробных клеток определяли методом титрования растворенной суспензии лиофилизата. В ампулу шприцом вносили 1 мл стерильного 0,9% водного раствора хлорида натрия для регидратации. Через 30 минут после полной регидратации (растворении), содержимое пробирки в объеме 1 мл переносили в пробирку для раститровки. С раститрованных разведений делали посевы на чашки с МПА в объеме 0,2 мл и распределяли шпателем по поверхности среды. Инкубирование проводили при 37 °C в течении 24-48 часов. Учет результатов проводили в 1 и 2 сутки .

Результат подсчета концентрации клеток грамположительных штаммов представлены в таблице №2.

Таблица 2 - Анализ выживаемости клеток после лиофилизации грамположительных бактерий

Наименование культуры	Титр культуры до лиофилизации, КОЕ/мл	Титр культуры после лиофилизации, КОЕ/мл
		Среда №1	Среда №2	Среда №3	Среда №4
B. сereus №96	9,5×109	5,2×109	7,8×109	6×109	5×109
Процент выживших клеток бактерий, %		54,7	82,1	63,2	52,6
B. mycoides 537	3,5×109	2×109	2,4×109	2,5×109	2,2×109
Процент выживших клеток бактерий, %		57,1	68,5	71,4	62,8

Вывод

В процессе лиофилизации культур было выявлены некоторые недостатки в частности низкая выживаемость грамотрицательных культур от 7,1 до 18,7 % при высушивании на всех четырех средах. Что является причиной в настоящий момент не ясно. В дальнейшем предлагаем отбирать культуры в конце логарифмической стадии роста или в начале стационарной фазы. А также добавить в МПА дополнительные питательные компоненты твин-80 и олеиновые кислоты для повышения жизнеспособности бактерий.

Список литературы

1. Бекер М. Е. Торможение жизнедеятельности клеток / М. Е. Бекер, А. И. Рапопорт, Л. В. Калакуцкий [и др.]. - Рига : Зинатне, 1987. - 240 с

2. Бибен И.А. Лиофилизация пробиотической культуры / И.А Бибен.// Уральский научный вестник. 2016. Т. 4. № 1. С. 35-39.

3. Брюханов, А. Л. Длительное хранение строго анаэробных микроорганизмов вглицерине / А. Л. Брюханов, А. И. Нетрусов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42. - № 2. - С. 2000-2003.

4. Будыка Д. А. Биотехнология стабилизации живых микроорганизмов в биомассе и в препарате чумной вакцины/ Д. А. Будыка, Н. В. Абзаева // Инфекция и иммунитет. - 2016. - Т. 6, № 1. - с. 87-92.

5. Бузолева, Л. С. Некультивируемые формы бактерий Yersinia pseudotuberculosisпри периодическом культивировании / Л. С. Бузолева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - Т. 129. - № 4. - С. 444-447.

6. Васильева З.В. Сухая дрожжевая питательная среда для диагностики чумного микроба / З.В Васильева с соавт. // Проблемы природной очаговости чумы: Тез. докл. к 4 советско-монгольской конф. специалистов противочумных учреждений.- 1980. - ч.3.- С. 60 - 61.

7. Волков, В. Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах стабильности микроорганизмов к замораживанию и высушиванию // Микробиология. - 1994. - Т. 63. - Вып. 1. - С. 5-16.

8. Lapage, S. P. Preservation of microorganisms / S. P. Lapage, K. F. Redway // Handb. Microbiol. Clevelend. - Ohio (USA), 2011. - V. 1. - P. 713-724.

9. Malik, K. A. Bacterial culture collection: Their importance to biotechnology and microbiology / K. A. Malik, D. Claus // Biotech. and Genetic Engenering Rev. - 1997. - V. 5. - P. 137-197.

10. Malik, K. A. Liquid-drying of microorganisms using a simple apparatus / K. A. Malik // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1992. - V. 8. -Р. 80-82.

11. Калдыркаев А.И. Изучение биологических свойств выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis/ А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова //– Ульяновск: УГСХА 2010. – С.65-70.

12. Калдыркаев А.И. Выделение бактерий вида Bacillus subtilis из объектов санитарного надзора/ А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, Д.А. Васильев, Н.А. Феоктистова// – Ульяновск: УГСХА, 2010. – С.72-76.

13. Калдыркаев А.И. Изучение чувствительности бактерий рода Bacillus к различным концентрациям хлорида натрия/ А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, М.А. Юдина, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, С.В. Мерчина // - Ульяновск: УГСХА, 2011. – С.185-188.

14. Калдыркаев А.И. Методы выделения бактериофагов бактерий Bacillus / А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, М.А. Юдина, , Н.А. Феоктистова // -Ставрополь: изд-во «Энтропос», 2011. - № 4. – С.88-89.

15. Калдыркаев А.И. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis / А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова // - Оренбург: ОГАУ, 2011. - № 4(32). - С. 288-291.

16. Калдыркаев А.И. Биохимические свойства бактерий Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, А.В. Алешкин, Д.А.Васильев // Саратов, 2013. – С. 186-188.

17. Калдыркаев А.И. Биоиндикация бактерий Вacillus mycoides в объектах санитарного надзора / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, М.А. Лыдина, Н.А. Феоктистова, В.А. Макеев, И.Г. Швиденко // Ульяновск - 2013. - № 3 (23). - С. 52-56.

18. Калдыркаев А.И. Идентификация бактерий Bacillus cereus на основе их фенотипической характеристики / А.И. Калдыркаев, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, А.В. Алешкин // Ульяновск, НИИЦМиБ, 2013. – 98 с.

19. Калдыркаев А.И. Распространение Вacillus cereus и Вacillus mycoides в объектах санитарного надзора / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова // Ульяновск - 2014. - № 1 (25). - С. 68-76.

Код для цитирования: Скопировать