IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Для диагностики вирусных болезней людей и животных используют серологические реакции, которые основаны на взаимодействии вирусных антигенов со специфическими антителами.

Вирус – антиген, так как их белковая оболочка вызывает выработку специфических антител, которые накапливаются в сыворотке крови. Они способны соединятся в комплекс антиген + антитело только со своим антигеном. Если антиген – инфекционный агент (вирус), антитела его нейтрализуют: в этом состоит биологическая роль антитела.

Взаимодействие антител с антигенами возможно в пробирке, что является основой серологических реакций. Если взятая пара АГ (антиген) и АТ (антитело) гомологичны и соответствуют друг другу, то они образуют комплекс АГ + АТ. Это позволяет обнаружить по известному антителу неизвестный антиген [1].

1. Реакция нейтрализации (PH)

Это универсальная реакция служит эталоном при оценке других серологических реакций.

Принцип ее состоит в том, что при взаимодействии антигена (вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Индикатором свободного (не связавшегося с антителами) вируса является чувствительная к вирусу живая система: животные, куриные эмбрионы или культура клеток.

При постановке реакции в пробирке смешивают равные объемы вируса и сыворотки, смесь выдерживают при соответствующей температуре (4, 22 или 37 °С) в течение одного часа или 16—18 ч (зависит от вируса и условий опыта). Затем этой смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием живых объектов и через соответствующий срок учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию:

1) гибели, развития клинической картины болезни и патологических изменений в органах и тканях лабораторных животных;

2) гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионах;

3) цитопатического действия (ЦПД) или бляшкообразования в культуре клеток. [2]

Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется определенное количество антител, а один из этих компонентов все еще неизвестен, то PH можно ставить в двух вариантах:

1) к разным дозам (разведениям) сыворотки (обычно в виде последовательных 2-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы вируса (обычно 100—1000 ЕД50). В этом варианте определяют титр вируснейтрализующих антител в сыворотке, показателем которого служит разведение сыворотки, защищающее от действия вируса 50 % зараженных биологических систем;

2) к разным дозам (разведениям) вируса (обычно в виде последовательных 10-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы сыворотки (обычно в разведениях 1 : 10 или 1 : 20). При постановке данного варианта PH кроме исследуемой (или специфической) сыворотки используют и нормальную (отрицательную) сыворотку. В этом случае определяют индекс нейтрализации (IN), который показывает, во сколько раз иммунная (специфическая) или исследуемая сыворотка снижает титр вируса по сравнению е нормальной сывороткой.

Достоинствами PH являются ее универсальность и высокая специфичность; недостатки — большая трудоемкость; необходимость строго соблюдать стерильность материалов, посуды и инструментов; высокая стоимость живых биологических систем; относительная длительность биопробы и необходимость проведения математических расчетов. [3]

2.Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Широко используется при исследовании гемагглютинирующих вирусов.

Основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного.

Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса. [4]

РТГА можно ставить в двух вариантах:

1) к разным разведениям сыворотки (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы вируса (4—8 ГАЕ);

2) к разным разведениям вируса (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы сыворотки.

Постановку РТГА по первому варианту проводят по следующим этапам:

• титруют вирус в РГА и определяют его гемагглютинирующий титр;

• приготовляют и контролируют рабочую дозу вируса (4 или 8 ГАЕ);

• ставят главный опыт РТГА;

• учитывают результаты.

Оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах и определяют титр антител. За титр антител в сыворотке принимается наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию. [5]

РГТА позволяет решить следующие диагностические задачи:

• обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови с помощью известного вируса;

• идентифицировать неизвестный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами).

Достоинства РТГА — простота техники постановки и быстрый результат. Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов. [4]

3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;

• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);

• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;

• смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч при 4 °С;

• учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;

• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса). [6]

4.Реакция связывания комплемента (РСК)

Это — одна из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных болезней.

Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных этапов. На первом этапе участвуют антиген и антитело (один из этих ингредиентов заранее известен), а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии антигена и антитела их комплекс связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним — гемолизина). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антитела, то лизиса эритроцитов не происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов. РСК часто используют в диагностической практике для обнаружения и идентификации вирусов, обнаружения и титрования антител в сыворотках крови.

Основными компонентами РСК служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент (сыворотка крови морской свинки), гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2—7,4) или различные буферные растворы. [2]

5.Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП)

Основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов.

Для создания условий диффузии в слое агара делают лунки, в которые заливают компоненты. Количество и взаимное расположение лунок зависит от решаемой задачи.

РДП позволяет решить следующие диагностические задачи:

• обнаружить и идентифицировать неизвестный выделенный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами);

• обнаружить и определить титр антител в сыворотках с помощью известного антигена.

РДП может быть поставлена в чашках Петри (макрометод) и на предметных стеклах (микрометод).

Методика постановки макрометода по технике принципиально не отличается от постановки микрометода, только в этом случае в чашку Петри наливают 20—25 мл расплавленного агара и в застывшем геле делают лунки диаметром 5—6 мм по специальной схеме (расстояние между лунками 4—5 мм ) и вносят соответствующие компоненты.

При постановке РДП на предметных стеклах препарат можно через 48—72 ч высушить и окрасить раствором амидного черного, что позволит его сохранить и сфотографировать.

Достоинства РДП: простота техники постановки; быстрота получения ответа; не требует стерильной работы, особой чистоты компонентов; возможность документирования результата путем фотографирования. Недостаток РДП — низкая чувствительность. [7]

6.Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд)

Эту реакцию используют в том случае, если вирус обладает гемадсорбирующими свойствами. Гемадсорбцией называется адсорбция (прилипание) эритроцитов к поверхности клеток, зараженных вирусом.

Чтобы наблюдать гемадсорбцию, из пробирки с зараженной вирусом культурой клеток удаляют культуральную жидкость и вносят 0,5%-ную взвесь эритроцитов, оставляют на 5—10 мин, затем слой клеток споласкивают физиологическим раствором (чтобы смыть эритроциты). Если в зараженной культуре клеток идет репродукция вируса, то на таких клетках под малым увеличением микроскопа можно видеть адсорбировавшие эритроциты, в контрольных (незараженных) культурах клеток таковые отсутствуют.

РТГАд основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой (содержащей антитела к этому вирусу).

Методика постановки РТГАд заключается в следующем: на 3—7-й день после заражения культур клеток из них удаляют питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу ПГ-3 сыворотки в разведении 1:10;

пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на 30 мин (для контакта клеток с антителами);

во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки;

через 30 мин — учет результатов. Отсутствие гемадсорбции в пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с зараженной культурой клеток, но не обработанной специфической сывороткой, свидетельствует о наличии вируса ПГ-3 в культуре клеток.

Чаще всего РТГАд применяют для идентификации вируса и редко для обнаружения и титрования антител. [4]

7.Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

При данном методе используют явление люминесценции.

В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции — это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300—460 нм).

Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом. [3]

Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:

• готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;

• препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4—16 ч);

• окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.

Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного — контроль.

Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.

Прямой метод (одноступенчатый). На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 — 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.

Непрямой метод (двухступенчатый). На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного — продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов.

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных. [5]

Библиографический список

1. Госманов, Р. Г. Ветеринарная вирусология [Текст] : учебник для студ. вузов, обуч. по спец. 111201 "Ветеринария" / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : КолосС, 2006. – 93c.

2. Широбоков В. П. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Текст] : учебник для студ. высш. мед. учеб. заведений. – М. : Винница Нова Книга, 2015. – 262 с.

3. Научно-производственный журнал «Ветеринария» [Текст] // КолосС, 2003. - №11. – 12с.

4. В. А. Подколзина, А. А. Седов Медицинская микробиология[Текст]: конспект лекций для вузов. – М.: Приор-издат, 2007. – 14с.

5. Павлович С. А. Микробиология с вирусологией и иммунологией [Текст] : учеб. пособие / Павлович С. А. – 3-е изд., испр. – Минск: Выш. шк., 2013. – 388 с.

6. Донецкая Э.Г.-А. Клиническая микробиология [Текст] : Руководство для специалистов клинической лабораторной диагностики. — М. : ГЭОТАРМедиа, 2011. — 57 с.

7. Кишкун А. А. Клиническая лабораторная диагностика [Текст]: учеб. пособие. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 807 с.

Код для цитирования: Скопировать