IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro) /1/.

Наиболее распространенные способы выращивания культур клеток: первичные культуры клеток, культуры перевиваемых клеток и культуры диплоидных клеток.

Первичные культуры получают путем посева клеточной взвеси, приготовленной в результате ферментативного расщепления тканей.

Перевиваемые клетки - это культура клеток, способная к размножению вне организма неопределенно длительное время. Наиболее часто применяют культуры клеток, выделяемые из нормальных и раковых тканей человека. Среди них широкую известность получила линия клеток Hela, полученная из опухоли шейки матки человека.

Штаммом диплоидных клеток называется морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни /2/.

Каждый из трех основных типов клеточных культур, используемых в вирусологических исследованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжительном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Наиболее простой метод консервирования культур клеток- хранение их при 4°С до 1-6нед. Успешно применяют хранение клеточных штаммов в условиях сухого льда (минус 78°С) и жидкого азота (минус 196°С). Для этого клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации в 1мл питательной среды, содержащей в качестве защитных веществ 10-40% сыворотки и 10% очищенного стерильного глицерина (вместо глицерина успешно применяют ДМСО- диметилсульфоксид). Затем клеточную суспензию разливают в ампулы, запаивают и выдерживают 1-3часа при 4°С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1°С в 1 минуту. При снижении температуры до минус 25°С ампулы помещают для хранения в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клетками охлаждают до минус 70°С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жидком азоте в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и чувствительность к вирусам.

Штаммы вирусов хранят в холодильнике под замком с пломбой или печатью.

Использование стабилизирующих веществ необходимо не только при хранении вируса, но и для предотвращения потерь его в процессе самого замораживания, особенно вируссодержащих образцов экстраэмбриональной и культуральной жидкости. Если же в культуральной питательной среде содержится 2-19% сыворотки или гидролизата лактальбумина, то ее можно заморозить без добавления стабилизирующих веществ. Хорошее защитное действие при замораживании вирусов и хранении их в таком состоянии оказывает добавление к вируссодержащему материалу одного из таких компонентов, как 10-30% сыворотки крови, инактивированной при 56- 60°С; 0,5-1,5% желатина; 20-50% обезжиренного молока; 0,1-0,5% метилцеллюлозы; 1-5% пептона; 5-20% гидролизата животного белка и 10% ДМСО. Последний, хорошо защищает вирусы, имеющие оболочку, особенно вирусы герпеса, кори, везикулярного стоматита. Даже при четырехкратном оттаивании и замораживании установлено его эффективное защитное действие.

Восстанавливают замороженные клетки следующим образом: ампулу с замороженными клетками быстро погружают в водяную баню на 1-2 минуты при легком встряхивании, затем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37°С. Для удаления глицерина или ДМСО питательную среду заменяют на следующий день после посева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем заливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборатории питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в данной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4°С. При благоприятных условиях транспортировки, исключающих перегревание и замораживание клеток, 80-90% из них сохраняют жизнеспособность до 7-8 дней.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, питательных сред и высокого качества воды /1/.

Библиографический список

1. Белоусова, Р. В. Практикум по ветеринарной вирусологии [Текст] : учеб. пособие для студ. вузов по спец. 111201 "Ветеринария" / Р. В. Белоусова, Н. И. Троценко, Э. А. Преображенская . - 3-е изд., перераб. и доп. - Москва : КолосС, 2006. - 77 с.

2. Госманов, Р. Г. Ветеринарная вирусология [Текст] : учебник для студ. Вузов, обуч. По спец. 111201 «Ветеринария» / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. – 2-е изд., перераб. и доп. – Москва : КолосС, 2006 г. - 221с.

Код для цитирования: Скопировать