IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Метод ДНК-зондов позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты (в том числе и вирусные) в любых материалах, включая патологический материал от больных животных. Он основан на способности одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот соединяться в двухцепочечные, если они взаимно комплементарны. Каждая молекула нуклеиновой кислоты представляет собой цепь нуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями. Любой же нуклеотид можно рассматривать как структуру, состоящую из трех частей:

-фосфорной кислоты (H₃PO₄);

-сахара (рибозы или дезоксирибозы);

-азотистого основания (аденин, гуанин, цитозин, тимин или урацил);В зависимости от вида входящего в состав нуклеотидов сахара нуклеиновые кислоты делятся на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК) [2].

Нуклеотиды одного вида нуклеиновой кислоты по своему составу различаются только азотистыми основаниями, которых четыре вида (А, Т, Г, Ц) для ДНК и (А, У, Г, Ц) для РНК.

Пуриновые основания (А и Г) способны связываться с пиримидиновыми (Т, Ц и У) водородными связями. Поэтому и соответствующие нуклеотиды могут связываться между собой парами А-Т и Г-Ц. Это свойство называется комплементарностью. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновые кислоты) способны связываться водородными связями в одну двухцепочечную, если последовательность нуклеотидов одной точно соответствует последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары А-Т и Г-Ц. Такие две молекулы ДНК называются взаимно комплементарными. Ими могут быть не только две молекулы ДНК или две молекулы РН, но и ДНК с РНК (при этом все пары А-Т образуется А-У) Например, две молекулы ДНК, имеющие следующие последовательности нуклеотидов:

1) А А Г Ц А Т Г Г Ц Т…….Ц А А А Г Т;

2) Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А…….Г Т Т Т Ц А;

являются взаимно комплементарными. Если смесь таких нуклеиновых кислот подержать при 55˚С, то примерно через 2 ч образуются двухцепочные молекулы ДНК (рисунок 1).

 

Рисунок 1 Последовательность нуклеотидов в цепи ДНК

 

Поскольку исходные одноцепочные молекулы могут происходить из разных источников, это процесс удвоения молекул называется молекулярной гибридизацией. Нагрев материала, содержащего двухцепочные ДНК, до 80*С или обработка его щелочью приводят к разделению двухцепочных молекул на одноцепочные, что называется денатурацией.

Любой вирус включает одну специфичную для него молекулу ДНК (или РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту в материале от больного животного, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двухцепочная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как-либо помеченной.

Такая меченая одноцепочная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку или в виде атомов радиоактивного фосфора (Р³²), или в виде биотина, дающего изменение цвета, что позволяет обнаруживать зонд, а значит, и вирусную нуклеиновую кислоту, с которой зонд соединился в результате молекулярной гибридизации.

Методика обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты в патологическом материале включает следующие этапы:

1) получение ДНК-зонда и его метка;

2) подготовка патологического материала к исследованию;

3) молекулярная гибридизация и удаление одноцепочечных нуклеиновых кислот;

4) обнаружение двухцепочных нуклеиновых кислот, включивших в себя зонд (по метке);

5) интерпретация результатов.

Получение ДНК-зонда - наиболее трудная задача. Она сводится к тому, что ДНК соответствующего вируса, на который хотят получить ДНК-зонд, разрезают на фрагменты (с помощью рестриктаз). Методом электрофореза выделяют тот фрагмент, который неизменно обнаруживается в ДНК вирусов разного происхождения и является наиболее консервативным.

Из бактерии кишечной палочки выделяют те плазмиды, которые содержат ген фермента, разрушающего какой-либо антибиотик (например, ген пенициллиназы). Плазмидные ДНК с вирусными вставками вводят в бактерии, которые затем клонируют в селективной среде, содержащей антибиотик, к которому бактерии стали нечувствительными. Накапливают массу бактерий и из них выделяют плазмидную ДНК (путем удаления белка).

Выделенную плазмидную ДНК, содержащую вирусные вставки, метят радиоактивным фосфором (Р³²) путем ник-трансляции и денатурируют путем нагрева до 80°С. Образовавшиеся одноцепочные молекулы ДНК будут иметь фрагменты, комплементарные фрагментам одной из нитей ДНК вируса. Это и есть ДНК-зонд.

Для получения ДНК-зонда на вирусную РНК выбирают на основе анализа генетической карты вируса необходимый фрагмент РНК, выделяют его, а затем путем обратной транскрипции получают ДНК-фрагмент, который и встраивают в плазмиду. Обычно ДНК-зонд готовят на каждый вирус заранее, нарабатывают его и хранят до использования.

С помощью ДНК-зонда можно обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты в любом материале от больных животных. Для этой цели пригоден как свежий материал (ткани, смывы, кровь), так и высушенный, мороженный и даже частично разложившийся.

Из подлежащего исследованию материала выделяют ДНК, для чего его гомогенизируют, суспензируют, центрифугируют и надосадочную обрабатывают препаратами, разрушающими белки (сначала протеиназой К, затем фенолом хлороформом). После полного удаления белков осаждают ДНК при температуре -70°С, осадок отмывают спиртом и подвергают денатурации путем кипячения или обработки щелочью.

Полученные пробы из разных исследуемых материалов наносят на микропористую капроновую или нейлоновую мембрану(фильтр), расчерченную простым карандашом на квадраты (для каждого материала свой номер квадрата). Также наносят отрицательный и положительный контроли. Зонд наносят на стекло, которое затем накладывают на фильтр так, чтобы получился контакт зонда с исследуемым материалом, и 20 мин выдерживают при температуре 80°С, после чего температуру снижают до 55°С, при которой идет гибридизация (около 2 часов). Затем фильтр отделяют от стекла, промывают, сушат и удаляют с него все несвязавшиеся одноцепочные молекулы ДНК, обрабатывая додецилсульфатом и цитратом натрия. Методом авторадиографии устанавливают, в каких квадратах выявляется радиоактивность, и визуально оценивают ее интенсивность. Потемнение фотопленки, контактирующей с определенными квадратами, свидетельствуют о наличии в материалах этих квадратов искомой нуклеиновой кислоты вируса.

Использование радиоактивной метки для зонда является довольно большим недостатком метода, и поэтому разрабатываются другие методы метки зонда, в том числе присоединение к зонду метки, изменяющие цвет субстрата. Метод молекулярных зондов перспективен, так как позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты любых вирусов, для которых получен зонд. Однако исследования этим методом технически довольно сложны и трудно выполнимы.

Кратко метод ДНК-зондов сводится к следующему:

1. Получение одноцепочного фрагмента ДНК определенного вируса (ДНК-зонда) и его метка.

2. Выделение и патологического материала нуклеиновых кислот и их денатурация (расплетение двухцепочных молекул на одноцепочные).

3. Контакт образовавшихся одноцепочных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55˚С, приводящий к образованию двухцепочных молекул (молекулярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности.

4. Удаление всех негибридизированных одноцепочных молекул нуклеиновых кислот.

5. Обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.

Достоинства: Высокие чувствительность и специфичность, универсальность, отсутствие необходимости в стерильной работе и математической обработке материалов.

Недостатки: Относительная технологическая сложность, и трудность получения ДНК-зонда [1].

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1 . Белоусова, Р. В. "Практикум по ветеринарной вирусологии" [Текст] : учеб. пособие для студ. вузов по спец. 111201 "Ветеринария" / Р. В. Белоусова, Н. И. Троценко, Э. А. Преображенская . - 3-е изд., перераб. и доп. - Москва : КолосС, 2006. - 150-153 с.

2. Госманов, Р. Г. "Ветеринарная вирусология" [Текст] : учебник для студ. Вузов, обуч. По спец. 111201 «Ветеринария» / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. – 2-е изд., перераб. и доп. – Москва : КолосС, 2006 г. - 284 - 286 с.

Код для цитирования: Скопировать