IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Бешенство - особо опасная болезнь теплокровных животных, характеризующаяся тяжелым поражением центральной нервной системы, атипичным поведением, агрессивностью, параличами, ведущая к летальному исходу. Обычно протекает в буйной форме (у большинства животных) или в тихой (не характерно для крупного рогатого скота). Является зооантропонозом, представляя огромную опасность для человека.

По данным Роспотребнадзора, за январь-декабрь 2015 г. в Российской Федерации зарегистрировано 6 случаев инфицирования человека вирусом бешенства, что превышает показатели 2014 г. в два раза. Так же в стране зарегистрировано 3739 случаев заболеваемости животных, сообщает Центральная научно-методологическая ветеринарная лаборатория. Из них на долю диких животных, приходится 48,8%, собак и кошек – 37,9%, сельскохозяйственных животных – 12,4% эпизодов.

Полученные данные свидетельствуют о резком усугублении эпизоотической ситуации по бешенству, что заставляет обратить специалистов ветеринарной медицины усиленное внимание на данную проблему.

Наиболее действенным методом контроля бешенства среди животных является своевременная иммунопрофилактика и диагностика.

Возбудителем заболевания является вирус бешенства Rabies lyssavirus.

Order/Отряд – Mononegavirales;

Family/ Семейство – Rhabdoviridae;

Genus/ Род – Lyssavirus;

Species/ Вид - Rabies lyssavirus.

Методы лабораторной диагностики бешенства стандартизированы. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30-09-2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 г.

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства: метод флуоресцирующих антител (МФА); метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1); биопроба на белых мышах; метод иммуноферментного анализа (ИФА); реакция диффузионной преципитации (РДП).

Для диагностики используются:

1. Метод флуоресцирующих антител. Выявление антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

Для выявления вирусного антигена в мазках-отпечатках мозга используют прямую и непрямую реакцию иммунофлюоресценции. Мазки фиксируют в холодном ацетоне в течение 8-10 ч при температуре 4° С и обрабатывают во влажной камере 30 мин. антирабический иммуноглобулин, меченым ФИТЦ, промывают фосфатным буфером, высушивают и исследуют в люминесцентном микроскопе. Антигены вируса наблюдается в виде зеленых гранул разной формы и величины. В случае отрицательного результата, требуется провести другие методы диагностики.

2. Метод выделения вируса в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131. Основан на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

Суспензированый пат. материал вносят в культуру клеток, оставляя лунки для контроля. Положительный контроль - суспензия мозга мыши со штаммом вируса бешенства CVS, отрицательный - суспензия мозга клинически здоровой мыши. Далее инкубируют во влажном CO₂ инкубаторе с содержанием 5 CO₂% при 37±1°С в течении 42-28ч. Высушивают, фиксируют в холодном ацетоне в течении 30 мин, вновь высушивают. Далее с добавлением ФАГ в рабочем разведении, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при 37±1°С в течении 30 мин. По окончании трехкратно промывают, погружая на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе. Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы с четкими краями.

3. Метод биопробы. Выделение вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

Наиболее пригодными для заражения являются мыши-сосунки. Для постановки биопробы используют 15-20 животных. Заражение проводят под наркозом путем интрацеребрального введения 0,03 мл суспензии исследуемого материала. При наличии в исследуемом материале вируса бешенства у мышей возникает тремор мышц, параличи. В большинстве случаев животные погибают в течение пяти дней. Наличие вируса бешенства в зараженных и погибших мышах необходимо подтвердить с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции или обнаружения телец Бабеша-Негри. Идентификацию обнаруженного вируса бешенства проводят также с помощью реакции нейтрализации на белых мышах.

4. Метод иммуноферментного анализа. (ELISA) Основан на специфическом взаимодействии вирусного антигена с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго, меченного ферментом, антитела, путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

ИФА проводят в «сэндвич» варианте. На твердой фазе иммобилизуют гамма-глобулин. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положи­тельный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различ­ных разведениях. Инкубируют и отмывают. В лунки вносят антирабический пероксидазный коъюгат. После инкубации проводят отмывку. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении опти­мального окрашивания в лунках с положительным контролем. Отрицательный результат нуждается в подтверждении другими методами диагностики.

5. Реакция диффузионной преципитации. Метод, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый в виде линии преципитации.

Готовые разведения антирабической сыворотки вносят в приготовленные лунки в агаровом геле. Чашки Петри помещают в термостат при 37±1°С на 48 часов. Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-гло­булин. Отрицательный результат подтверждается другими методами.

Принимая во внимание высокую опасность болезни, обусловленную полной летальностью, специалисту ветеринарной медицины нужно знать, что окончательный диагноз может быть поставлен только методами лабораторной диагностики. Поэтому трудно переоценить значимость вышеперечисленных методов для практической ветеринарной медицины.

Библиографический список

1. Гайсаров, М.С. Эпизоотологическая характеристика бешенства животных в Республике Башкортостан, профилактика и меры борьбы с ним [Текст] : автореферат дис. канд. биол. наук : 16.00.03 / Гайсаров М. С.; Башкирский ГАУ. - Уфа : [б. и.], 2009. с. 18-19

2. Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и идентификации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза [Текст] / А.М. Гулюкин // М.:Вопросы вирусологии № 3, 2014 г. - с. 5-10.

3. Масимов, Н.А. Инфекционные болезни собак и кошек. [Электронный ресурс] / Н.А. Масимов, С.И. Лебедько. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2009. — 128 с. - Режим доступа: http://e.lanbook.com/book/256

4. Методы лабораторной диагностики бешенства. [Текст] : ГОСТ 26075-2013 - Введ. 2015-01-01. - М.: Госстандарт России, 2013. - 19с.

Код для цитирования: Скопировать