IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Для лабораторных исследований при подозрении на африканскую чуму свиней ветеринарный врач осуществляет отбор проб от свиней любой половозрастной группы, в зависимости от эпизоотологических данных и клинических показаний (неожиданная гибель нескольких животных неустановленной этиологии или превышающих технологическую норму). Количество проб берут от всех павших (заболевших), но не менее, чем от 3-х животных при массовой гибели. Структура проб: «полный набор», включая пробы крови, лимфатических узлов, паренхиматозных органов, костной ткани, трубчатую кость с мозгом (в случае отсутствия органов или их аутолиза).

Отбор проб для вирусологических исследований. Для обнаружения вируса африканской чумы свиней, антигена или генома от павших или убитых с диагностической целью свиней отбирают массой 5-10 г - селезёнку (1/3 часть), портальные, желудочные и подчелюстные (или мезентериальные) лимфоузлы (целиком), лёгкое (5х5 см) и почку (1/3 часть), 3-5 мл крови (или сгусток). Кроме того, рекомендуется в случае аутолизиса трупа отбирать грудинную или трубчатую кость.

Отбор проб для серологических исследований. Минимальное количество проб, которые должны быть отобраны для серологических исследований, рассчитывают с учётом 10%-ой серопревалентности заболевших с 95%ой достоверностью для обследования каждого помещения.

Пробы крови отбирают их полой вены не менее 10 мл от каждой свиньи [3].

Для лабораторных исследований применяют следующие методы: реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток, реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в формате электофорезной детекции, ПЦР в формате реального времени, применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант). В сомнительных случаях окончательный диагноз устанавливают заражением подозрительным материалом (кровь, суспензия селезенки и лимфатических узлов) свиней, вакцинированных против классической чумы. Заражение свиней (биопроба) проводят в специализированной лаборатории с соблюдением особых мер предосторожности. Серологические типы вируса определяют в реакции преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции задержки геамадсорбции (РЗГАд) и другими методами. [2]

Для обнаружения антигена африканской чумы свиней применяют реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток костного мозга (ККМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), содержащих эритроциты и последующем обнаружении гемадсорбции ставят в вирусологических лабораториях. Для этого культуру клеток ЛС или ККМС 2-3 суточного возраста, выращенную на стеклянных пластинках из покровных стекол в пробирках (чашках Карреля), заражают экстрактами суспензий органов и кровью и через 24, 48, 72, 96 и 192 часа после инокуляции культуру клеток просматривают под световым микроскопом на наличие гемадсорбции. В положительных случаях наблюдают гемадсорбцию эритроцитов на пораженных вирусом клетках в виде ягоды «малины» [4].

Реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) ставят в вирусологических лабораториях для прямого обнаружения вирусного антигена в клетках органов свиней, подозреваемых в заражении вирусом африканской чумы свиней. Внутриклеточный антиген обнаруживают люминесцентной микроскопией препаратов мазков-отпечатков, окрашенных ФИТЦ-иммуноглобулинами (специфические антитела к вирусу африканской чумы свиней, меченные флуоресцеинизотиацианатом). Лучшими органами для РПИФ являются селезёнка и лимфоузлы. Исследование может быть выполнено в течение 2-4 час [2].

Для выполнения реакции используют «Набор препаратов для дифференциальной иммунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней (АЧС), классической чумы свиней (КЧС) и болезни Ауески (БА)» или сертифицированные коньюгаты ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС, произведённые отдельно во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ), г. Покров Владимирская область.

Оценку результатов микроскопии проводят по условной четырех крестовой шкале при окуляре 10х20-объективе 10. В положительных случаях наблюдают сверкающую, желто-зеленого цвета флуоресценцию клеток с включениями или очаговыми флуоресцирующими комплексами диффузного и гранулярного антигена, в одном из 10-50 полей зрения.

Для обнаружения антигена и антител против вируса африканской чумы свиней применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант) основанный на взаимодействии иммобилизированных на поверхности лунок планшет специфических к вирусу АЧС иммуноглобулинов со специфическими антигенами АЧС и последующим выявлением комплекса «антиген-антитело» специфическим к вирусу АЧС конъюгатом антител, меченным пероксидазой хрена (коньюгат ПХ-АЧС). Пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена, в результате чего в лунках развивается окраска субстрата, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе. В случае отсутствия антигена, коньюгат ПХАЧС (т.е. ПХ) удаляется отмывочным раствором и окраска отсутствует.[3]

При визуальном учёте реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфический антиген в сине-зеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальный антиген.

Для обнаружения генома вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате электофорезной детекции. Для выполнения используют «Тест-систему для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР» (производство ГНУ ВНИИВВиМ). Принцип реакции заключается в многократном повторении циклов денатурации исследуемой ДНК при температуре 94°С, гибридизации ДНК со специфическими праймерами при температуре 53°С и синтеза с них комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле [1].

Анализ по выявлению вируса АЧС включает выделение ДНК и амплификации специфического фрагмента в полимеразной цепной реакции и электрофорез в агарозном геле [3].

Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос оранжевого цвета.

Реакция считается положительной, если полоса в соответствующем треке располагается в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля амплификации. Размер апликонов после проведения ПЦР- 485 п.н.

Реакция считается отрицательной, если в соответствующих треках полос не обнаружено или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта) [4].

Для обнаружения антигена вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате реального времени. Реакции заключается в использовании специфического флюоресцентно-меченного зонда, сайт гибридизации которого лежит между сайтами связывания основных диагностических праймеров. В случае присутствия в исследуемом образце генома возбудителя, зонд будет связываться с его ДНК и прибор регистрирует накопление флуоресцентного сигнала в ходе реакции. Регистрация сигнала происходит через стенки пробирки в режиме реального времени [1].

Учёт результатов проводят по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM с помощью программного обеспечения используемого прибора.

Положительными считают результаты реакции при значениях Ct, не превышающих 35.

Образцы, для которых не определено значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию) – результаты считают отрицательными [4].

Библиографический список

1. Белоусова Л.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. М.: КолосС, 2006. — 248 с [Текст] с.131-140.

1. Госманов Р.Г., Колычев Н.М. Ветеринарная вирусология М.: KoлoсC, 2006. — З04 c. [Текст] с.151-153.

2. Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А., Е.С. Воронин и др.; Под ред. А.А. Сидорчука. - М.: Колосс, 2007.-671с [Текст] с.206-275.

3. Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н. Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных. Учебное пособие. Краснодар. – 2009. – 575 С. [Текст] с.340-402

Код для цитирования: Скопировать