IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

В зарубежной ветеринарной и медицинской практике вопрос выделения бактериофагов бактерий Bordetella bronchiseptica и их применения с диагностической целью не достаточно изучен. Российские учёные до настоящего времени серьезно этим вопросом не занимались [1-25].

Методы выделения фагов Bordetellabronchisepticaиз источников внешней среды и от больных животных не дали положительных результатов [2, 5, 7-9, 17, 24].

Вследствие этого, мы поставили цель изучить возможность выделения фагов путем облучения бактерий Bordetella bronchiseptica индуцирующим фактором.

Материалы и методы исследования

Работа была выполнена в научно-исследовательском инновационном центре микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА. Для опыта были использованы 5 референс-штаммов Bordetellabronchiseptica из коллекции музея НИИЦМБ ФГБОУ ВО Ульяновская УГСХА (№ 1, 7, 214, 22067, 8344), также были использованы штаммы Bordetellabronchiseptica, выделенные от клинически больных собак.

В эксперименте были использованы стандартные методы работы с бактериофагами (Грациа, Аппельмана) [1, 2].

Результаты исследований

Нами была разработана схема выделения фага индукцией бактерии Bordetella bronchiseptica при помощи УФЛ.

Работа проводилась на базе научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА.

Процесс облучения УФЛ бактерий проводился в стерильном боксе при отсутствии какого-либо освещения, из-за возможности фотореактивации профага в бактериальную клетку.

Разработанная схема включает следующие этапы:

1й день: посев газоном суточной культуры B.bronchiseptica, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инкубирование чашек в термостате при 37˚С в течение суток.

2й день: распределение шпателем бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек в термостат (37˚С) на сутки.

3й день: распределение шпателем бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек в термостат (37˚С) на сутки.

4й день: смыв мясо-пептонным бульоном с чашек, помещение в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.

5й день: обработка хлороформом 1:10 в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку.

Полученную суспензию мы исследовали по методу агаровых слоев. В основу метода для поиска фагов положена схема, предложенная Грациа: 1,5 % мясопептонный агар с генцианвиолетом накануне опыта разливают по чашкам в количестве 25-30 мл. Чашки прикрытые стерильной бумагой высушивают под бактерицидной лампой в течение нескольких часов, затем закрывают крышками и в перевернутом виде оставляют на ночь при комнатной температуре (малейшее переувлажнение может исказить результат). Предварительно разлитый в пробирку 0,7% агар в количестве 2,5 мл расплавляют до 46-47˚С. 1 мл исследуемого фага помещают в 2,5 мл 0,7% агара, туда же вносят 0,1 мл эталонной культуры (штаммы Bordetellabronchiseptica № 1, 7, 214, 22067, 8344), вращая пробирку быстро перемешивают и выливают на поверхность 1,5% агара. Смесь осторожными движениями распределяют по поверхности 1,5% агара. Для застывания агара чашки оставляют на 30 минут, затем помещают в термостат на 18-20 ч при 37˚С.

6й день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса (негативных колоний), хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий.

Для селекции клонов фагов бактериологической петлей отвивали одну негативную колонию и помещали в пробирку с МПБ и индикаторной культурой бордетелл. Пробирки инкубировали в термостате при 37˚С в течении 8 часов, затем обрабатывали хлороформом из расчета 1:10 в течении 15 минут и центрифугировали при 3000 об/мин в течении 15 минут. Полученный фаголизат вновь исследовали методом агаровых слоев. Пассаж делали 8 раз до получения бактериофага с однородными негативными колониями.

Селекционированный бактериофаг имел прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром 2,0-3,0 мм. Литическая активность составила по Аппельману 10^-8, по Грациа 10^-10 корпускул в 1 мл фаголизата.

Данные нашего эксперимента показывают, что облучение бактерий УФЛ по предложенной схеме способствует выходу профага из клеток B.bronchiseptica.

Библиографический список:

1. Адамс М. Бактериофаги // - М.: Медгиз – 1961. 521 с.

2. Васильев Д.А. Бордетеллёз животных: характеристика заболевания и возбудителя, разработка методов диагностики / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Семанина, О.Ю. Борисова, С.Н. Золотухин, И.Г. Швиденко И.Г. - Ульяновск, 2014.

3. Васильев Д.А. Индикация Bordetella bronchiseptica из объектов внешней среды и клинических образцов / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Е.Н. Семанина, Е.Г. Семанин / Материалы V Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». Ульяновская ГСХА - 2013. - С. 18-22.

4. Васильева Ю.Б. Алгоритм использования тecт-cистемы индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, Р.Р. Бадаев, С.В. Мерчина, И.Г. Швиденко, Е.И. Суркова / Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 5. - С. 606.

5. Васильева Ю.Б. Биотехнологический подход в разработке метода идентификации Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина, Е.Г. Семанин / Материалы V Международной научно-практической конференции. Ульяновская ГСХА «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». - 2013. - С. 15-18.

6. Васильева Ю.Б. Детекция бактерий Bordetella bronchiseptica в мультиплексной полимеразно-цепной реакции / Васильева Ю.Б., Мастиленко А.В., Семанин А.Г., Скорик Д.С., Суркова Е.И. / Сборник статей «Аграрная наука - сельскому хозяйству». - 2014. - С. 253-257.

7. Васильева Ю.Б. Наборы для детекции бактерий вида В. Bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, А.Г. Семанин, Е.И. Суркова, А.С.Скорик, А.Н. Пирюшова, Н.Р. Уралов / Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИИВВиМ «Актуальные в опросы контроля инфекционных болезней животных». - 2014. - С. 48-53.

8. Васильева Ю.Б. Разработка методов выделения и селекции бактериофагов Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина / Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». - 2013. С. 28-32.

9. Васильева Ю.Б. Технология конструирования диагностического биопрепарата на основе бактериофагов Bordetella bronchiseptica и перспертивы его применения / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина / Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». - 2013. - С. 99-103.

10. Васильева Ю.Б. Эффективность иммунохимических методов для анализа антигенного состава Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 10-1. - С.100-104.

11. Васильева Ю.Б. Эпизоотология и инфекционные болезни животных / Васильева Ю.Б., Богданов И.И. – Ульяновск. - 2015. – 25 с.

12. Ломакин А.А. Чувствительность к антимикробным средствам бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А.А. Ломакин, А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева / Материалы I международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С. 144-147.

13. Мастиленко А.В. Подбор праймеров для выявления генов бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Н.А. Феоктистова / Материалы I международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С.109-112.

14. Мастиленко А.В. Разработка методики серологической идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью иммуноэлетрофореза / А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Е.Г. Семанин, Ю.Б. Васильева / Материалы III-й Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века». - 2010. - С. 47-49.

15. Мастиленко А.В. Разработка протокола проведения ПЦР для детекции бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Н.А. Феоктистова / Материалы I Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С. 113-116.

16. Мастиленко А.В. Определение эффективности разработанных зондов в реакции ОТ-ПЦР для повышения специфичности выявления Bordetella bronchiseptica / А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверкалова // - Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т.3. - № 2. - С.152.

17. Никульшина Ю.Б. Выделение бактерий рода Bordetella brovchiseptica от домашних животных / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина, Д.Н. Хлынов / Материалы Международной научно-практической конференции «Роль молодых ученых в реализации национального проекта "Развитие АПК"». - 2007. - С. 281-284.

18. Никульшина Ю.Б. Культивирование Bordetella bronchiseptica на различных селективных средах / Ю.Б. Никульшина, Д.А. Сверкалова, А.В. Мастиленко, Д.Н. Хлынов, Д.А. Васильев / Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». - 2008. - С. 57-59.

19. Никульшина Ю.Б. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, выделенных у домашних животных / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4. - С. 103-106.

20. Пирюшова А.Н. Особо опасные инфекции из-за рубежа / А.Н. Пирюшова, Ю.А. Журавкова, Ю.Б. Васильева / Студенческий научный форум. – 2015. - VII Международная студенческая электронная научная конференция, электронное издание. 2015.

21. Райчинец Ю.А Методика выделения Paenibacillus larvae / Ю.А. Райчинец, Н.А. Феоктистова, М.А. Лыдина, Р.Р. Бадаев, Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, С.В. Мерчина, И.Г. Швиденко / Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 5. - С. 599.

22. Сверкалова Д.Г. Создание транспортной и накопительной сред для Bordetella bronchiseptica / Д.Г. Сверкалова, А.В. Мастиленко, Д.Н. Хлынов, Ю.Б. Никульшина, Д.А. Васильев / Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». - 2008. - С. 134-136.

23. Семанин А.Г. Анализ распространения бордетеллеза домашних животных / А.Г. Семанин, А.С. Скорик, Е.И. Суркова, Ю.Б. Васильева, О.Н. Марьина / Студенческий научный форум – 2014. - VI Международная студенческая электронная научная конференция: Электронное издание. 2014.

24. Семанин А.Г. Комплексный биопрепарат на основе фагов / А.Г. Семанин, Е.И. Суркова, А.С. Скорик, Ю.Б. Васильева / Материалы I-й международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии». - 2014. - С. 79-82.

25. Семанин А.Г. Разработка селективной добавки для выделения возбудителя респираторной инфекции / А.Г. Семанин, Ю.Б. Васильева, А.В. Загуменнов, Е.Б. Мухин / Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны 2015. - С. 196-197.

Код для цитирования: Скопировать