В настоящее время антагонистическая активность рассматривается как один из дополнительных факторов вирулентности и персистенции условно патогенных микроорганизмов.
Цель работы – оценка антагонистической активности бактериальных культур, выделенных из нижних дыхательных путей у пациентов, находящихся в отделении реанимации с диагнозом «Пневмония».
Материалы и методы. Изучены 54 микробные культуры, выделенные из мокроты пациентов, находившихся в отделении реанимации и интенсивной терапии многопрофильного стационара с диагнозом «Пневмония». Среди них: 14 культур Pseudomonasaeruginosa, 13 - Klebsiellapneumoniae, 9 - Escherichiacoli, 7 - Acinetobacterbaumanii, а также 11 культур Staphylococcusaureus. Все они были выделены в диагностически значимых концентрациях из проб мокроты, прошедших бракераж по внешнему виду и результатам бактериоскопии.
Для изучения антагонистической активности применяли классический метод отсроченного антагонизма, а также тест ингибирования биолюминесценции [3, 4]. В первом случае оценивали способность культур угнетать рост тест-штаммов: Ps.aеruginosa, E.coli M-17, E.coli O-127, S.aureus и Cand.albicans. Во втором случае использовали микробиологический индикатор токсичности (МИТ), разработанный в ИЭГМ УрО РАН под руководством профессора Р.А.Пшеничнова. Принцип действия МИТ состоит в оценке изменения биолюминесценции генноинженерного штамма E. сolilum+ C-50 под воздействием изучаемых культур и их кратных разведений с помощью люминометра «Биотокс-10».
Биометрическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ «Microsoft Excel» и «Биостат».
Результаты. Данные, полученные при использовании всех методологических подходов, свидетельствовали о наличии достаточно выраженных антагонистических свойств у микрофлоры, выделенной из нижних дыхательных путей у больных внутрибольничной пневмонией. Так, тест подавления биолюминесценции показал, что все 54 изученные культуры обладали антагонистической активностью в отношении штамма E.colilum+ C-50 (см.табл.1). Различия между ними сводились лишь к степени подавления активности тест-штамма, а также к срокам проявления и стабильности антагонистических свойств.
Таблица 1. Показатели угнетения биолюминесценции исследуемыми культурами, % (М±m).
время измерения |
30´ |
60´ |
90´ |
120´ |
Ps.aeruginosa |
86,86 ± 2,73 |
86,03 ± 2,71 |
83,59 ± 3,50 |
86,20 ± 3,10 |
A. baumanii |
87,43 ± 5,10 |
86,59 ± 5,31 |
82,20 ± 8,10 |
82,16 ± 6,74 |
K. pneumoniaе |
70,48 ± 7,73 |
78,39 ± 7,06 |
82,71 ± 7,36 |
86,25 ± 4,51 |
E. coli |
58,80 ± 4,89 |
60,07 ± 8,43 |
69,36 ± 4,25 |
80,61 ± 2,86 |
S. aureus |
10,34 ± 5,33 |
-0,32 ± 6,72 |
-17,58 ± 14,14 |
-25,08 ± 20,53 |
Наиболее выраженное угнетение тест-штамма вызывали культуры Ps.aeruginosa, чье действие было стабильно высоким (показатели, замеряемые в течение 2-х часов, были практически равны). Подобным эффектом характеризовались и культуры A. baumanii.
Средние показатели культур ацинетобактеров не давали статистически значимых различий с аналогичными значениями синегнойной палочки. Примечательно, что хотя Ps.aeruginosa является общеизвестным антагонистом, культуры ацинетобактеров практически не уступали псевдомонадам по показателям антагонистической активности. Активность культур псевдомонад и ацинетобактеров, разведенных в 2 раза (в таблице не показано), снижалась лишь на 10-15%.
Первоначальные показатели энтеробактерий (клебсиелл и эшерихий) оказались достоверно ниже, чем у псевдомонад и ацинетобактеров (табл.1), однако ко 2-му часу наблюдения они достигли уровня 80% и более, что позволяет предположить наличие тонких, специфичных для родственных бактерий механизмов подавления метаболизма тест-штамма. При разведении культур их активность снижалась на 20-30% (у эшерихий - до 40%), что можно трактовать, как свидетельство низкой антагонистической активности.
Культуры стафилококка характеризовались самыми низкими показателями антагонистической активности. Кроме того, в последних измерениях отмечался противоположный эффект - усиление биолюминесценции. Этот эффект связывают, прежде всего, с действием компонентов питательной среды, которые проявляют свой стимулирующий эффект при отсутствии антагонистической активности микробов.
Показатели отсроченного антагонизма свидетельствовали о более низкой чувствительности этого метода (табл.2). Только показатели псевдомонад соотносились с описанными выше; у других культур отмечали сужение спектра активности и низкие цифровые показатели.
Таблица 2. Показатели угнетения тест-штаммов исследуемыми культурами, мм (М±m).
Ps.aеruginosa |
E.coli M-17 |
E.coli O-127 |
S.aureus |
Cand.albicans |
|
Ps.aeruginosa |
3,36 ± 1,39 |
23,50 ± 1,35 |
24,29 ± 0,71 |
22,07 ± 1,56 |
24,14 ± 0,86 |
A. baumanii |
0,00 ± 0,00 |
2,43 ± 1,74 |
3,29 ± 2,25 |
0,71 ± 0,71 |
0,71 ± 0,71 |
K.pneumoniae |
0,46 ± 0,46 |
13,38 ± 2,83 |
7,69 ± 1,27 |
3,54 ± 0,93 |
1,92 ± 1,17 |
E. coli |
0,00 ± 0,00 |
5,11 ± 3,38 |
6,00 ± 1,11 |
0,00 ± 0,00 |
0,00 ± 0,00 |
S. aureus |
0,00 ± 0,00 |
5,64 ± 1,41 |
4,00 ± 0,86 |
2,55 ± 0,77 |
0,55 ± 0,55 |
Полученные результаты вполне соотносятся с полученными ранее данными об антагонистической активности возбудителей внебольничных пневмоний и подтверждают тезис о значимости данного признака при развитии инфекционного процесса в легких [2].
Выводы.
1. Диагностически значимая микрофлора, выделенная из нижних дыхательных путей больных пневмониями, обладает достаточно выраженной антагонистической активностью.
2. Наиболее чувствительным и информативным способом выявления антагонизма является тест угнетения биолюминесценции.
3. Неоднородность культур по выраженности антагонизма и срокам его проявления указывают на множественность механизмов реализации этого признака.
4. Дальнейшее изучение антагонистических свойств условно патогенной микрофлоры позволит глубже оценить роль этого фактора в возникновении и развитии инфекционных процессов, вызванных данными микроорганизмами.
Литература.
1. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б., Усвяцов В.Я., Черкасов С.В. Симбиоз и его роль в инфекции // Екатеринбург, УрО РАН. 2011.- 302 с.
2. Катрецкая Г.Г., Маслов Ю.Н., Несчисляев В.А., Черешнев В.А. Антагонистические и адгезивные свойства условно патогенной микрофлоры, выделенной из нижних дыхательных путей при внебольничных пневмониях // Вестник уральской медицинской академической науки. №1 (38). 2012. С.79-81.
3. МУК 4.2.2602-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. Методические указания. - М., 2010.
4. Патент 2187801 Россия А 61 К 35/74, G 01 N 33/15. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. В.А. Несчисляев, Р.А. Пшеничнов, Е.Г. Арчакова, Л.П. Чистохина, И.В. Фадеева. 2002.
5. Хуснутдинова Л.М. Модификация биологических свойств бактерий в условиях ассоциации индигенной и патогенной микрофлоры // Вестник ОГУ, 2006. – № 12. – С.11-15.