IX Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2017

Известно, что биопленка представляет из себя микробное сообщество, в котором клетки прикреплены к поверхности или друг к другу, а также заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ. Показано, что в таком состоянии микроорганизмы могут менять свой фенотип. Для того, чтобы доказать присутствие именно биопленки, а не других бактериальных структур, используют разнообразные методические подходы, направленные на обнаружение как элементов биопленочного внеклеточного матрикса и генов, контролирующих биопленкообразование, так и сложных архитектурных структур, специфичных для биопленки.

Цель исследования – провести сравнительную оценку существующих методов выявления биопленок микроорганизмов.

Основное направление при изучении биопленкообразования связано с разработкой методов культивирования микроорганизмов в динамических условиях (имитация естественных условий образования биопленок), к которым можно отнести методы с использованием ферментеров. Общая суть методов заключается в инокулировании микроорганизмов в планктонной фазе развития в жидкие питательные среды, которые циркулируют в закрытой системе. Таким образом, создаются условия для постоянного потока жидкости, содержащей микроорганизмы. Первоначальная адгезия микроорганизмов происходит на поверхности системы фильтров и/или на внутренних частях ферментера. В последующем адгезированные микроорганизмы образуют матрикс биопленки. Однако, наиболее часто используемой техникой является метод с применением 96-луночных пластиковых планшетов в различных модификациях, который основан на способности бактерий формировать биоплёнки на поливинилхлоридном пластике. При использовании данного метода суспензия бактерий вносится в лунки планшета, после инкубации в оптимальных условиях планктонная фаза популяции бактерий удаляется вместе с питательной средой, образовавшиеся биопленки окрашивают кристаллвиолетом и проводят количественный учёт связанного красителя в спектрофотометре, что позволяет проводить количественные сравнения способности образования биоплёнки разными штаммами. Этот метод до сих пор не потерял своей значимости [1, 2], однако научный интерес отечественных исследователей к нему в последнее время значительно снизился, а практическое значение так и не получило должной оценки в нашей стране. В первую очередь, это связано с тем, что для этого метода не разработаны стандарты, позволяющие унифицировать его.

Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле любого процесса, используются методы направленного и ненаправленного (инсерционного) мутагенезов. Для выяснения механизмов инициации образования биопленок R. Kolter с соавт. описали мутанты, дефектные в отношении образования биопленок, полученные с помощью транспозонного мутагенеза, у P. aeruginosa и Е. coli. При использовании данного метода вначале получают большое количество инсерционных мутантных клонов и подвергают их тотальной проверке на способность к образованию биопленок в сравнении со штаммом, используемым в качестве исходного для мутагенеза

В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия – конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование. Рефлексируемое изображение, получаемое через объективы в результате преломления по системе зеркал, поступает на детектор, который обрабатывает приходящие лучи, составляя изображение, передаваемое на монитор компьютера. При помощи движения лазерного луча происходит послойное сканирование исследуемого объекта.

Достаточно новый метод изучения и детекции биопленок, который можно использовать как in vitro, так и in vivo – измерение биолюминесценции. При искусственном введении в бактерии плазмид, ответственных за синтез люминесцирующего белка, можно проводить визуализацию как адгезированных бактерий, так и матрикса биопленки. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также стал сравнительно недавно использоваться для изучения биопленок в медицине. Метод гибридизации применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в клетках, образующих биопленки, что позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в бактериях. С помощью этого метода была определена неоднородность бактерий в биопленке и выявлены клетки-персистеры, ответственные за выживание популяции во время воздействия летальных для основной массы клеток факторов.

Список литературы:

1. Тюляндина Е.В., Годовалов А.П. Изучение действия лейкоцитов, активированных индуктором интерферона, на биопленки Staphylococcus aureus // Сборник научных статей II Международной научной медицинской конференции «Современные медицинские исследования». – 2016. – С. 5-8.

2. Тюляндина Е.В., Годовалов А.П. Влияние циклоферона на антибиопленкообразующую активность клеток периферической крови против Сandida albicans // Успехи медицинской микологии. – 2016. – Т. XV. – С. 300-303.

Код для цитирования: Скопировать