VIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2016

Содержание

	ВВЕДЕНИЕ
Раздел 1	ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НАИБОЛЕЕ ЗНАЧИМЫХ МИКРО- И МАКРОЭЛЕМЕНТОВ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА
Раздел 2	ТЯЖЁЛЫЕ МЕТАЛЛЫ КАК ТОКСИКАНТЫ
2.1	Проблема загрязнение окружающей среды ионами тяжёлых металлов
2.2	Взаимодействие микроорганизмов с ионами тяжёлых металлов
2.3	Материалы и методы исследования
2.3.1	Материалы, используемые в экспериментах
2.3.2	Escherichia сoli
2.3.3	Lactobacillus acidophilus
2.3.4	Металлы
2.4	Методы исследований
2.4.1	Метод последовательных разведений
2.4.2	Фотоэлектроколориметрический метод
2.4.3	Атомно-абсорбционный метод
2.4.4	Методы статистической обработки данных
Раздел 3	РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1	Определение субингибиторных концентраций тяжёлых металлов на рост бактерий E.Coli, L.Acidophilus
3.2	Изучение влияния солей тяжёлых металлов на динамику роста исследуемых микроорганизмов
3.3	Изучение способности исследуемых микроорганизмов накапливать тяжёлые металлы в биомассе при их совместном культивировании
3.4	Изучение способности исследуемых микроорганизмов к избирательному накоплению ионов тяжёлых металлов
	ЗАКЛЮЧЕНИЕ
	СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ
	ПРИЛОЖЕНИЯ

Определения, обозначения и сокращения

АТФ – аденозинтрифосфат

ВОЗ – Всеми́рная организа́ция здравоохране́ния

ВС РФ – Вооружённые Силы Российской Федерации

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

КФК – Колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2МП предназначен для измерения в отдельных участках диапазона длин волн 315–980 нм, выделяемых светофильтрами, коэффициентов пропускания и оптической плотности жидкостных растворов и твердых тел, а также для определения концентрации веществ в растворах и скорости изменения оптической плотности вещества.

МКО – микроорганизмы

ОВ – отравляющее вещество

ООН – Организация Объединённых Наций

ПДВ – предельно допустимый выброс химического вещества

ПДК – предельно допустимая концентрация химического вещества

ПДК_м.р. – предельно допустимая максимальная разовая концентрация химического вещества в воздухе населенных мест

ПДК_р.з. – предельно допустимая концентрация рабочей зоны

ПДС – предельно допустимый сброс

РК – рабочая концентрация

РНК – рибонуклеиновая кислота

РФ – Российская Федерация

СанПиН – Санитарные правила и нормы

СИК – субингибиторная концентрация

ТЭС – тетраэтилсвинец

ТЭЦ – тепловая электростанция

ЦНС – центральная не́рвная систе́ма

ВВЕДЕНИЕ

Надежды на выживание человечества в условиях современной цивилизации связаны с сохранением основных свойств биосферы и составляющих её частей. Это возможно только при глубоком научном и ответственном понимании специалистами всех уровней экологических проблем, постоянно возникающих и требующих своего разрешения в разных сферах человеческой деятельности. Приоритетность экологического компонента в решении государственных и международных проблем была провозглашена на саммите ООН по климатическим изменениям, состоявшемся в Париже в период с 30 ноября по 12 декабря 2015 года, где президент РФ В.В. Путин сказал: «Россия перевыполнила план Киотского протокола, сократив выбросы углекислого газа настолько, что глобальное потепление на Земле замедлилось на год». Н.Н. Моисеев¹, исследуя биосферу как целостную систему, при разработке теории коэволюции человека и биосферы, пришёл к выводу, что «только принятие новой системы отношений человека с другими людьми и с Природой может помочь человечеству выжить в условиях надвигающегося экологического кризиса».

Именно государственным подходом в решении экологических проблем обусловлена объективная необходимость непрерывного и междисциплинарного экологического образования на всех уровнях – от дошкольного до повышения квалификации любого специалиста, главной целью которого является формирование природоохранного мировоззрения на основе разумного синтеза гуманитарных и естественнонаучных знаний.

Изучение дисциплины «Экология» в военном вузе предполагает исследовательский характер учебных занятий, которые, как правило, имеют продолжение в системе военно-научной работы курсантов, главной целью которой, является повышение качества подготовки офицерских кадров-специалистов, развитие творческих способностей и применения в практической деятельности новейших достижений науки и техники. Изучение дисциплины «Экология» направлено на формирование у обучающихся способности применять полученные знания при решении профессиональных задач [1].

Актуальность проблемы объясняется тем, что многие металлы являются биогенными элементами, поэтому необходимо изучить потребность в них организма человека и способы возмещения потерь, поскольку их недостаток приводит к нарушению жизнедеятельности организма и приводит к различным заболеваниям;

Не менее актуальна проблема загрязнения окружающей среды тяжёлыми металлами, в ходе которого они попадают в организм человека. Тяжёлые металлы имеют широкий спектр действия и влияют практически на все системы организма, оказывая токсическое, аллергическое, канцерогенное воздействия на организм человека. Растения и микроорганизмы обладают способностью накапливать и удалять тяжёлые металлы. Поэтому определённый научный интерес вызывают микроорганизмы, в частности бактерии, входящие в состав пробиотиков, поскольку они являются рекордсменами по биоаккумуляции² металлов [6] и обладают рядом полезных свойств, что делает возможным их применение для коррекции функциональных состояний у животных и человека после интоксикации металлами.

Цель работы. Изучить влияние микро- и макроэлементов на организм человека. Установить способность тяжёлых металлов аккумулироваться в пробиотических штаммах E.coliи L.acidophilus, изучить их влияние на клетки бактерий в условиях in vitro³.

Методы и материалы. Для проведения нашего исследования использовались следующие методы: аналитический метод, метод последовательных разведений, фотоэлектроколориметрический метод, атомно-абсорбционный метод и метод статистической обработки данных

В работе использовались пробиотические штаммы бактерий рода Bacillus. В качестве регулирующих факторов использовались водорастворимые соли металлов FeSO₄ – сульфат железа, ZnSO₄ – сульфат цинка, Pb(NO₃₎₂ – нитрат свинца, CuSO₄ – сульфат меди, CdSO₄ – сульфат кадмия. Выбор таких элементов, как свинец и кадмий, определялся их большой токсичностью для клетки. Металлы цинк и кобальт выбраны как наиболее распространённые биогенные элементы.

Раздел 1 ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НАИБОЛЕЕ

ЗНАЧИМЫХ МИКРО- И МАКРОЭЛЕМЕНТОВ

НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

При изучении темы «Круговорот веществ в природе и загрязнение геосистем» в курсе «Экологии» на кафедре Химии Вольского военного института материального обеспечения большой интерес у курсантов вызывает вопрос об экологических свойствах химических элементов, их биологическом воздействии на организм человека, при этом обучающиеся обращают особое внимание на значении полученных знаний в будущей профессиональной деятельности [1, 2].

На практических занятиях и лабораторных работах исследуется экологическое воздействие наиболее значимых микро- и макроэлементов на организм человека, с точки зрения физиологии, определяются способы попадания элементов в организм, изучается значение микро- и макроэлементов в питании военнослужащих, а так же действие химических элементов, относящихся к группе «тяжёлых металлов» [2; 3, с. 109–111].

В современной армии необходимо учитывать большую дифференциацию военного труда, и значительные энергетические затраты военнослужащих, которые составляют величину от 2800–4500 ккал и для различных родов войск составляют в среднем 3000–3500 ккал. Затраты энергии военнослужащими зависят от ряда факторов и меняются во времени. При опредёленных обстоятельствах, например при пеших переходах, на строительстве оборонительных сооружений, в моменты боя интенсивность физического напряжения достигает крайней степени.

Многие макро- и микроэлементы являются жизненно необходимыми, так как при их отсутствии или недостатке нарушается нормальная жизнедеятельность организма, такие элементы называют эссенциальными (незаменимыми). Например, ультрамикроэлементы, содержащиеся в организме в сверхмалых количествах, необходимы для нормальной жизнедеятельности человека, например, золото и серебро, которые оказывают бактерицидное воздействие, или ртуть, подавляющая обратное всасывание воды в почечных канальцах, оказывая воздействие на ферменты – биологические катализаторы.

Организация полноценного, высококачественного питания личного состава армии и флота является важнейшей задачей продовольственной службы. Питание, основанное на научных данных, с учётом специфики воинского труда, способствует укреплению здоровья и физическому развитию военнослужащих, повышает устойчивость организма к нагрузкам и в значительной степени положительно влияет на боевую готовность войск. Правильно организованное питание личного состава Вооружённых Сил Российской Федерации имеет большое значение в обеспечении здоровья военнослужащих. Поэтому очень важно, чтобы ежедневный рацион военнослужащих был построен с учётом научно-обоснованных принципов рационального питания.

Если организму недостаёт микро- и макроэлементов, или наблюдается их переизбыток, человек начинает заболевать, нарушается его обычный ритм жизни, он теряет силы, ухудшается сон, понижается иммунитет.

Рацион питания военнослужащего должен быть выстроен таким образом, чтобы организм с продуктами питания получал все необходимые витамины, вещества, которые так необходимы для жизни тканей, мышц, функционирования органов, обновления клеток.

Каждая клетка человеческого тела содержит химические элементы, которые участвуют в различных химических реакциях, обеспечивающих жизнедеятельность человека. В настоящее время в организме человека обнаружен 81 химический элемент. Каждый из этих элементов играет определённую, иногда не до конца изученную роль. Шесть химических элементов составляют основу органической жизни: C, O, N, H, S, P. Атом углерода – это основа всех органических соединений, в том числе и органических макромолекул, из которых состоит наше тело: жиров, белков, углеводов. Молекулы жиров и углеводов обязательно содержат атомы кислорода и водорода. Поскольку жиры и углеводы являются основой энергетики практически всех живых организмов – все живые организмы, а также те части биосферы, которые образуются при участии или разложении живых организмов содержат атомы C, H, O. По этой же причине все живые организмы содержат атомы фосфора, которые незаменимы при аккумулировании биологической энергии (входят в состав АТФ), а также все эти атомы входят в состав ДНК⁴ и РНК.

Важнейшую биологическую роль играют нуклеиновые кислоты, которые являются основой генетического кода всего живого. Они содержат атомы азота. Эти же атомы входят в состав белков, также как и атомы серы. Поскольку на нашей планете именно белки составляют основу живой клетки – атомы азота и серы имеются везде, где существует или когда-либо существовала жизнь.

В организме человека не только присутствуют практически все известные химические элементы, но каждый из них выполняет определённую биологическую функцию. Макро- и микроэлементы необходимы для построения структур живых тканей и осуществления биохимических и физиологических процессов, регулирования деятельности всех систем организма человека – нервной, гормональной, кровеносной и др.

Для жизнедеятельности любого живого организма характерен обмен веществ. Макро- и микроэлементы участвуют в важнейших обменных процессах организма: водно-солевом и кислотно-щелочном. Стабильность концентрации солей и её регуляция является жизненно важным механизмом, который поддерживает постоянство состава внутренней среды организма. Каждую секунду в человеческом организме происходят сотни тысяч химических реакций – разрушается огромное количество молекул различных веществ, из которых состоит тело, и одновременно синтезируются, т. е. образуются из более простых веществ, новые молекулы.

Все сложнейшие химические превращения, которые постоянно происходят в нашем теле, обеспечивают разнообразные ферменты. Значительная часть микроэлементов является жизненно необходимым, т. к. при их отсутствии или недостатке снижается активность ферментов, в состав которых входят данные элементы. Поэтому биогенные элементы можно разделить на микро- и макроэлементы [4]:

БИОГЕННЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ

Макроэлементы Микроэлементы

(более 100 мг/сутки) (менее 100 мг/сутки)

Основные Дополнительные

C, O, N, H, P, SCa, Na, Mg, K, Cl

Доказанные Недоказанные

Cu, Mn, Fe, Zn, Mo, Cr, Ni, V, Sn,

Co, F, I, SeAs, Si

Это деление связано с суточной потребностью, которая напрямую связана с их биологической функцией тем, в каких количествах требуются эти химические элементы. Например, организм, полностью обеспеченный этими важнейшими макроэлементами не сможет существовать, если каждый день он не будет получать менее 1 мкг Со. Это исчезающе малое количество микроэлемента кобальта необходимо для синтеза 0,001 мг витамина В₁₂(C₆₃H₈₈O₁₄PCо), без которого невозможны процессы кроветворения.

Итак, макро- и микроэлементы одинаково необходимы для здорового существования организма, но суточные дозы их существенно отличаются. Макроэлементы требуются в количестве более 100 мг/сутки, а микроэлементы – менее 100 мг/сутки. Кроме суточной потребности, у микро- и макроэлементов есть ещё одно существенное различие. Содержание макроэлементов в организме является практически постоянным и некоторые случайные отклонения не вызывают расстройств, если только эти отклонения не носят хронический характер. Например, в пище достаточно долго может наблюдаться избыток или недостаток K, Na, Cl, вреда не будет, если вовремя сбалансировать диету. Другими словами, макроэлементы, не токсичны.

Микроэлементы должны поступать с пищей достаточно регулярно, для чего питание должно быть максимально разнообразным. Попытки внести микроэлементы при помощи искусственных добавок, чаще всего, приводят к передозировке и, как минимум, к расстройству здоровья. Другими словами, даже кратковременный избыток или недостаток микроэлементов в нашей пище приводит к отравлениям или заболеваниям. В избыточном количестве практически все микроэлементы токсичны.

Причина таких различий заключается в том, что макроэлементы в организме представлены, в основном, структурными тканями, которые составляют основу скелета, мышц, различных органов и тканей. Они же участвуют в обеспечении организма энергией. Эти же элементы входят в состав питательных компонентов нашей пищи, то есть тех веществ, которые способны усваиваться, обеспечивая нас энергией или, после соответствующего превращения, становятся частью нашего тела.

Микроэлементы обычно входят в состав ферментов, причём составляют ничтожную часть их. Обычно эта часть ферментов представляет собой комплекс «белок–металл». Такой же комплекс может образовываться с другими ферментами или белками при избытке микроэлементов. Как правило, полученные соединения являются ксенобиотиками⁵ для нашего организма, и развивается отравление.

Рассмотрим основные функции некоторых микроэлементов пищи человека.

Железо в виде Fe²⁺ входит в состав гемоглобина крови, то есть без него невозможен процесс дыхания. Этот химический элемент входит в состав ДНК, причём играет роль своеобразного «тормоза» передачи наследственной информации. Избыток железа (III) в нуклеиновых кислотах приводит к ускорению процессов старения. Интересно, что витамин С, который препятствует переходу Fe²⁺ в Fe³⁺ препятствует этим нежелательным процессам.

Недостаток железа в организме невозможно не заметить. При дефиците железа у человека проявляются следующие явные симптомы: бледная и сухая кожа с проявлениями шелушения, хрупкие ногти и ломкие волосы, нарушенная концентрация внимания и низкая работоспособность, хроническая усталость и отсутствие интереса к окружающим, одышка и чувство онемения, инфекционные заболевания и частая простуда, отсутствие аппетита и затруднённое глотание, кишечные нарушения и нарушенное кровоснабжение.

Кроме того, при дефиците железа нарушается способность организма превращать бета-каротин в витамин А. Железо необходимо для синтеза гормонов щитовидной железы, регулирующие метаболические процессы в организме. Поэтому при его дефиците происходит нарушение обмена веществ, что, в свою очередь, приводит к избыточному весу.

Содержание железа в продуктах питания позволяет человеку определить и контролировать суточное употребление определённых продуктов. Такая предусмотрительность необходима для того, чтобы не пошёл обратный процесс, – избыток железа в организме. При таком явлении происходит сбой в работе некоторых органов. Избыток железа (гемохроматоз) в организме проявляется следующим образом: во-первых, меняется цвет лица, он приобретает либо желтоватый цвет, либо коричневатый, во-вторых, наблюдается увеличение печени. Кроме того человека начинает беспокоить зуд тела, нарушатся сердечный ритм, появляется одышка, нехватка воздуха [3].

Таким образом, во избежание развития железодефицитной анемии, а также в профилактических целях, необходимо употреблять в пищу продукты питания, в которых содержатся ионы железа. Необходимо учесть, что в любой пище животного происхождения (мясо, рыба, яйца) содержится преимущественно так называемое гемовое железо, которое почти полностью уходит на синтез гемоглобина. Негемовое железо, содержащееся в растительной пище, для синтеза гемоглобина используется лишь частично и только при достаточном количестве в рационе аскорбиновой кислоты.

Химический элемент цинк Zn входит в состав инсулина, то есть при его недостатке развивается диабет. Кроме того цинк входит в состав многих ферментов. Так при его участии происходит удаление избытка СО₂ из клеток (без него невозможно дыхание), образование соляной кислоты в желудке (без него невозможно пищеварение) и так далее. Он необходим для нуклеиновых кислот. Рекомендуемое ежедневное количество потребления цинка составляет от 15 до 20 мг и обычно присутствует в съедаемых нами продуктах. Недостаток цинка ведёт к ослаблению иммунной системы [2, 3]. Цинк необходим для продукции спермы и мужских гормонов; для метаболизма витамина E; для расщепления алкоголя в организме, так как входит в состав алкогольдегидрогеназы; он важен для нормальной деятельности простаты; он участвует в синтезе разных анаболических гормонов в организме, включая инсулин, тестостерон и гормон роста.

Цинк необходим для нормального восприятия органов вкуса. Околоушная слюнная железа вырабатывает цинксодержащий белок – густин, играющий важную роль в процессах вкусовой чувствительности. При недостатке цинка ухудшается обоняние, вплоть до его полной потери. Цинк стимулирует деление клеток.

Цинку свойственна немалая антиоксидантная активность (как и селену, витаминам С и B и др.) за счёт того, что он входит (наряду с медью) в состав фермента супероксиддисмутазы, препятствующего образованию агрессивных активных форм кислорода. Кроме того, при дефиците цинка возникает угнетение процессов сперматогенеза. Поэтому в начальный период полового созревания, когда формируются половые органы, мальчикам требуется повышенное количество цинка. У мужчин недостаток этого элемента приводит к бесплодию.

Цинк чрезвычайно необходим и женщинам, так как входит в состав нервных окончаний, воспринимающих женские половые гормоны (эстрогены).

Химический элемент медь Cu входит в состав около 30 ферментов. Медь незаменима при кроветворении. Так особый белок, без которого невозможно усвоение железа, содержит 8 атомов меди. Особенно много меди концентрируется в головном мозге и печени. Роль меди в деятельности ЦНС⁶ до конца не выяснена, но её недостаток провоцирует болезнь Паркинсона, а избыток приводит к тяжёлому отравлению, связанному с нарушением функции мозга (болезнь Вильсона). С этим элементом связаны такие тяжёлые заболевания, как эпилепсия и шизофрения. Медь «отвечает» за нормальную пигментацию, так как входит в состав фермента тирозиназа.

Медь необходима для здоровья организма. Она участвует в транспортировке кислорода в клетки. Медь нужна в эндокринных и биохимических процессах, необходима для роста и развития костной и соединительной ткани, для работы мозга, сердца, внутренних органов.

Медь стимулирует иммунную систему организма для защиты от инфекций, улучшает регенерацию тканей. Медь помогает нейтрализовать свободные радикалы, разрушающие клетки. Медь очень важна для энергетических процессов в организме, для правильной работы нервной системы.

Медь входит в состав красящего пигмента волоса. При недостатке меди ухудшается цвет волос. Волосы становятся неяркими, тусклыми.

Медь поддерживает баланс других полезных веществ в организме, таких как молибден и цинк. Если в организме цинка больше, чем меди, то он не даёт меди усваиваться, поэтому дополнительный приём цинка должен сопровождаться приёмом препаратов меди.

По рекомендации ВОЗ⁷ суточная потребность в меди для взрослых составляет 1,5 мг. Дефицит меди в организме может развиваться при недостаточном поступлении этого элемента (1 мг/сутки и менее).

Химический элемент марганец Mn является «витамином» для витамина С, так как необходим для его синтеза. Как и магний марганец необходим для фотосинтеза, участвует в синтезе ДНК и часто является причиной мутаций, как желательных, так и нежелательных.

Химический элемент молибден Mo – тот самый элемент, который необходим растениям для фиксации азота. У животных он участвует в азотистом обмене, причём в норме он необходим для синтеза компонентов нуклеотидов, а в избытке способствует заболеванию подагрой. Этот же элемент входит в состав фермента, который защищает нас от альдегидов⁸ – ядовитых веществ образующихся при окислении спиртов.

Нахождение того или иного элемента в организме и доля его в нём зависит от следующих факторов:

- нахождение элемента в природе в доступной, например, водорастворимой форме;

- способностью организма поглощать данный элемент;

- способностью организма удерживать (накапливать) данный элемент.

Биогенные элементы являются связующим звеном между живой и неживой природой, что определяется постоянным круговоротом этих элементов в биосфере. Открытость геосистем, а также их функционирование обеспечивают круговорот веществ, знание которого необходимо для оценки техногенных воздействий на окружающую среду, в том числе и при изучении поступления, трансформации и переноса загрязняющих веществ, среди которых особое место занимают тяжёлые металлы.

Раздел 2 ТЯЖЁЛЫЕ МЕТАЛЛЫ КАК ТОКСИКАНТЫ

2.1 Проблема загрязнение окружающей среды ионами тяжёлых металлов

В настоящее время загрязнение тяжёлыми металлами и их солями –наиболee распространённое xимическое загрязнение окружающей среды, сильнeйшее пo дeйcтвию на всё живое [1, 2]. В научных и прикладных работах авторы по-разному трактуют значение этого понятия. B cвязи с этим количествo химических элементoв, относимых к группe тяжёлых металлoв, можeт изменятьcя в шиpоких предeлах [6]. В качестве критериев пpинадлежности испoльзуются многoчисленные характеристики: атомная масса, плотность, токсичность, распространённость в природной среде, степень вовлечённости в природные и техногенные циклы [7].

В исследованиях, посвящённых проблемам загрязнения окружающей среды, на сегодняшний день к тяжёлым металлам относят более 40 металлов периодической системы Д.И. Менделеева⁹ с атомной массой свыше 50 атомных единиц. При этом немаловажную роль в категорировании тяжёлых металлов играют условия: высокая токсичность для живых организмов в относительно низких концентрациях, способность к биоаккумуляциии биомагнификации¹⁰. Так, в ставших уже классическими работах Ю.А. Израэля¹¹, 1979 г. в перечне химических веществ, подлежащих определению в природных средах на фоновых станциях в биосферных заповедниках, в разделе «тяжёлые металлы» названы Pb, Hg, Cd, As. С другой стороны, согласно решению Целевой группы по выбросам тяжёлых металлов, работающей в рамках Европейской Экономической Комиссии ООН и занимающейся сбором и анализом информации о выбросах загрязняющих веществ в европейских странах, только Zn, As, Se и Sb были отнесены к тяжёлым металлам. По определению Н. Реймерса¹² отдельно от тяжёлых металлов стоят благородные и редкие металлы, соответственно, остаются только Pb, Cu, Zn, Ni, Cd, Co, Sb, Sn, Bi, Hg. В прикладных работах к числу тяжёлых металлов чаще всего добавляют Pt, Ag, W, Fe, Au, Mn. По классификации Н. Реймерса, тяжёлыми следует считать металлы с плотностью более 8 г/см³.

Таким образом, к тяжёлым металлам относятся: свинец, цинк, кадмий, ртуть, молибден, хром, марганец, никель, олово, кобальт, титан, медь, ванадий и другие [6]. Это металлы со сравнительно большой атомной массой, включаясь в круговорот веществ и накапливаясь в природной среде, ведут к её загрязнению и являются потенциально токсичными для всех живых организмов [4]. Большой интерес представляют металлы, которые широко используются в производственной деятельности и в результате накопления во внешней среде представляют опасность с точки зрения их биологической активности и токсических свойств. К ним относят свинец, ртуть, кадмий, цинк, висмут, кобальт, никель, медь, олово, сурьму, ванадий, марганец, хром, молибден и мышьяк (табл. 1).

Таблица 1 – Биогеохимические свойства тяжёлых металлов

Свойство	Cd	Co	Cu	Hg	Ni		Zn
Биохимическая активность	В	В	В	В	В	В	В
Токсичность	В	У	У	В	У	В	У
Канцерогенность	-		-	-		-	-
Обогащение аэрозолей		H			H
Минеральная форма распространения			H		H		H
Органическая форма распространения
Подвижность		H	У	В	Н	В	У
Тенденция к биоконцентрированию	В	В	У	В	В	В	У
Эффективность накопления	В	У	В	В	У	В	В
Комплексообразующая способность	У	Н	В	У	Н	Н	В
Склонность к гидролизу	У	Н	В	У	У	У	В
Растворимость соединений	В	Н	В	В	Н	В	В
Время жизни	В	В	В	Н	В	Н	В
Условные обозначения: В– высокая, У – умеренная, Н – низкая

В атмосферном воздухе тяжёлые металлы присутствуют в форме органических и неорганических соединений в виде пыли и аэрозолей, а также в газообразной элементной форме (ртуть).

В водных средах металлы присутствуют в трёх формах: взвешенные частицы, коллоидные частицы и растворённые соединения. Значительная часть тяжёлых металлов переносится поверхностными водами во взвешенном состоянии.

Сорбция тяжёлых металлов донными отложениями зависит от особенностей состава последних и содержания органических веществ. В итоге тяжёлые металлы в водных экосистемах концентрируются в донных отложениях и биоте.

В почвах тяжёлые металлы содержатся в водорастворимой, ионообменной и непрочно адсорбированной формах. Водорастворимые формы, как правило, представлены хлоридами, нитратами, сульфатами и органическим комплексными соединениями. Добыча и переработка не являются самым мощным источником загрязнения среды металлами. Главным источником поступления в биосферу многих металлов является процесс сжигания органического топлива. Металлы присутствуют в угле и нефти. Токсичные химические элементы, включая тяжёлые металлы, обнаруживаются в золе топочных устройств, электростанций. Тяжёлые металлы содержатся и в минеральных удобрениях, сточных водах. Металлы сравнительно быстро накапливаются в почве и крайне медленно из неё выводятся: период полуудаления цинка – до 500 лет, кадмия – до 1100 лет, меди – до 1500 лет, свинца – до нескольких тысяч лет.

Техногенное поступление тяжёлых металлов в окружающую среду происходит в виде газов и аэрозолей (возгона металлов и пылевидных частиц) и в составе сточных вод. По мере удаления от источника загрязнения наиболее крупные частицы оседают, доля растворимых соединений металлов увеличивается, и устанавливаются соотношения между растворимой и нерастворимыми формами. Аэрозольные загрязнения, поступающие в атмосферу, удаляются из неё путём естественных процессов самоочищения. Важную роль при этом играют атмосферные осадки. В итоге выбросы в атмосферу, сбросы сточных вод создают предпосылки для поступления тяжёлых металлов в почву, подземные воды и открытые водоёмы, растения и т. д. Дальность распространения и уровни загрязнения атмосферы зависят от мощности источника, условий выбросов и метеорологической обстановки. В условиях урбанизированных зон суммарный эффект от регистрируемого загрязнения воздуха является результирующей сложения множества полей рассеяния и обусловлен удалением от источников выбросов, градостроительной структурой и наличием необходимых санитарно-защитных зон вокруг источников загрязнения. Фоновое содержание свинца принято равным 0,006 мкг/м³, ртути 0,001–0,8 мкг/м³ (в городах – на несколько порядков выше). Атмосферный путь поступления химических элементов в окружающую среду городов является ведущим. Другая часть поступает в бессточные водоёмы, где тяжёлые металлы накапливаются и становятся источником вторичного загрязнения, то есть образования опасных загрязнений в ходе физико-химических процессов, идущих непосредственно в среде, например, первоначально ртуть попадает в океан в виде Нg²⁺, затем она взаимодействует с органическими веществами и с помощью анаэробных организмов переходит в токсичные вещества метилртуть (СН₃Нg)⁺ и диметилртуть (СН₃–Нg–СН₃). Ртуть присутствует не только в гидросфере, но и в атмосфере, так как имеет относительно высокое давление паров. Природное содержание ртути составляет ~0,003–0,009 мкг/м³ [3, 8, 9].

Тяжёлые металлы проникают в организм человека через слизистые оболочки, кожный покров, вдыхание отравлённого воздуха, либо с продуктами питания. Тяжёлые металлы очень легко всасываются из пищеварительного тракта, поступают в кровь, транспортируются во все жизненно важные органы и оседают в них. Это довольно длительный процесс. Самое большое количество солей тяжёлых металлов концентрируется в почках и печени, откуда они выводятся крайне медленно. Нередко такое воздействие приводит к развитию гепатита или нефропатии. Кроме того, эти химические элементы могут накапливаться в слюнных железах и слизистых оболочках полости рта, что провоцирует возникновение стоматита или гингивита [9, 10].

2.2 Взаимодействие микроорганизмов с ионами тяжёлых металлов

Так же, как и другим организмам, всем микроорганизмам в качестве компонентов питания необходимы те или иные тяжёлые металлы, например, такие, как кобальт, марганец, железо, медь, цинк.

Существуют два варианта локализации ионов металлов. Одни элементы, такие как медь, связываются в основном с клеточной поверхностью, другие же элементы, например, ртуть и железо, проникают внутрь клетки.

Существуют бактерии и грибы, которые вырабатывают специальные хелатообразующие вещества, облегчающие проникновение железа в клетку при нейтральных значениях рН. Это проникновение происходит в результате активного транспорта хелатного железа и распада хелата после его переноса через плазматическую мембрану.

Некоторые ионы металлов являются жизненно необходимыми для микроорганизмов. Так, например, ионы железа входят в состав 86 % белков микроба Ferroplasma acidiphilum, обитателя пиритовых месторождений. Исследователи показали, что аккуратное удаление ионов железа из этих белков приводит к сильному изменению их вторичной структуры (денатурации) и потере функциональной активности. Похоже на то, что почти все белки ферроплазмы держатся на «железных заклепках».

Подобная ситуация обнаружена для архебактерии Picrophilus torridus, а также из неродственного, но обитающего в таких же условиях микроорганизма – бактерии Acidithiobacillus ferrooxidans. При рассмотрении закономерностей взаимодействия тяжёлых металлов с микроорганизмами необходимо учитывать токсическое воздействие ионов тяжёлых металлов на микроорганизмы.

Основным проявлением токсического воздействия на микроорганизмы является задержка их роста и размножения, а также проявление бактерицидности ионов тяжёлых металлов, что ведет к гибели микроорганизмов. Выделяют несколько механизмов токсического действия тяжёлых металлов на микроорганизмы:

- ионы тяжёлых металлов могут играть роль антиметаболитов, в результате чего ингибируются определенные биохимические процессы, что сопровождается нарушением функции клеток и торможением клеточного роста;

- ионы тяжёлых металлов могут образовывать стабильные осадки (или хелаты) с важными метаболитами или катализировать распад таких метаболитов, в результате чего они становятся недоступными для клетки;

- ионы тяжёлых металлов способны замещать структурно или электрохимически важные элементы, что приводит к нарушению ферментативной или клеточной функции.

Микроорганизмы накапливают металлы по разным причинам. Известно, что микроорганизмы могут использовать металлы в качестве источников микроэлементов, энергии или акцепторов электронов. При окислении восстановленных соединений металлов, по крайней мере, некоторые микроорганизмы могут извлекать полезную энергию и восстанавливающую способность. При восстановлении окисленных соединений металлов ряд микробов осуществляет процесс, который является своеобразной формой дыхания. Предполагается, что накопление ионов тяжёлых металлов микроорганизмами является способом их детоксикации, которое осуществляется путём специфического связывания металла с особыми полимерами, синтез которых может индуцироваться тяжёлыми металлами, когда они выступают в роли стрессовых факторов. В результате окислительно-восстановительных процессов микроорганизмы переводят металлы из ионной формы в металлическую, образуя комплексы с органическими и неорганическими соединениями. Это аналогично механизму самозащиты, выработанному некоторыми морскими водорослями, которые умеют обезвреживать токсичные соединения мышьяка, связывая их с промежуточными продуктами фотосинтеза и откладывая в клеточных мембранах в виде безвредных производных.

Особую роль играет способность к накоплению металла в экологии группы пресноводных бактерий, обладающих свойством магнетотаксиса – движение вдоль силовых линий магнитного поля. Эти бактерии содержат цепочки магнетосом – скоплений магнетита диаметром до 500 ангстрем (рис. 1), которые, как магнитная стрелка, ориентируют бактерию в пространстве и определяют направление её передвижения в воде. Силовые линии земного магнитного поля проходят не строго горизонтально, а наклонены под тем или иным углом, бактерия, стремясь плыть к северу, в северном полушарии при этом «зарывается» в толщу воды, где, по-видимому, находит оптимальные условия для своего развития. Эти бактерии относятся к числу анаэробов и поэтому вынуждены избегать поверхностных слоёв воды, богатых кислородом.

Рисунок 1 – Магнетосомы – скоплениямагнетитадиаметромвцитоплазмебактерии

Aquaspirillummagnetotacticum

Говоря о способности к накоплению тяжёлых металлов, отмечаем, что микроорганизмы являются настоящими рекордсменами по извлечению металлов из окружающей среды. В природных условиях встречается большое количество микроорганизмов, которые адсорбируют от 30 % до 40 % ионов тяжёлых металлов на своей поверхности.

Способность аккумулировать металлы обнаружена среди условно-патогенных микроорганизмов, которая может быть избирательной. Так, штаммы Klebsiellaoxycota, Enterobacter cloacae, Aeromonashydrophilaи Escherichiacoliаккумулируют ионы свинца в количестве: 52,5 мг/г, 156 мг/г, 565 мг/г, 735 мг/г, сухого вещества соответственно, а ионы селена в количестве: 97,5 мг/г, 60 мг/г, 80 мг/г и 425 мг/г сухого вещества соответственно. Микроорганизмы рода Staphylococcus аккумулируют широкий спектр металлов (ртуть, свинец, цинк, кобальт, медь и хром) и не характеризуются избирательностью.

Адсорбционная способность свойственна некоторым представителям рода Pseudomonas, которые способны накапливать такие тяжёлые металлы как: свинец, кадмий, медь, золото, никель, цинк. Например, штамм P.putida накапливает ионы меди в количестве до 100 мг/г сухого веса бактериальной биомассы. Что касается ионов никеля, кадмия и свинца, то их содержание на 1 г сухого веса бактериальной массы составляет до 18, 54 и 57,5 мг соответственно.

P. aeruginosa сорбирует ионы свинца в количестве до 45 мг/г сухого веса биомассы, ионы кадмия в количестве 12 мкг/г, а также ионы никеля в количестве 25 мкг/г сухого веса биомассы [11].

P.pseudoalcaligenes достаточно хорошо аккумулирует ионы свинца и меди, их количества достигают 271,7 мг/г и 46,8 мг/г сухой биомассы соответственно [11].

Некоторые микроорганизмы рода Citrobacter способны адсорбировать ионы свинца, цинка и кадмия в количестве 11,8 %, 84,3 % и 33,4 % соответственно.

Способность адсорбировать тяжёлые металлы отмечается и у дрожжей. Так, штаммы Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis и Saccharomyces bergensis способны удалять из сточных вод до 99,8 % ионов меди, серебра и кобальта, если их изначальная концентрация составляла от 3 до 60 мг/л, от 40 до 195 мг/л и 10 мг/л соответственно.

Микроорганизмы способны накапливать тяжёлые металлы, в том числе и радиоактивные.

Микробная аккумуляция металлов является ключевым моментом в геохимической и биологической рециркуляции этих элементов, что имеет большое практическое значение в вопросах очистки и восстановления компонентов окружающей среды.

Положительные эффекты биоаккумуляции заключается в детоксикации металлов в окружающей среде с последующей выгодой для более чувствительных видов. Отрицательное воздействие заключается в передаче металлов на более высокие трофические уровни, что может привести к увеличению ядовитых эффектов этих элементов.

2.3 Материалы и методы исследования

2.3.1 Материалы, используемые в экспериментах

В работе использовались микроорганизмы Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, а также соли тяжёлых металлов.

2.3.2 Escherichia сoli

Escherichia coli– это грамотрицательные бактерии, факультативные анаэробы, не образующие эндоспор, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae, роду Escherichia. Клетки палочковидные, со слегка закруглёнными концами, длина клеток от 0,4 до 0,8 мкм, ширина от 1 до 3 мкм, объём клетки составляет от 0,6 до 0,7 мк/м³ [6].

E.coli является обычным обитателем кишечника многих млекопитающих, в частности, приматов, к числу которых принадлежит и человек. Поэтому её частоназывают кишечной палочкой. В организме E.coli выполняет полезную роль, подавляя рост вредных бактерий и синтезируя некоторые витамины. Оптимальный рост достигается культурами E. Coli при температуре 37 C, некоторые штаммы могут делиться при температурах до 49 C. Кишечная палочка может жить на разных субстратах. Бактерии группы кишечной палочки не устойчивы к высокой температуре, при 60 °С гибель их наступает через 15 минут, при 100 °С – мгновенно. Сохраняемость кишечной палочки при низких температурах и в различных субстратах внешней среды изучена недостаточно. По некоторым данным в воде и почве кишечная палочка может сохраняться несколько месяцев [6].

2.3.3Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus – грамположительные неспорообразующие факультативные анаэробы с высокой ферментативной активностью, встречаются изолированно, парами, различных размеров цепочками с округлыми краями, неподвижны. Не растут на простых питательных средах. На среде Лактобакагар образуют белые иногда кремовые колонии с ровными краями диаметром 1,0 мм через 44 часа инкубации при температуре 37 °С. В жидких средах образуют белый осадок и помутнение бульона [6].

2.3.4 Металлы

В качестве регулирующих факторов в работе использовались соли тяжёлых металлов: FeSO₄ – сульфат железа, ZnSO₄ – сульфат цинка, Pb(NO₃₎₂ – нитрат свинца, CuSO₄ – сульфат меди, CdSO₄ – сульфат кадмия.

При выборе таких металлов как свинец, кадмий исходили из того, что они являются наиболее распространёнными и опасными загрязнителями окружающей среды. Выбор остальных был связан с тем, что они находились в одном ряду или в одном порядке периодической системы Менделеева со свинцом и кадмием, а также косвенно тем, что в повышенных концентрациях способны давать токсический эффект.

2.4 Методы исследований

2.4.1 Метод последовательных разведений

Метод последовательных разведений был использован для определения минимальных подавляющих концентраций солей тяжёлых металлов на рост исследуемых микроорганизмов.

Для выполнения данного этапа работы предварительно были приготовлены: стерильная жидкая питательная среда, стерильные пробирки – по 13 штук для каждой серии разведений, стерильные растворы тяжёлых металлов, взвеси культур микроорганизмов (E. coli, L. acidophilus).

Для приготовления растворов солей исследуемых металлов взвешивались навески, исходя из расчётов, и растворялись в 100 мл дистиллированной воды. Растворы автоклавировались при 120 С, в течении 15 минут.

Эксперимент проводился в трёх повторностях.

Учёт результатов проводился визуально, при этом отмечалось наличие роста (при сравнении с контролем роста микроорганизма) или его отсутствие (при сравнении с контролем среды). Затем отмечалась последняя пробирка с полной видимой задержкой роста микробов. Количество солей тяжёлых металлов в этой пробирке является минимальной подавляющей концентрацией для испытуемого штамма.

2.4.2 Фотоэлектроколориметрический метод

Для определения оптической плотности бактериальной суспензии с целью дальнейшего построения кривой роста в периодической культуре нами был использован фотоэлектроколориметр (ФЭК-КФК-2).

Для проведения данного этапа работы предварительно были приготовлены: стерильные пузырьки объёмом 200 мл, стерильная жидкая питательная среда, суточные культуры микроорганизмов, стерильные растворы металлов.

Эксперименты проводились в трёх повторностях. Бактерии выращивались с применением периодического метода культивирования. Измерение оптической плотности бактериальной суспензии проводилось с интервалом в три часа, начиная с нулевого часа, и продолжалось до получения трёх приблизительно равных значений, что означало наступление стационарной фазы. В промежутки времени между измерениями пузырьки ставились в термостат при температуре 37 С на шейкеры (Shaker) для постоянного перемешивания.

2.4.3 Атомно-абсорбционный метод [12]

Метод основан на свойстве атомов химических элементов, образующихся при распылении зольных растворов в пламя ацетилен-воздух, поглощать свет определённой длины волны. В качестве атомно-абсорбционного спектрофотометра использовался прибор типа AAS-1 (ГДР) с набором спектральных ламп.

Подготовка к анализу требует приготовления 20 %-ного раствора азотной кислоты, 5 %-ного раствора KOH, стандартных растворов металлов и суточных культур исследуемых микроорганизмов.

Для приготовления проб предварительно в жидкой питательной среде с рабочей концентрацией солей тяжёлых металлов выращивались бактерии с применением периодического метода культивирования. При наступлении стационарной фазы бактерий, содержимое пузырьков центрифугировалось 30 минут при 3000 оборотах. Супернатант отделялся от биомассы. Анализу подвергались как супернатант так и биомасса. Биомасса бактерий дополнительно лизировалась 5 %-ным раствором КОН и дальнейшим кипячением на водяной бане в течении 20 минут.

Для проведения анализа спектрофотометр настраивался, к работе приступали через 20 минут после включения, предварительно фотометрировали стандартные, затем испытуемые растворы. За результат анализа по каждому элементу принималось среднее значение серии измерений [6].

2.4.4 Методы статистической обработки данных

Статистическую обработку данных осуществляли при помощи общепринятых математических методов с использованием пакета программ Microsoft Office.

Раздел3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Определение субингибиторных концентраций тяжёлых металлов на рост бактерий E.Coli, L.Acidophilus

Для определения субингибиторных концентраций тяжёлых металлов был использован метод последовательных разведений, что позволило нам получить различные концентрации начального 0,02 М/л раствора соли металла.

Получение ряда разведений растворов тяжёлых металлов было необхо­димо с целью определения бактерицидных и бактериостатических концентра­ций в отношении исследуемых микроорганизм, а также концентраций, которые не оказывают влияния на рост. Это позволило создать оптимальные условия для культивирования исследуемых микроорганизмов в присутствии солей тяжёлых металлов.

В пробирках, где среда оставалась прозрачной (сравнивали с контролем среды) и роста не отмечалось, что свидетельствовало о том, что разведение соли тяжелого металла оказывало бактерицидное действие. Если же отмечался обильный рост в виде осадка (сравнивали с контролем роста микроорганизма), то считали, что данное разведение не оказывает влияния на рост исследуемых микроорганизмов. Разведение, в котором отмечался скудный рост данных бактерий, считали субингибиторной концентрацией (СИК).

В соответствии с приложением А (табл. А.1), следует, что концентрации солей свинца расположенные в анализируемом диапазоне до концентрации 0,005 М/л оказывали бактерицидный эффект на E.coli. Такой же эффект оказывали концентрации солей железа, меди и цинка, расположенные в анализируемом диапазоне до концентрации 0,0025 М/л, концентрации кадмия – до концентрации 0,0003 М/л.

Из данных, представленных в приложении А (табл. А.4), следует, что бактерицидный эффект на L.acidophilus оказывали концентрации солей железа и свинца, расположенные в диапазоне до концентрации 0,0025 М/л. Концентрации солей цинка оказывали бактерицидный эффект на L.acidophilus до концентрации 0,00125 М/л, концентрации солей меди и кадмия до 0,0003 М/л. Рост же исследуемого штамма отмечается при меньших концентрациях.

Концентрации солей металлов, располагающиеся между бактерицидными и концентрациями при которых наблюдался рост исследуемых микроорганизмов, являлись бактериостатическими или СИК. Определение данных концентраций позволяло судить о степени токсичности того или иного металла.

Так, исходя из данных представленных в приложении А, следует, что из всех исследуемых микроорганизмов наиболее чувствительным штаммом по отношению ко всем используемым металлам являлся L.acidophilus. Металлами, проявляющими наименьшую токсичность в отношении E.coliявлялись железо, цинк, свинец и медь.

Таким образом, в результате проведенного эксперимента были установлены рабочие концентрации солей тяжёлых металлов, что позволило создавать оптимальные условия для роста исследуемых штаммов. В качестве рабочей концентрации (РК) в дальнейшем использовали концентрацию на порядок ниже той концентрации, которая характерна для пробирки с СИК.

3.2 Изучение влияния солей тяжёлых металлов на динамику роста исследуемых микроорганизмов

Как известно, процесс накопления металлов микроорганизмами осуществляется в стационарной фазе роста. Процесс накопления связан с тем, что в данной фазе наблюдается истощение субстрата и накопление токсичных продуктов, что вынуждают бактерии к поиску других источников энергии и детоксикации среды обитания. В связи с этим следующим этапом нашей работы являлось определение фаз роста, с целью выявления оптимального времени роста на периодической культуре, а также влияние солей тяжелых металлов на динамику роста исследуемых микроорганизмов.

Определение оптимального времени роста на периодической культуре осуществлялось путем культивирования исследуемых штаммов в периодической культуре на жидкой питательной среде и измерении оптической плотности каждые 3 часа, начиная с нулевого часа. Измерения велись до тех пор, пока не было получено не менее трех приблизительно одинаковых значений оптической плотности, что свидетельствовало о наступлении стационарной фазы роста. По полученным результатам для каждого штамма были выстроены кривые роста.

Исходя из полученных графиков следует, что лаг-фаза E.coli длилась около 3 часов, а у лактобактерий – 18 часов. Продолжительность эспоненциальной фазы роста составляла для E.coli 6 часов, для лактобактерий 12 часов. Стационарная фаза у E.coliнаступала через 24 часа культивирования, у L.acidophilusчерез 36 часов.

Изучение влияния солей тяжелых металлов на динамику роста исследуемых бактерий проводилось аналогично, для этого в среду культивирования вносилась РК исследуемого металла и осуществлялось культивирование до наступления стационарной фазы роста.

Анализ полученных данных свидетельствует, что влияние солей тяжёлых металлов на время наступление и продолжительность фаз роста неоднозначно, при этом стимулирующее действие на рост E.coliоказывали ионы свинца и железа (рис. 2). Продолжительность лаг-фазы составляла2 часа, экспоненциальной фазы – 13 часов, фазы замедленного роста – 3 часа. Стационарная фаза наступала через 18 часов культивирования.

Противоположное действие на рост оказывал ион кадмия. Наблюдалось замедление роста микроорганизмов. Так лаг-фаза длится 3 часа, экспоненциальная фаза – 9 часов, фаза замедленного роста – 15 часов. Стационарная фаза наступала через 27 часов культивирования. Ионы цинка и меди влияния на динамику роста не оказывали.

Рисунок 2 – Влияние солей тяжелых металлов на рост E.coliв периодической культуре

Что касаемо L.acidophilus,то стимулирующее действие оказывали железо и свинец (рис. 3). Продолжительность лаг-фазы составляла 18 часов, экспоненциальной фазы – 12 часов, фаза замедленного роста длилась 3 часа, а стационарная фаза наступала через 33 часа культивирования.

Увеличению же времени наступления и продолжительности фаз роста способствовало присутствие ионов кадмия и меди. Так продолжительность лаг-фазы составляла 21 час, экспоненциальной фазы – 15 часов, фазы замедленного роста – 3 часа, стационарная фаза наступала через 39 часов культивирования. Ионы цинка влияния на динамику роста данного микроорганизма не оказывали.

Рисунок 3 – Влияние солей тяжелых металлов на рост L.acidophilusв периодической культуре

3.3 Изучение способности исследуемых микроорганизмов накапливать тяжёлые металлы в биомассе при их совместном культивировании

Следующим и основным этапом в нашей работе являлось определение количества металлов аккумулируемых исследуемыми бактериями из питательной среды. Количественное определение металлов осуществлялось с помощью атомно-абсорбционного метода и анализу подвергались как биомасса, так и супернатант. Для этого в среду для культивирования вносился один из анализируемых металлов в РК и осуществлялось культивирование до наступления стационарной фазы роста. По окончанию культивирования пробы подвергались обработке и анализировались на ААСФ.

Далее в результате проведения эксперимента мы получили данные, из которых следует, что из всех анализируемых металлов все исследуемые микроорганизмы наиболее активно аккумулировали ионы железа (рис. 4, 5). Показатели накопления ионов железа для L.acidophilusи E.coliсоставляют 44,3 % и 68,7 % соответственно.

Также исследуемыми культурами активно аккумулировались ионы свинца (рис. 4, 5).

Рисунок 4 – Содержание металлов в биомассе L.acidophilus и в супернатанте

Рисунок 5 – Содержание металлов в биомассе E.coli и в супернатанте

Сравнив значения накопления ионов цинка можно отметить, что из исследуемых микроорганизмов, наиболее активно накапливал штамм E.coli.

В отношении двух оставшихся металлов (меди и кадмия) можно отметить, что процент их накопления исследуемыми штаммами не значителен.

Таким образом, из полученных данных следует, что из данной группы солей тяжелых металлов всеми исследуемыми культурами только 2 металла интенсивно извлекались из культуральной жидкости. Наиболее активно аккумулировалось железо, на втором месте находится свинец. Ионы меди, цинка, кадмия практически не накапливались данными микроорганизмами.

Также из полученных данных следует, что лучшими биосорбентами ионов железа и свинца являлся штамм E.coli.

3.4 Изучение способности исследуемых микроорганизмов к избирательному накоплению ионов тяжёлых металлов

Особенностью микроорганизмов при взаимодействии с ионами металлов является не только способность к их аккумуляции, но и способность к избирательности при их накоплении.

Определение избирательности в накоплении микроорганизмов также осуществлялось с помощью атомно-абсорбционного метода. Отличия от предыдущего эксперимента заключают в том, что в среду для культивирования одновременно вносились все исследуемые металлы в РК, а также в сроках культивирования. Время культивирования для данного эксперимента определялось путем изучения динамики роста исследуемых микроорганизмов в присутствии всех используемых металлов и установления времени наступления стационарной фазы роста.

Из данных, представленных на рис. 6 следует, что лаг-фаза E.coli длилась примерно 3 часа, L.acidophilusпримерно 18 часов. Экспоненциальная фаза роста длилась у E.coliпримерно 6 часов, у L.acidophilusпримерно 12 часов. Стационарная фаза у E.coliнаступает через 24 часа культивирования, а у L.acidophilusчерез 36 часов.

Рисунок 6 – Влияние солей тяжелых металлов на динамику роста E.coli, L.acidophilus.

Из полученных данных следовало, что одновременное присутствие ионов всех анализируемых металлов не оказывало значительного влияния на динамику роста исследуемых штаммов, а данные по времени наступления и продолжительности фаз роста совпадают с данными полученными в контрольных образцах. В связи с этим количественное определение анализируемых металлов для E.coliосуществлялось через 24 часа, L.acidophilus через 36 часов культивирования.

В результате проведенного эксперимента были получены данные, из которых следует, что в присутствии всех используемых нами металлов все исследуемые микроорганизмы избирательно аккумулировали ионы железа и свинца (рис. 7). Из полученных данных следует, что исследуемые микроорганизмы практически не накапливали ионы меди и кадмия.

Степень накопления ионов цинка ниже, чем у ионов железа и свинца, но значительно выше, чем у ионов меди и кадмия.

Рисунок 7 – Содержание солей тяжелых металлов в биомассе исследуемых микроорганизмов

Многие металлы могут сорбироваться на клетках микроорганизмов именно потому, что они токсичны и их надо как-то нейтрализовать. Это объясняется тем, что тяжёлые металлы проявляют токсичность, находясь в виде ионов. Если же их перевести в связанную форму, они лишаются токсических свойств. Следовательно, чем токсичнее металл, тем быстрее нужно его нейтрализовать, потому что он будет быстро накапливаться. Это является механизмом самозащиты, выработанный некоторыми морскими водорослями, которые умеют обезвреживать токсичные соединения мышьяка, связывая их с промежуточными продуктами фотосинтеза и, откладывая в клеточных мембранах в виде безвредных производных. Итак, металл, отложенный в клеточной стенке в кристаллическом виде или в виде плохо растворимых химических соединений, оказывается безвредным для микрорганизма [11, 12].

Данный вывод подтверждает факт накопления исследуемыми микроорганизмами ионов свинца, но не объясняет то, почему изучаемые штаммы практически не накапливают ионы меди, кадмия хотя степень их токсичности примерно равна токсичности свинца. Возможно это связано с прочностью их адсорбции, которая соответствует ряду Рb больше Сu больше Cd, а также с неадаптированностью систем клетки к нейтрализации данного металла.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время проблема техногенного загрязнения биосферы тяжёлыми металлами приобрела большую актуальность в связи с резким ухудшением состояния окружающей среды и негативным воздействием на здоровье человека и животных. Попадая в воздух, воду и почву, металлы способны накапливаться в различных биологических системах, в том числе и в организме человека, это приводит к губительным последствиям. Факт активного накопления металлов установлен для многих организмов. Особенно хорошо развита эта способность у микроорганизмов. Данная работа выявила способности микроорганизмов E.coli,L.acidophilusк биоаккумуляции тяжёлых металлов в условиях invitro, способствовала выявлению эффективности их применения для снижения их концентрации. В ходе исследования на определение жизнеспособности исследуемых штаммов в присутствии различных концентраций солей используемых металлов было установлено, что самым чувствительным штаммом является Lacidophilus.

В ходе экспериментальной проверки установлено, что менее токсичными металлами из всех исследуемых являются железо и свинец, а наиболее токсичными является кадмий. При определении влияния солей тяжёлых металлов на динамику роста исследуемых штаммов было выявлена неоднозначность их действия на время наступления и продолжительность фаз роста. Так, присутствие ионов свинца и железа оказывает стимулирующее действие на рост всех исследуемых микроорганизмов, а присутствие ионов кобальта, меди и кадмия угнетает их рост. Присутствие ионов хрома, никеля, цинка и марганца не оказывает влияния на динамику роста исследуемых штаммов.

Изучение способности к накоплению ионов тяжёлых металлов показало, что из данной группы солей тяжёлых металлов всеми исследуемыми культурами только 2-го металла интенсивно извлекаются из культуральной жидкости. Наиболее активно аккумулируется железо, на втором месте находится свинец. Ионы меди, цинка, кадмия практически не накапливались данными микроорганизмами. Из полученных данных следует, что лучшими биосорбентами ионов железа и свинца являлись штаммы E.coli.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Рабочая программа учебной дисциплины «Экология» / О.И. Сапходоева, Е.Н. Френкель, М.И. Кучер. – Вольск: ВВИМО, 2014. – 16 с.

2 Кучер, М.И. Экология: учеб. пособие / М.И. Кучер; под ред. проф. Е.Э. Френкеля – Вольск: ВВИМО, 2015. – 263 с.

3 Френкель, Е.Н. Изучение значения микро- и макроэлементов в питании военнослужащих в рамках дисциплины «Экология» / Е.Н. Френкель, М.И. Кучер, А.Н. Сорокина, Д.А. Денисюк // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. 2015. № 1. С.

4 Френкель, Е.Н. Химия : учеб. пособие / Е.Н. Френкель; под общ. ред. Сапходоевой О.И. – Вольск: ВВИМО, 2015. – 222 с.

5 Сизенцов, А.Н. Экологические аспекты аккумуляции свинца и цинка пробиотическими препаратами на основе бактерий рода Bacillus / А.Н. Сизенцов, А.И. Вишняков, А.Е. Новикова // Вестник ОГУ. – 2011. – № 4. – С. 7–9.

6 Никитина, Ю.Е. Исследование биоаккумуляции некоторых ионов тяжёлых металлов микроорганизмами / Ю.Е. Никитина, А.Р. Хамидуллин, О.И. Сапходоева, М.И. Кучер. Тамбов, 2015.

7 Научно-исследовательская работа «Формирование экологической компетентности будущих специалистов служб МТО при изучении экологии в военном вузе»: Заключительный отчёт. – Вольск: ВВИМО, 2014. – 170 с. – Инв. № 54 от 28.11.2014.

8 Хажеева, З.И. Особенности накопления тяжёлых металлов в воде, донных отложениях и биоте залива Черкалов сор оз. Байкал / З.И. Хажеева, Н.М. Пронин, С.Д. Урбазаева // Химия в интересах устойчивого развития. – 2005. – Т. 13. – № 1. – С. 95–102.

9 Будников, Г.К. Тяжёлые металлы в экологическом мониторинге водных систем / Г.К. Будников // Соровский образовательный журнал. – 2000. – № 5. – С. 23–29.

10 Алексеенко, В.А. Основные факторы накопления химических элементов организмами / В.А. Алексеенко // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7. – № 8. – С. 20–24.

11 Collins, M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approach for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins, G.R. Gibson // Am.J.Clin.Nutr. – 2003. – V. 69. – No 5. – P. 1052–1057.

12 Ливинская, С.А. Разработка метода подготовки проб к атомно-абсорбционному спектральному анализу для определения содержания тяжёлых металлов в растительных маслах / С.А. Ливинская, П.В. Владимирский, В.П. Данильчук / Вестник ВГУ. – 2005. – № 2. – С. 38–42.

Приложение А

Минимальные подавляющие концентрации солей и тяжёлых металлов, влияющие на рост исследуемых микроорганизмов

Таблица А.1 – Минимальные подавляющие концентрации тяжёлых металлов, влияющие на рост Escherichiacoli

В молях на литр

Штамм	Соли металлов	Концентрация
		0,02	0,01	0,005	0,0025	0,00125	0,000625	0,0003	0,0001
E.coli	FeSO4·H2O	-	-	-	±	+	+	+	+
	ZnSO4	-	-	-	±	+	+	+	+
	Pb(NO3)2	-	-	±	+	+	+	+	+
	CdSO4·8H2O	-	-	-	-	-	-	±	+
	CuSO4·5H2O	-	-	-	±	+	+	+	+
	Наномедь	-	-	-	-	-	-	±	+
«–» – отсутствие роста «±» – скудный рост «+» – есть рост

Таблица А.2 – Минимальные подавляющие концентрации тяжёлых металлов, влияющие на рост Lactobacillus acidophilus

Штамм	Соли металлов	Концентрация, моль/л
		0,02	0,01	0,005	0,0025	0,00125	0,000625	0,0003	0,0001
L. acidophilus	FeSO4·H2O	-	-	-	±	+	+	+	+
	ZnSO4	-	-	-	-	±	+	+	+
	Pb(NO3)2	-	-	-	±	+	+	+	+
	CdSO4·8H2O	-	-	-	-	-	-	±	+
	CuSO4·5H2O	-	-	-	-	-	-	±	+
	Наномедь	-	-	-	-	-	-	-	±
«–» – отсутствие роста «±» – скудный рост «+» – есть рост

Приложение Б

Влияние солей и наночастиц тяжёлых металлов

на рост Escherichia coli

Таблица Б.1 – Влияние солей железа и цинка на рост E.coli

Оптическая плотность в относительных единицах

Время, часы	Контроль	Соли тяжёлых металлов
		FeSO4·H2O	ZnSO4
0	0,001±0	0,005±0,001	0,002±0
3	0,164±0,0008	0,432±0,001***	0,006±0,001***
6	0,527±0,002	0,612±0,004**	0,276±0,004***
9	0,586±0,001	0,638±0,005*	0,348±0,003***
12	0,54±0,001	0,765±0,001***	0,359±0,001***
15	0,584±0,0005	0,872±0,002***	0,553±0,001***
18	0,604±0,006	0,925±0,001***	0,546±0,001***
21	0,641±0,0008	0,923±0,003***	0,547±0,001***
24	0,661±0,001	0,928±0,002***	0,544±0,001***
27	0,662±0,0006	0,927±0,001***	0,542±0,002***
30	0,662±0,001	0,945±0,002***	0,544±0,003***
33	0,663±0,001	0,949±0,004***	0,532±0,002***
36	0,652±0,002	0,939±0,003***	0,531±0,003***
39	0,644±0,0006	0,934±0,001***	0,532±0,001***
*P≤ 0,05, **P≤ 0,01,***P≤ 0,001

Таблица Б.2 – Влияние солей кадмия, меди и свинца на рост E.coli

Оптическая плотность в относительных единицах

Время, часы	Соли тяжёлых металлов
	CdSO4·8H2O	CuSO4·5H2O	Pb(NO3)2
0	0,001±0	0,001±0	0,003±0,001
3	0,012±0,001***	0,005±0,001***	0,452±0,002***
6	0,256±0,003***	0,35±0,005***	0,624±0,003**
9	0,388±0,003***	0,502±0,002***	0,721±0,002***
12	0,402±0,001***	0,57±0,001**	0,779±0,002***
15	0,418±0,001***	0,543±0,002**	0,876±0,001***
18	0,428±0,001***	0,605±0,005	0,945±0,001***
21	0,441±0,001***	0,621±0,001***	0,945±0,002***
24	0,435±0,001***	0,639±0,001**	0,943±0,001***
27	0,447±0,002***	0,687±0,001***	0,946±0,001***
30	0,438±0,002***	0,689±0,002**	0,948±0,002***
33	0,443±0,002***	0,684±0,001**	0,956±0,005***
36	0,441±0,002***	0,682±0,002**	0,951±0,004***
39	0,445±0,002***	0,684±0,002**	0,952±0,001***
*P≤ 0,05, **P≤ 0,01,***P≤ 0,001

Приложение В

Влияние солей и наночастиц тяжёлых металлов на рост

Lactobacillusacidophilus

Таблица В.1 – Влияние солей железа и цинка на рост L.acidophilus

Оптическая плотность в относительных единицах

Время, часы	Контроль	Соли тяжёлых металлов
		FeSO4·H2O	ZnSO4
0	0,001±0	0,001±0	0,001±0
3	0,001±0	0,0013±0,0003	0,0013±0,0003
6	0,0043±0,0003	0,0033±0,0014	0,004±0,0005
9	0,012± 0,0017	0,0186±0,0028	0,0136±0,0017
12	0,001±0,0008	0,023±0,00115**	0,016±0,004
15	0,028±0,0023	0,0306±0,003	0,018±0,0046
18	0,034±0,002	0,037±0,003	0,033±0,003
21	0,056±0,001	0,086±0,0003	0,059±0,001
24	0,102±0,001	0,0183±0,002***	0,123±0,001**
27	0,15±0,0008	0,232±0,001***	0,173±0,0015**
30	0,19±0,001	0,278±0,001***	0,189±0,001
33	0,25±0,001	0,322±0,001***	0,222±0,001***
36	0,28±0,001	0,321±0,001***	0,253±0,002**
39	0,283±0,0008	0,322±0,001**	0,255±0,002**
*P≤ 0,05, **P≤ 0,01,***P≤ 0,001

Таблица В.2 – Влияние солей кадмия, меди и свинца меди на рост L.acidophilus

Оптическая плотность в относительных единицах

Время, часы	Соли тяжёлых металлов
	CdSO4·8H2O	CuSO4·5H2O	Pb(NO3)2
0	0,001±0	0,001±0	0,001±0
3	0,0013±0,0003	0,0013±0,0003	0,0013±0,0003
6	0,0016±0,0006*	0,0016±0,0006*	0,005±0,0011
9	0,008±0,002	0,0046±0,0017	0,0246±0,0042
12	0,004±0,0011**	0,005±0,0023	0,025±0,00173*
15	0,0216±0,0052	0,02±0,005	0,0343±0,0023**
18	0,028±0,003	0,026±0,004	0,044±0,002**
21	0,042±0,002*	0,046±0,001*	0,095±0,001***
24	0,143±0,001***	0,156±0,001***	0,206±0,001***
27	0,155±0,001*	0,165±0,001**	0,255±0,001***
30	0,177±0,002*	0,189±0,001	0,303±0,001***
33	0,193±0,001***	0,213±0,002***	0,336±0,001***
36	0,215±0,001***	0,221±0,002***	0,335±0,001***
39	0,243±0,001***	0,251±0,001***	0,336±0,001***
*P≤ 0,05, **P≤ 0,01,***P≤ 0,001

1^ Моисе́ев Ники́та Никола́евич (1917–2000) – выдающийся российский математик, философ и эколог, академик.

2^ Биоаккумуляция – накопление организмом химических веществ, поступающих из окружающей среды в концентрации большей, чем находится в окружающей среде. Используется для обозначения накопления именно загрязняющих веществ. Интенсивность биоаккумуляции характеризуется коэффициентом биологического накопления (отношение концентрации в организме к концентрации в среде).

3^ In vitro (с лат. – «в стекле») – это технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» – вне живого организма. В общем смысле этот термин противопоставляется термину in vivo – эксперимент на живом организме (на человеке или на животной модели). Многие эксперименты проводятся вне организма, на культуре живых клеток или в бесклеточной модели.

4^ Дезоксирибонуклеи́новая кислота́ (ДНК) – макромолекула (одна из трёх основных, две другие – РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.

5^ Ксенобиотики (от греч. ξένος – чуждый и βίος – жизнь) – условная категория для обозначения чужеродных для живых организмов химических веществ, естественно не входящих в биотический круговорот.

6^ Центра́льная не́рвная систе́ма (ЦНС) – основная часть нервной системы животных (в том числе человека), состоящая из нейронов и их отростков; у беспозвоночных представлена системой тесно связанных между собой нервных узлов (ганглиев), у позвоночных животных (включая людей) – спинным и головным мозгом.

7^ Всеми́рная организа́ция здравоохране́ния (ВОЗ, англ. – World Health Organization, WHO) – специальное учреждение Организации Объединённых Наций, состоящее из 194 государств-членов, основная функция которого лежит в решении международных проблем здравоохранения населения Земли.

8^ Альдегиды [сокр. от новолат. Al (cohol)dehyd (rogenatum) – алкоголь, лишенный водорода], органические соединения, содержащие альдегидную группу СНО.

9^ Дми́трий Ива́нович Менделе́ев (27 января[8февраля]1834–20 января[2 февраля]1907) – русский учёный, энциклопедист: химик, физикохимик, физик, метролог, экономист, технолог, геолог, метеоролог, нефтяник, педагог, воздухоплаватель, приборостроитель. Профессор Санкт-Петербургского университета; член-корреспондент по разряду «физический» Императорской Санкт-Петербургской Академии наук.

10^ Биомагнификация или биологическое усиление – увеличение концентрации химических веществ на каждой ступени экологической пирамиды, связанное с тем, что количество поглощаемой организмом пищи намного превышает его собственную массу, а химические вещества выводятся из организма не полностью [1].https://ru.wikipedia.org/wiki/Биомагнификация

11^ Юрий Антониевич Израэль (15 мая 1930–23 января 2014) – советский и российский метеоролог, академик РАН.

12^ Николай Фёдорович Реймерс (1931–1993) –советский зоолог, эколог, один из главных участников становления заповедного дела в СССР. Доктор биологических наук, профессор.

Код для цитирования: Скопировать