VIII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2016

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) взрослого организма сочетают высокую пролиферативную активность со способностью дифференцироваться в различные клеточные линии мезенхимального и немезенхимального происхождения [1]. Хотя они активно изучаются уже несколько десятилетий, до сих пор остаётся множество нерешённых вопросов их биологии. Глубокое изучение этих уникальных клеток ограничивается высокой гетерогенностью популяции МСК, зависимостью их пролиферативной активности, дифференцировочного потенциала, фенотипических свойств от множества факторов, таких как свойства адгезивной поверхности пластика, состава питательной среды, плотности пассажа, а также от условий культивирования [2, 3]. Все это затрудняет создание стандартизированных методов ведения культуры МСК. С учётом большого терапевтического потенциала МСК возникает потребность в более детальном изучении факторов, влияющих на рост культуры in vitro.

Целью настоящей работы стало выявление морфологических различий популяций МСК жировой ткани при культивировании на различных видах пластика.

Материалы и методы.

Выделение МСК производили по методике Zuk et. al. [4] из подкожного жира пациента с варикозной болезнью с соблюдением биоэтических норм. Образцы ткани измельчали ножницами и инкубировали с коллагеназой I типа при 37⁰C в течение 60 минут при постоянном встряхивании. После инактивации фермента эквивалентным объемом среды ДМЕМ (Invitrogen), содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки (Gibco), клетки осаждали центрифугированием, ресуспензировали и пропускали через нейлоновый фильтр. Клетки инкубировали в среде роста при 37 ⁰С в атмосфере 5% СО₂. На следующий день для удаления неприкрепившихся клеток питательную среду заменяли свежей. В дальнейшем эту процедуру повторяли каждые 2-3 сут. При достижении субконфлюентного состояния клетки снимали трипсином-ЭДТА (ПанЭко) и пересевали в новые чашки. В работе использовали клетки 4 пассажа.

В ходе основного эксперимента клетки высаживали в многолуночные полистироловые планшеты с обработанной поверхностью производства Greiner bio-one (кат. номер 662160) или Jet Biofil (кат. номер 011006). Плотность посадки составляла 400 кл/см². Культивирование продолжалось в течении 4 сут., после чего клетки фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимза. Оценку морфологических характеристик МСК проводили с помощью программы ToupView при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового инвертированного микроскопа (Микромед). Для каждой популяции подсчитывали среднюю плотность клеток, долю делящихся и многоядерных клеток. Относительный прирост биомассы рассчитывали по формуле:

,

где N₀ – количество клеток в начальный момент времени, N – количество клеток в конечный момент времени. Среднюю скорость роста за время культивирования относили к единице площади:

,

где t – время культивирования, сут; S – площадь ячейки планшета, см². Определяли такие цитометрические показатели, как длину короткой оси (В), отношение длинной и короткой осей (А/В), ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ «MS Excel» и «Statistica». В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (для малых и средних выборок, n≤30) или критерия Стьюдента (для больших выборок, n>30).

Результаты и их обсуждение.

Кинетика роста исследуемой культуры МСК существенно зависела от свойств культурального пластика. Так, плотность клеток на 1 см² поверхности в планшетах производства Greiner была более чем в 1,8 выше, чем в планшетах Biofil (рис. 1А). Существенно отличался и относительный прирост биомассы, который разнился в планшетах обоих исследованных производителей в 1,5 раза (рис. 1Б). Ещё более значимыми оказались различия в средней скорости роста: на планшетах Greiner клетки росли, практически, в 2 раза быстрее (рис. 1В). Таким образом пластик производства Greiner обеспечивал более высокие кинетические характеристики популяции МСК.

Рис. 1. Кинетические характеристики культур МСК (М±m, n=50):

А – плотность клеток, (кл/см²), Б – относительный прирост биомассы, В – средняя скорость роста, (кл/см² сут); синий – Greiner, красный – Biofil. * - достоверно при р