VII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2015

Диагноз на бордетеллёз устанавливают на основании комплексных клинико-эпизоотологических данных, результатов бакисследований и при необходимости патологоанатомического заключения.

При сборе эпизоотологических данных обращают внимание на стационарность, медленное распространение инфекции, подъем заболеваемости в периоды получения приплода и его отъема от матерей и зависимость интенсивности эпизоотологического процесса от сопутствующих факторов.

В лабораторию направляют материал от больных животных, отобранный в период максимального проявления у них клинических признаков (выраженное угнетение, температурная реакция, чихание, кашель, выделения из носовых отверстий) или от павших собак (поражённые участки лёгких, бронхиальные лимфатические узлы, бронхиальная слизь), взятый не позднее, чем через 3-4 ч после их гибели. Небольшие трупы животных отправляют в лабораторию целиком. Тампоны с носовой слизью исследуют не позднее 3-4 ч с момента их отбора. Слизь, отобранную из носовой полости или трахеи, центрифугируют при 2500 – 3000 об/мин в течение 15 минут, а из надосадочной жидкости делают высевы на питательные среды.

Пробы берут с тонзиллитной и околофаренгиальной областей или из нозальной впадины, микроорганизм может быть выделен и из других органов. Используются также и трахеальные смывы. Забор материала осуществляют с помощью стерильного ватного тампона на селективную среду. Для выделения B.bronchiseptica обязательно используется селективная среда, так как довольно трудно изолировать бордетеллы от других микроорганизмов, составляющих флору носа и глотки. Если это затруднительно, получают смывы из глубины носовой полости. При невозможности доставки взятого патматериала в первые часы после взятия его хранят при температуре от 4 до 10ºС. Для его доставки в лабораторию, в случаях, когда на это требуется до 48 ч.

Для лабораторной идентификации возбудителя рекомендованы культуральный и иммунологические методы.

В сложных случаях ставят биологическую пробу на двухнедельных щенках. Их заражают интраназально суточной культурой бордетелл или суспензией из поражённых участков лёгких, бронхиальных лимфоузлов в дозе по 0,5-1 мл в каждую ноздрю (с концентрацией 500 млн. микробных тел в 1 мл). В положительном случае через 4-7 дней щенки заболевают с типичным проявлением клинических признаков бордетеллёза. На 14-20 день титры агглютининов в сыворотках их крови достигают 1:80 – 1:160.

Целью нашей работы явилась разработка селективной добавки для первичного выделения и идентификации бактерий вида B.bronchiseptica.

Экспериментальную часть работы выполняли на базе малого инновационного предприятия Общества с ограниченной ответственностью «Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии» (ООО «НИИЦМиБ») при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программам «УМНИК- 2014».

В работе использовали штаммы бактерий: референс-штаммы B.bronchiseptica в количестве 4 шт. (№ 1, № 7, № 29, № 22-067, № 2); 27 референс-штамма возможных носоглоточных ассоциантов: Yersiniapseudotuberculosis №0630, Morganellamorganii, Staphylococcusaureus №АТСС 25923, Escherichiacoli №4, №25922 АТСС, Proteusmirabilis №1, №523, №491, Salmonellatyphimurium №82, Citrobacterfreundii, Klebsiellapneumoniae, Enterococcusfaecalis №189, Providenciarettgeri №104а, №102д, №175, Aeromonashydrophila №01, №02, Pseudomonasputida №12633, №901, Enterobactercloacae №1487, №10005, Bacilluscereus №2527, Bacillussubtillis №6633, B.parapertussis №119; B.pertussis №12, № 14а, №38.

Оборудование: микроскоп «Биомед-6» с видео- и фотонасадками № 4F 8663200/01, ПК с установленным Windows ХР, USB 3.0 драйвер, программа «ScopePhoto»; прибор для подсчета колоний ПСБ 2.784.001 ПС; термостат ТС-80М-2; автоклав ГК-100-3; шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 424; холодильная камера; дистиллятор; лабораторные центрифуги ОПн-8УХЛ 4,2 и ЦЛС – 3; водяная баня; ультрафиолетовая лампа марки «Phillips» с длиной волны 253 нм; отраслевой стандарт мутности ОСО 42-28-86-08 П (5 МЕ) и (10 МЕ); лупа бинокулярная МБС-9.

Лабораторная посуда: предметные стекла ГОСТ 9284-75; предметные стекла с лункой и покровные стекла ГОСТ 9284-75; горелка спиртовая ГОСТ 25336; пробирки ГОСТ 25336; пробки резиновые и ватно-марлевые; колбы ГОСТ 25336; петли пастеровские; пинцеты ГОСТ 21241; штативы алюминиевые; дозаторы автоматические; чашки Петри ГОСТ 25336 82; пробирки для агглютинации ГОСТ 25336-82; пипетки ГОСТ 29227-91.

Для бактериологических исследований использовали жидкие и плотные питательные среды. Бульоны: мясопептонный (Оболенск) и триптиказно-соевый (Merck). Агаровые среды: мясопептонный агар (Оболенск), ГРМ – агар (Оболенск), бордетелагар (Оболенск), бордетелагар (Hi Media), казеиново-угольный агар (Оболенск), среда для иерсиний и псевдотуберкулеза (ИПС).

Для выбора селективных компонентов были использованы 57 антимикробных средств (мономицин, колистин, оксалиновая кислота, азитромицин, рокситромицин, доксициклин, левомицетин, хлорамфеникол, амикацин, неомицин, канамицин, гентамицин, сизомицин, фурадонин, цефоперазон, ципрофлоксацин, тетрациклин, бацитрацин, цефепин, бензилпенициллин, ампициллин, карбенициллин, амоксиклав, стрептомицин, ванкомицин, цефазолин, цефтазидим, цефотаксим, цефалотин, эритромицин, олеандомицин, фузидин, фурадипан, нистатин, клотримазол, флуконазол, амфотерин, рифампицин, линкомицин, амоксициллин, террамицин, оксациллин, клиндамицин, бициллин, дитрим, цефтриаксон, отибиовет, ампициллин, цефамандол, цефаклор, кларитромицин, левофлоксацин, энрофлоксацин, норфлоксацин, фурадон, фурагин, оптохин.

При проведении исследований пользовались следующими нормативно-методическими источниками: МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий»; МР 3.1.2.0072-13 «Инфекции дыхательных путей. Диагностика коклюша и паракоклюша»;СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней"; СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности"; СанПиН 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами"; МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред"; МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Мы провели количественное определение максимальной подавляющей концентрации антибиотиков методом серийных разведений в бульоне (макрометод) согласно МУК 4.2.1890-04.

Для приготовления основного раствора антибиотиков в качестве растворителя использовали стерильный физиологический раствор.

Суспензию B.bronchiseptica 29 готовили из агаровой культуры. Отобрали несколько однотипных четко изолированных колоний с МПА. Бактериологической петлей перенесли материал с верхушек колоний в пробирку со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, доводя плотность инокулята до 0,5 по стандарту МакФарланда. Стандартную микробную взвесь разводили в 100 раз в питательном бульоне, после чего концентрация микроорганизма в ней составила примерно 10⁶ КОЕ/мл Инокулят вносили в пробирки не позднее 30 минут с момента приготовления.

Результаты количественного определения оптимальной концентрации антибиотиков представлены в таблицах 1-4.

Таблица 1 -Количественное определение максимальной подавляющей концентрации цефтриаксона дляBordetellabronchiseptica 29

№ разведения	Концентрация АБ мг/мл	Суспензия B.bronchiseptica 29, 106 КОЕ/мл
		Рост в МПБ				Рост на МПА через 48 ч инкубации
		цвет	мутность	осадок	пленка, кольцо
1	500	-	Незначительные хлопья	-	слабый рост в начале штриха	-
2	50	-	Легкий осадок	-	Рост по штриху с различимыми колониями	-
3	5	+	Осадка нет	Желе сверху	Сплошной рост по штриху	+
4	0,5	+	Осадок в виде облаков	пленка	Сплошной рост по штриху	+
5	0,05	+	Облака в 1 см от дна	пленка	Сплошной рост по штриху	+
Контроль (+)	-	+	-	-	обильный рост по всему штриху	+
Контроль (-)	-	-	-	-	Рост отсутствует	-

Из полученных данных, очевидно, что концентрации цефтриаксона натриевой соли в субстрате не должна превышать 500 мг/мл (рис. 1).

Рис.1. Определение максимальной подавляющей концентрации цефтриаксона на МПА через 48 ч инкубации

Таблица 2 -Количественное определение максимальной подавляющей концентрации цефазолина дляBordetellabronchiseptica 29

№ разведения	Концентрация АБ мг/мл	Суспензия B.bronchiseptica 29, 106 КОЕ/мл
		Рост в МПБ				Рост в МПА через 48 ч инкубации
		цвет	мутность	осадок	пленка, кольцо
1	500	Светло-желтый	-	-	-	Рост по штриху с отдельными колониями
2	50	Светло-желтый	-	-	-	Рост по штриху с отдельными колониями
3	5	Светло-желтый	+	-	-	Рост по штриху с отдельными колониями
4	0,5	Светло-желтый	+	При встяхивании мелкая взвесь	-	Сплошной рост по штриху
5	0,05	Светло-желтый	+	-	Сверху на 1,5 см хлопья	Сплошной рост по штриху
Контроль (+)	-	Светло-желтый	+	-	-	обильный рост по всему штриху
Контроль (-)	-	Светло-желтый	-	-	-	Рост отсутствует

Из полученных данных, очевидно, что концентрации цефазолина натриевой соли в субстрате не должна превышать 500 мг/мл.

Рис.2. Определение максимальной подавляющей концентрации цефазолина на МПА через 48 ч инкубации

Таблица 3 -Количественное определение максимальной подавляющей концентрации цефатоксим дляBordetellabronchiseptica 29

№ разведения	Концентрация АБ мг/мл	Суспензия B.bronchiseptica 29, 106 КОЕ/мл
		Рост в МПБ				Рост в МПА через 48 ч инкубации
		цвет	мутность	осадок	пленка, кольцо
1	500	Ярко-желтый	-	-	-	-
2	50	желтый	+	-	-	Рост по штриху с различимыми колониями
3	5	Светло-желтый	+	1,5 см на дне мутный осадок	-	Рост по штриху с различимыми колониями
4	0,5	Светло-желтый	+	-	пленка	Сплошной рост по штриху
5	0,05	Светло-желтый	+	-	кольцо	Сплошной рост по штриху
Контроль (+)	-	Светло-желтый	+	-	-	обильный рост по всему штриху
Контроль (-)	-	Светло-желтый	-	-	-	Рост отсутствует

Из полученных данных, очевидно, что концентрации цефатоксима натриевой соли в субстрате не должна превышать 50 мг/мл.

Рис.3. Определение максимальной подавляющей концентрации цефатоксима на МПА через 48 ч инкубации

Таблица 4 -Количественное определение максимальной подавляющей концентрации линкомицина дляBordetellabronchiseptica 29

№ разведения	Концентрация АБ мг/мл	Суспензия B.bronchiseptica 29, 106 КОЕ/мл
		Рост в МПБ				Рост в МПА через 48 ч инкубации
		цвет	мутность	осадок	пленка, кольцо
1	500	Светло-желтый	-	-	-	Роста нет
2	50	Светло-желтый	-	+	-	Рост по штриху
3	5	Светло-желтый	+	+	пленка	Сплошной рост по штриху
4	0,5	Светло-желтый	+	-	пленка	Сплошной рост по штриху
5	0,05	Светло-желтый	+	-	кольцо	Сплошной рост по штриху
Контроль (+)	-	Светло-желтый	+	-	-	обильный рост по всему штриху
Контроль (-)	-	Светло-желтый	-	-	-	Рост отсутствует

Из полученных данных, очевидно, что концентрации линкомицина натриевой соли в субстрате не должна превышать 50 мг/мл.

Рис.4. Определение максимальной подавляющей концентрации линкомицина на МПА через 48 ч инкубации

Далее мы провели исследования по определению чувствительности носоглоточной флоры к выбранным антибиотикам.

Носоглоточная микрофлора полностью подавлялась всеми антибиотиками во всех испытуемых концентрациях.

Мы рекомендуем для первичного выделения бактерий вида Bordetella bronchiseptica использовать селективную добавку к питательным средам.

Рекомендуемый состав селективной добавки: цефтриаксона 0.05 мг/мл, цефазолина 0.05 мг/мл, цефатоксима 0.05 мг/мл, линкомицина 0.05 мг/мл.

Библиографический список

1. Васильев Д.А., Сверкалова Д.Г., Никульшина Ю.Б., Стеанова Т.А., Семанин Е.А., Казакова А.С., Никулина Е.Н. Бордетеллёз кошек и собак. Материалы II-й Открытой Всероссийской конференции молодых ученых «Молодёжь и наука XXI века».- Ульяновск, 2007. – Ч.1. – С. 222-225.

2. Васильев Д.А. Выделение и идентификация Bordetella bronchiseptica от животных // Васильев Д.А. Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. / Естественные и технические науки. – 2010. - № 5 – С. 233-235.Васильев В.Ю.

3. Мастиленко А.В. Разработка идентификации B.bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов / А.В. Масти-ленко // Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Саратов, 2010. – 21 с.

4. Никульшина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Васильев Д.А., Хлынов Д.Н. Выделение бактерий рода Bordetella bronchiseptica от домашних животных / Роль молодых ученых в развитии национального проекта «Развитие АПК». Москва. МГАУ. – 2007. – Ч 1. с. 281-284.

5. Никульшина Ю.Б., Сверкалова Д.Г., Хлынов Д.Н., Никулина Е.Н. [и др.] Изучение возможности зооантропонозной передачи бордетеллёза // тр. Всероссийского совета молодых ученых аграрных образовательных и науч. учреждений. М.: Академия кадрового обеспечения АПК, 2008. Т.1. С. 152–155.

6. Сверкалова Д.Г., Степанова Т.А., Василева Ю.Б., Казакова А.С., Никулина Е.Н. Бордетеллез кошек и собак // Материалы II-й Открытой Всероссийской конференции молодых ученых / Молодежь и наука XXI века. – Ульяновск, 2007. - Ч. 1. – С. 222-225.

7. Семанина Е.Н. Разработка биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов для диагностики, лечения и профилактики бордетеллёзной инфекции животных и людей // Актуальные проблемы физической и функциональной электроники: материалы 12-й региональной научн. школы-семинара. Ульяновск, 2009. Т.2. С. 140–141.

Код для цитирования: Скопировать