РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ РУТИНА

Власова К.М. 1

1Бийский технологический институт

Работа в формате PDF

61.9 KB

Сертификат участника

Комментарии

Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время особое место на фармацевтическом рынке занимают лекарственные средства и биологически активные добавки растительного происхождения, содержащие флавоноиды. Одним из важнейших свойств флавоноидов является способность повышать прочность стенок капилляров (Р-витаминная активность) за счет антиоксидантного действия, что является очень важным при лечении хронической венозной недостаточности, гипертонии и других сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с увеличением проницаемости кровеносных капилляров [1, 2].

Наиболее ярким представителем в данной группе веществ является рутин, который относится к группе витамина Р. Важно отметить, что рутин обладает не только выраженным капилляроукрепляющим, но и антиоксидантным, гепатопротекторным действием [1, 2]. На сегодняшний день основным источником получения рутина являются бутоны софоры японской (SophorajaponicaL.), однако в нашей стране отсутствует сырьевая база данного растения. В Российской Федерации отсутствуют предприятия, которые производят рутин фармацевтического качества. Вся потребность рутина в нашей стране восполняется за счет импорта его из Китая, Бразилии, Германии, что не выгодно с экономической точки зрения. Перспективным отечественным источником получения рутина и других флавоноидов может являться трава гречихи посевной (Fagópyrum esculentum), широко культивируемая, как ценная пищевая культура в Российской Федерации. Известно, что в культивируемых сортах гречихи содержание рутина может достигать 8,7 % в пересчете на сухое вещество. Однако селекционированы такие сорта, в которых содержание рутина может достигать 12 % [3, 4, 5].

В связи с этим целью нашей работы является получение из травы гречихи посевной рутина пищевого качества для продажи, как в нашей стране, так и за рубежом, и для собственных нужд фармацевтического предприятия ЗАО «Эвалар».

Для достижения поставленной цели нами решались следующие задачи:

- выбрать и проанализировать сырье для получения рутина;

- подобрать экстрагент для извлечения рутина;

- разработать лабораторный способ получения рутина;

- получить рутин фармакопейного качества.

1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

На первом этапе работы был проведен обзор литературных источников по способам получения рутина из травы гречихи посевной, исходя из информации, можно сделать выводы, что для экстракции применяют следующие вещества:

1. Вода

При использовании для первичной экстракции воды экстракцию проводят кипящей или горячей водой (90 ˚С), чистой водой, или с использованием раствора солей кальция. Далее раствор охлаждают, выпавший осадок рутина-сырца отделяют фильтрованием, или центрифугированием. Так как при первичной экстракции водой практически не происходит экстракции липофильных соединений (хлорофилл, пигменты и т.д.), очистка классическими органическими растворителями, используемыми для удаления липофильных соединений, не предусмотрена. Затем упоминается многократная перекристаллизация с использованием спирта этилового [6, 7].

2. Раствор этилового спирта

При использовании для первичной экстракции водно-спиртовых растворов 50-90 %, экстракцию проводят при температуре 70-80 ˚С (для 50 % спирта). После отгонки спирта от примесей растворимых в спирте избавляются избирательной сорбцией рутина на хроматографических колонках, избирательной экстракцией рутина этилацетатом, промывкой осадка или сгущенной водой суспензии рутина хлороформом или дихлорэтаном. Для дальнейшей очистки используется перекристаллизация из воды и спирта [8, 9].

3. Раствор ацетона 50 %

К сухой траве гречихи добавляют 50 % ацетона, или 50 % этанола, затем проводят дефлегмацию при 80 ˚С в течение 1-2 часов, затем фильтруют или центрифугируют и концентрируют. К экстракту добавляют адсорбент, затем промывают водой и 20 % этанолом, вымывают элюат при пониженном давлении до получения сухого остатка, затем добавляют воду, нагретую до 60-80 ˚С и оставляют при 4-10 ˚С для перекристаллизации [10].

4. Водный раствор солей кальция

Способ включает измельчение растительного сырья, экстракцию, кристаллизацию, промывку и сушку. Экстракцию рутина проводят водными растворами солей кальция с концентрацией 0,2-1,0 % [11].

Более подробно описан техпроцесс получения рутина из зеленой массы гречихи, внедренный на Таллинском химико-фармацевтическом заводе при выделении рутина из зеленой массы гречихи посевной. Производство основано на видоизмененном методе Шаро. Технологический процесс состоит из следующих стадий:

1. Измельчение. На этой стадии сырье измельчают до размера 3-5 мм.

2. Экстракция. Измельченное сырье экстрагируют 70 % этиловым спиртом в батарее из 6-8 перколяторов с рубашками методом противотока при нагревании экстрагента до 80 ˚С. Спиртовую вытяжку получают из головного перколятора в соотношении 1:3 или 1:3,5 (вытяжка равна 300-350 % от массы сырья). Из шрота хвостового экстрактора при нагревании регенерируют спирт.

3. Вакуум-выпарка. В вакуум-выпарном аппарате при атмосферном давлении, затем в вакууме при 80 ˚С отгоняют спирт до получения остатка, составляющего 25 % первоначального объема. Спирт, как более летучий компонент, отгоняется, водный остаток остается.

4. Кристаллизация. При охлаждении водного остатка до 10-15 ˚С образуется осадок, содержащий рутин и балластные вещества (например, хлорофилл, смолы, фитостерины). Осадок отфильтровывают, а маточник, содержащий балластные вещества, сливают в канализацию.

5. Вакуум-сушка. Для удаления остатков влаги осадок сушат в полочной вакуум-сушилке до остаточной влаги, не превышающей 5 %.

6. Экстракция балластных веществ. Высушенный экстракт обрабатывают дихлорэтаном в реакторе с рубашкой, обратным холодильником и мешалкой при нагревании или путем циркуляционной экстракции в аппарате «Сокслет». В результате из осадка удаляют основную массу балластных веществ и получают рутин-сырец.

7. Перекристаллизация рутина. Рутин-сырец перекристаллизовывают из воды. Для этого осадок заливают водой и смесь разогревают пропусканием «острого» пара. Горячий раствор фильтруют через обогреваемый друк-фильтр и сливают в кристаллизатор, где охлаждают до 15 ˚С. Рутин выпадает в осадок, который отделяют на нутч-фильтре и передают на повторную перекристаллизацию из воды. После двойной перекристаллизации проводят дополнительную очистку растворением рутина в 98 % этиловом спирте при нагревании, спиртовый раствор фильтруют (освобождают от примесей углеводов и других полярных веществ), часть спирта отгоняют, затем добавляют воду и окончательно отгоняют спирт. Водный раствор сливают в кристаллизатор и при охлаждении до 15 ˚С из него выпадает осадок рутин, который отфильтровывают на нутч-фильтре, промывают ацетоном и сушат в вакуум-сушильном шкафу до содержания влаги не более 9 %. Кристаллизуется рутин в виде кристаллогидрата. Общий выход рутина составляет приблизительно 58 %. (Расходная норма: на 1 кг рутина - 85 кг гречихи) [12].

После проведенного анализа литературных источников мы выделили для себя основные условия для проведения технологического процесса:

- проводить первичную экстракцию водой (для исключения фазы пропарки шрота для отгонки спирта, потерь спирта со шротом растительного сырья, уменьшения количества водных растворов этилового спирта, подаваемых на выпаривание и ректификацию, исключения необходимости использовать на фазе очистки обработку органическими растворителями для удаления липофильных соединений).

- планировать проведение экстракции при температуре не более 95 ˚С (для исключения необходимости использовать аппаратуру, работающую под давлением).

- планировать предварительно проведение техпроцесса с выделением в сухом виде рутина сырца (для обеспечения проведения последующей кристаллизации из концентрированного спирта этилового).

- использовать для очистки и перекристаллизации только этиловый спирт и воду. Исключить использование метилового спирта и других органических растворителей на фазе очистки и перекристаллизации.

- использовать в качестве сырья сухую траву гречихи для обеспечения круглогодичной работы производства.

1.1 Характеристика готового продукта

1.1.1 Общая характеристика флавоноидов

Рутин является самым ярким представителем среди флавоноидов. Под термином флавоноиды (от лат. flavus - желтый, так как первые выделенные из растений флавоноиды имели желтую окраску, позднее установлено, что многие из них бесцветны) объединены различные соединения, генетически связанные друг с другом, но обладающие различным фармакологическим действием [13].

Изучение флавоноидов относится к началу XIX в., когда в 1814 г. Шевроле выделил из коры особого вида дуба кристаллическое вещество, названное кверцетином. Вайс сообщил о выделении рутина из Ruta graveolens. Валяшко установил строение рутина.

В зависимости от степени окисления и положения фенильного радикала флавоноиды делятся на несколько групп:

А) Собственно, флавоноиды с боковым фенильным радикалом у С2.

Б) Изофлавоноиды с фенильным радикалом у С3.

В) Неофлавоноиды с фенильным радикалом у С4.

Г) Бифлавоноиды.

В растениях флавоноидные соединения, кроме катехинов, сравнительно редко встречаются в свободном состоянии. Подавляющее большинство их представлено в виде разнообразных гликозидов.

Флавоноиды являются кристаллическими веществами с определенной температурой плавления, без запаха, имеющие жёлтый (флавоны, флавонолы, халконы и др.), бесцветные (изофлавоны, катехины, флаваноны и др.), а также окрашенные в красный или синий цвет в зависимости от ρН среды (антоцианы) [14].

Флавоноиды широко распространены в растительном мире. Особенно богаты флавоноидами высшие растения семейств:

Розоцветные (Rosacea) (различные виды боярышников, черноплодная рябина).
Бобовые (Fabaceae) (софора японская, стальник полевой, солодка).
Гречишные (Polygonaceae) (различные виды горцев - перечный, почечуйный, птичий; гречиха).
Астровые (Asteraceae) (бессмертник песчаный, сушеница топяная, пижма).
Яснотковые (Lamiaceae) (пустырник сердечный).
Сельдерейные (Apiaceae) (володушка многожильчатая).
Рутовые (Rutaceae) (бархат, рута душистая).

Чаще флавоноиды встречаются в тропических и альпийских растениях. Обнаружены и у низших растений: зеленые водоросли (ряски), споровые (мхи, папоротники), хвощи (хвощ полевой).

В растениях флавоноиды локализуются в различных органах, но чаще в надземных: цветках, обуславливая окраску лепестков (бессмертник песчаный, василек синий, пижма обыкновенная); в траве (фиалка, чистец, рута, горец), плодах (боярышник, софора японская); значительно меньше их в стеблях и подземных органах (солодка, шлемник байкальский, стальник полевой). Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5 %, иногда достигает 30 % (в цветках софоры японской).

В клетках растений флавоноиды накапливаются в форме гликозидов, главным образом в вакуолях, а в свободном состоянии - в специальных образованиях, зачастую имеющих довольно сложное строение - смоляных и эфирномасличных ходах, канальцах, вместилищах, железках и т.д. В надземных частях растений более 85 % суммы флавоноидов локализуется в клетках эпидермы и только 15 % - в остальных тканях [2].

Флавоноиды принимают участие:

в окислительно-восстановительных процессах растений;
в выработке иммунитета;
в защите растений от неблагоприятных воздействий ультрафиолетовых лучей и низких температур. Предполагается, что благодаря способности поглощать ультрафиолетовое излучение (330-350 нм) и часть видимых лучей (520-560 нм) флавоноиды защищают растительные ткани от избыточной радиации. Это подтверждается локализацией флавоноидов в эпидермальных (близких к поверхности) клетках растений;
в процессе оплодотворения высших растений;
обуславливают огромное разнообразие окрасок цветков и плодов, что привлекает насекомых и тем самым способствуют опылению;
некоторые флавоноиды защищают аскорбиновую кислоту от окисления (т.е. являются антиоксидантами);
входя в состав экстрактивных веществ древесины, флавоноиды способны придавать ей особую прочность и устойчивость к поражениям патогенными грибами [13, 14].

Влияние различных факторов и условий среды на накопление флавоноидов в растениях:

- на накопление флавоноидов оказывают влияние возраст и фаза развития растения. В молодых растениях их больше, в старых растениях их количество уменьшается. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается в цветках, листьях и травах в период бутонизации и цветения, а к фазе плодоношения содержание снижается;

- на накопление флавоноидов влияет освещенность. Содержание флавоноидов в растениях увеличивается с ростом освещенности;

- на накопление флавоноидов влияет температура. Содержание антоцианов увеличивается при понижении температуры (покраснение листьев у щавеля), у других групп флавоноидов, наоборот, содержание увеличивается при повышении температуры [15].

Сбор сырья проводится в фазу наибольшего накопления флавоноидов. Заготовку надземных частей проводят в фазу бутонизации или начала цветения, подземных - в конце вегетации. Сырье необходимо сушить вскоре после сбора, т.к. флавоноидные гликозиды под влиянием ферментов в присутствии влаги легко гидролизуются на сахар и агликон, а свободные агликоны могут окисляться. Сушить сырье следует в тени или в сушилках с искусственным и естественным обогревом. Плоды сушат при температуре 70-90 °С, траву - 50-60 °С; цветки - 40 °С. Не допускается сушка на солнце. Медленная сушка, особенно на солнце, ведет к разрушению флавоноидов. Сырье необходимо оберегать от влаги и прямых солнечных лучей. Сохранять в плотно укупоренной таре, в хорошо проветриваемом помещении.

Для флавоноидов, как и для других веществ, не существует способа выделения, универсального для всех растительных материалов. В каждом конкретном случае прибегают к наиболее подходящему методу или сочетанию методов, с учётом в основном свойств веществ и особенностей растительного сырья. Наиболее часто используется избирательная экстракция, осаждение с помощью солей тяжёлых металлов и хроматографические методы.

Для выделения флавоноидов из растительного сырья в качестве экстрагента чаще всего используют метиловый или этиловый спирты, или их смеси с водой. Полученное спиртовое извлечение упаривают, разбавляют горячей водой и удаляют липофильные вещества (жирные масла, смолы, хлорофилл) из водной фазы делительной воронки дихлорэтаном или четыреххлористым углеродом.

Для отделения и очистки многих флавоноидов иногда используют их способность образовывать нерастворимые в воде и спирте соли при взаимодействии с ионами тяжелых металлов, а также влияние рН на образование таких осадков. Осадки центрифугируют и после суспендирования в разбавленных спиртах разлагают с помощью сероводорода. Далее флавоноиды отделяют либо путем перекристаллизации, либо хроматографическими методами Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические свойства: определение температуры плавления, определение удельного вращения гликозидов и сравнение их УФ-, ИК- спектров со спектрами известных образцов [14, 15, 16].

1.1.2 Химический состав рутина

Рутин является биофлавоноидом, структурная формула - C₂₇H₃₀O₁₆.

Рисунок 1 - Формула рутина

Таблица 1 - Химический состав рутина

Символ	Элемент	Атомный вес	Число атомов	Процент массы
1	2	3	4	5
C	углерод	12.011	27	53.1 %
H	водород	1.008	30	5 %
O	кислород	15.999	16	41.9 %

Рисунок 2 - Диаграмма массовой доли химических элементов, входящих в состав рутина

Рутин - кристаллический порошок желтого цвета, практически не растворим в холодной и растворим в горячей воде, мало растворим в 95 % этиловом спирте и этилацетате, практически нерастворим в эфире, хлороформе, ацетоне, бензоле, растворим в разбавленных водных растворах едких щелочей. Температура плавления (с разложением) равна 193-194 ˚С. Рутин - порошок является биофлавоноидом - веществом, которое много делает для нашего организма, в том числе и замедляет процессы старения. Чистый рутин в природе желтого или желто-зеленого цвета, без вкуса и запаха, а если рассматривать его под микроскопом, он выглядит как игольчатые кристаллы. Рутин состоит из кверцетина и дисахарида (рамнозы и глюкозы). Суточная норма рутина составляет от 25 до 50 мг в сутки, для женщин в среднем от 20 мг, а для мужчин от 28 мг [16].

1.1.3 Физиологические свойства рутина

Все исследователи и клиницисты признают капилляроукрепляющее действие рутина, он способствует повышению прочности мельчайших сосудов - капилляров, уменьшая их хрупкость и снижая проницаемость. Нет необходимости доказывать, какое значение имеет поддержание нормального состояния сосудов в профилактике кровоизлияний, особенно в таких ответственных участках человеческого организма, как мозг и сердечная мышца. Недостаток рутина проявляется в организме следующим образом: капилляры становятся хрупкими, под кожей происходят кровоизлияния, носящие точечный характер и появляются маленькие синички. Он также отлично подходит для тех, кто склонен к кровоточивости десен, так как этот витамин помогает предотвратить и исцелить слабые кровеносные сосуды, расположенные в деснах.

Убийцей номер один называют тромбозы (сгустки крови), которые блокируют приток крови к сердцу или мозгу. Новые исследования обнаружили эффективность немедикаментозного подхода к предотвращению формирования этих сгустков крови. Эта стратегия включает использование рутина. Сгусток крови при соответствующих условиях является опасными для жизни, и поэтому потребность в безопасных, эффективных профилактических и лечебных подходах представляет большой интерес для медицины.

В ходе недавних исследований ученые сосредоточили свое внимание на рутине как веществе, которое способно бороться со многими заболеваниями. В частности, они выделили рутин из более чем 5000 соединений как наиболее мощное вещество для борьбы с тромбозом. После обширных исследований и испытаний, исследователи обнаружили, что «Рутин оказался наиболее сильным антитромботическим соединением, которое мы когда-либо тестировали», пояснил Роберт Флауменхафт, ставший автором исследования Гарвардской медицинской школы [13].

Рутин может быть полезным для людей с хронической венозной недостаточностью, в соответствии с исследованием, опубликованным в журнале Minerva Cardioan giologica в 2001 году. Хроническая венозная недостаточность является состоянием, при котором вены неэффективно возвращают кровь от ног к сердцу. Она провоцирует такие проблемы со здоровьем, как варикозное расширение вен, отек лодыжек и ночные судороги ног. Для исследования 30 пациентов с хронической венозной недостаточностью использовали лечение с помощью комбинации рутина, альфа-токоферола (форма витамина Е), донника и центеллы азиатской, которая относится к семейству петрушки. После 30 дней лечения участники контрольной группы показали значительное улучшение симптомов (таких как отеки и судороги).

Рутин может помочь в лечении варикозного расширения вен у беременных женщин, по данным доклада 2007 года, опубликованного в Кокрановской базе систематических обзоров. В анализе трех ранее опубликованных клинических испытаний (где участвовали в общей сложности 159 женщин), ученые определили, что рутозид облегчает симптомы варикозного расширения вен на поздних сроках беременности. Тем не менее, авторы обзора отмечают, что нет достаточных данных для оценки безопасности применения рутозидов во время беременности [13, 14].

Для тех, кто часто имеет дело с простудой, рутин может быть большой помощью. Он укрепляет иммунную систему, этот витамин необходим для укрепления естественной защиты организма от вирусов и инфекций. Рутин также является естественным противовоспалительным средством и мочегонным. Этот витамин может помочь преодолеть серьезные заболевания - гипертонию, аллергию, возникновение ран и язв.

Особая нехватка рутина (витамина Р) наблюдается в зимний и весенний периоды, когда в рационе человека длительное время могут отсутствовать свежие овощи, фрукты и ягоды. Рутин способен улучшить проницаемость капилляров, предотвратить их ломкость. Он также может помочь людям быть здоровыми и активными. Рутин содержится в целом ряде пищевых продуктов и трав, но его воздействие на организм неоднозначно.

Есть несколько веществ, которые могут разрушить витамин Р в организме. Среди самых распространенных разрушителей - курение табака, а также потребление алкоголя. Аспирин и ряд безрецептурных обезболивающих также может разрушить рутин в системе организма, враги рутина - антибиотики и кортизон.

Признаки нехватки рутина.

- Быстрая утомляемость.

- Кровоизлияние в глазную сетчатку.

- Раздражительность.

- Боли в ногах.

- Боли в плечах.

- Угревая сыпь.

- Кровоточивость десен.

При переизбытке рутина не бывает каких-либо серьезных опасностей для здоровья, поскольку излишки этого вещества очень быстро выводятся из организма с продуктами распада. Тем не менее, рутиновые добавки могут вызывать некоторые побочные эффекты, в том числе головную боль, сыпь и расстройство желудка. Рутин, как правило, считается безопасными при употреблении в разумных количествах из пищевых продуктов [14].

1.1.4 Применение рутина

В состав многих лекарственных средств и биологически активных веществ к пище входит рутин. Существуют различные формы лекарственных средств в состав которых входит рутин (порошки, таблетки, комплексные препараты: Аскорутин, Аэровит, Амитетравит, Глутамевит, Компливит, настойка софоры японской. Вот лишь небольшой перечень лекарственных средств в составе которых имеется рутин [17, 18]:

-Аскорутин международное название: Аскорбиновая кислота, Рутозид (Ascorbicacid, Rutoside).

Лекарственная форма: таблетки, таблетки, покрытые оболочкой.

Фармакологическое действие:Аскорутин - комбинированный препарат. Восстанавливает дефицит витамина С и Р. Рутин вместе с аскорбиновой кислотой участвует в окислительно-восстановительных реакциях.

Показания: Профилактика и лечение гипо- и авитаминоза Р и С, поражений капилляров, связанных с применением непрямых антикоагулянтов и салицилатов.

- Аскорутин-Н.С международное название: Аскорбиновая кислота, Рутозид (Ascorbicacid, Rutoside).

Лекарственная форма: таблетки, таблетки, покрытые оболочкой.

Фармакологическое действие: Аскорутин-Н.С. - комбинированный препарат. Восстанавливает дефицит витамина С и Р. Рутин вместе с аскорбиновой кислотой участвует в окислительно-восстановительных реакциях.

- Аскорутин-УБФ международное название: Аскорбиновая кислота, Рутозид (Ascorbicacid, Rutoside).

Лекарственная форма: таблетки, таблетки, покрытые оболочкой.

Фармакологическое действие: Аскорутин-УБФ - комбинированный препарат. Восстанавливает дефицит витамина С и Р. Рутин вместе с аскорбиновой кислотой участвует в окислительно-восстановительных реакциях.

- Венорутон ФОРТЕ международное название: Рутозид (Rutoside).

Лекарственная форма: капсулы, таблетки.

Фармакологическое действие: Ангиопротекторное средство, производное рутина. Действует преимущественно на капилляры и вены. Уменьшает скорость фильтрации воды в капиллярах.

Показания: Венозная недостаточность нижних конечностей (в т.ч. вызванная тромбозом, при беременности начиная с II триместра), сопровождающаяся отеками.

- Викалин международное название: Висмута субнитрат, Магния карбонат, Натрия гидрокарбонат, Аира корневища, Крушины кора, Рутозид, Келлин.

Лекарственная форма: таблетки.

Фармакологическое действие: Викалин - комбинированный препарат, оказывает вяжущее, антацидное, слабительное и спазмолитическое действие. Магния карбонат и натрия гидрокарбонат.

Показания: Язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, гиперацидный гастрит.

- Профилактин С международное название: Аскорбиновая кислота, Рутозид (Ascorbicacid, Rutoside).

Лекарственная форма: таблетки, таблетки, покрытые оболочкой.

Фармакологическое действие: Профилактин С - комбинированный препарат. Восстанавливает дефицит витамина С и Р. Рутин вместе с аскорбиновой кислотой участвует в окислительно-восстановительных реакциях.

- Рутаскорбин международное название: Аскорбиновая кислота, Рутозид (Ascorbicacid, Rutoside).

Лекарственная форма: таблетки, таблетки, покрытые оболочкой.

Фармакологическое действие: Рутаскорбин - комбинированный препарат. Восстанавливает дефицит витамина С и Р. Рутин вместе с аскорбиновой кислотой участвует в окислительно-восстановительных реакциях.

- Рутин международное название: Рутозид (Rutoside).

Лекарственная форма: капсулы, таблетки.

Показания: Венозная недостаточность нижних конечностей (в т.ч. вызванная тромбозом, при беременности начиная с II триместра), сопровождающаяся отеками [17, 18].

1.2 Характеристика сырья

1.2.1 Общая характеристика растительных источников получения рутина

В Российской Федерации зарегистрированы две лекарственные субстанции рутина:

- производства Merk S.A. Industrias Qumicas (Бразилия) - НД 42-11607-01.

Источником получения рутина в Бразилии являются плоды местного растения Favadˋanta (Dimorphandramollis), растение относится к подсемейству Цезальпиниевые (Caesalpinioideae), семейства Бобовые (Fabaceae). Цезальпиниевые представляют собой деревья, произрастающие во влажных тропиках, саваннах Бразилии и других стран Южной Америки. Полученный рутин отличается доступностью и относительной дешевизной и рекомендуется, как исходный продукт для дальнейшего синтеза других флавоноидов [19].

- производства Sichuan Xieli Pharmaceutical Co. Ltd (Китай) - НД 42-11781-01.

Источником получения рутина в Китае является Софора японская - Sophora japonica L. Софора японская (Sophora japonica L.) - листопадное дерево семейства бобовые - Fabaceae (Leguminosae), достигающее в высоту 25 м, с широкой кроной. Родина софоры японской - Китай. Широко разводится на полуострове Корея, в Японии, Вьетнаме и других странах Азии, а также в Европе и Северной Америке. Издавна культивируется во многих южных районах европейской части страны, в Закавказье и Средней Азии. Особенно часто разводится в Крымской, Херсонской и Одесской областях, в Узбекистане, долинных районах Таджикистана, в городах Туркмении, Дагестана, в равнинных и низкогорных районах Азербайджана, Армении и Восточной Грузии. Наличие рутина установлено в бутонах, цветках, молодых плодах до 30 %, листьях, молодых ветках до 4 %. Помимо рутина, обнаружены кемпферол-3-софорозид, кверцетин-3-рутинозид и генистеин-2-софорабиозид. В цветках обнаружены алкалоиды и гликозиды [20].

В СССР было налажено производство рутина из травы гречихи посевной(Fagópyrum esculentum) - вид травянистых растений рода Гречиха (Fagopyrum) семейства Гречишные (Polygonaceae). Согласно литературным данным, содержание рутина в разных органах растения неодинаково. В цветах 2,9-8,7 %, листья 1,8-7,7 %, в стеблях 0,4-2,0 %. В результате направленных селекционных работ были выведены сорта гречихи посевной отличающиеся высокой концентрацией флавоноидов в пересчете на рутин в надземной части растений [21].

1.2.2 Содержание рутина в траве гречихи посевной

Согласно литературным данным, содержание рутина в разных органах растения неодинаково. В цветках 2,9-8,7 %, листьях 1,8-7,7 %, в стеблях 0,4-2,0 %. При сравнительном анализе литературных данных по содержанию рутина необходимо иметь ввиду, что в некоторых источника, приводятся данные по суммарным флавоноидам в пересчете на рутин (определяемые обычно спектрофотометрическим методом), в других содержание собственно флавоноида рутин (определяемые обычно методом ВЭЖХ). В сумме флавоноидов травы гречихи кроме основного флавоноида рутина также находятся сопутствующие ему другие флавоноиды, в частности, кверцетин, изокверцитрин, а также небольшие количества кофейной и хлорагеновой кислот. По данным содержание в траве гречихи флавоноидов в пересчете на рутин варьируется от 5,3 до 6,1 %, а собственно рутина от 2,5 до 3,7 %) [22].

В новых сортах гречихи, находящемся в селекционной проработке содержание флавоноидов в пересчете на рутин в стеблях варьировало от 1,0 до 2,0 %. В листьях за 4 года (1999 - 2002 г.г.) у сортов содержание флавоноидов рутина колебалось от 4,7 до 5,1 %, в соцветиях - от 3,7 до 4,3 %. В результате направленных селекционных работ были выведены сорта гречихи посевной отличающиеся высокой концентрацией флавоноидов в пересчете на рутин в надземной части растений. Сорт растения гречихи Башкирская Красностебельная, характеризуется ярко выраженной красной окраской цветков и высоким содержанием флавоноидов надземной части. Сорт гречихи создан методом гибридизации красноцветкового мутанта гречихи Рубра с красностебельными биотипами сортов Черноплодная, Уфимская и Чишминская. Содержание рутина в цветках нового сорта составляет 12,0-12,2 %, листьях - 8,0- 8,4 %, стеблях - 2,4-3,0 %. Сорт создан в целях использования надземной биомассы в качестве дешевого сырьевого материала для производства ценного лекарственного препарата Рутин [23, 24].

Нами было проанализировано большое количество образцов травы гречихи сорта Башкирская Красностебельная и мы пришли к выводу, что максимальное накоплении флавоноидов в пересчете на рутин в процессе вегетации растения было зафиксировано в фазу массового цветения - начало плодоношения исходя из этого можно рекомендовать проводить заготовку травы гречихи в середине августа, когда в стеблях накапливается максимальное количество флавоноидов (Таблица 2).

Таблица 2 - Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в зависимости от фазы вегетации

Время сбора	№ образца	Фаза вегетации	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
1	2	3	4
21.06.14	1	начало вегетации	4,86 + 0,02
28.06.14	2	вегетация	5,01 + 0,03
06.07.14	3	начало цветения	5,10 + 0,02
18.07.14	4	цветение	5,19 + 0,03
29.07.14	5	цветение	5,27 + 0,04
09.08.14	6	массовое цветение	5,41 + 0,03
17.08.14	7	массовое цветение - начало плодоношения	5,67 + 0,04
28.08.14	8	начало плодоношения	5,59 + 0,04
12.09.14	9	трава после обмолота	2,51+ 0,04

Имеются данные по влиянию сушки травы гречихи на изменение содержание рутина. По данным при сушке листьев гречихи посевной при 70 ˚С в течение 12 часов произошло снижение содержания рутина на 8 %. В работе указано на наличие в траве гречихи ферментов двух видов, в присутствии которых происходит гидролиз рутина до кверцетина, что свидетельствует о возможности снижения содержания рутина в процессе заготовки и сушки сырья [26].

Исходя из всего вышеперечисленного, нами были сделан вывод, что содержание рутина в траве гречихи зависит от сорта, времени сбора и режима сушки.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Основные характеристики основных и вспомогательных материалов

2.1.1 Основная характеристика готового продукта

Нами разработана спецификация на готовый продукт рутин исходя из требований Европейской Фармакопеи (Таблица 3) [27].

Таблица 3 - Спецификация на готовый продукт рутин

№	Наименования показателей	Требования
1	2	3
1	Описание	Желтый или зеленовато-желтый порошок
2	Идентификация ИК-спектроскопия ТСХ	ИК-спектр исследуемого образца полностью совпадает с ИК-спектром стандартного образца рутозида тригидрата Основное пятно на хроматограмме испытуемого раствора по расположению, окраске и размеру должно соответствовать основному пятну на хроматограмме стандартного раствора
3	Потеря в массе при высушивании, %	От 5,0 до 9,0
4	Растворимость	Практически нерастворим в воде Мало растворим в безводном этаноле Растворим в растворах щелочей и растворах с образованием солей Растворим в метаноле
5	Количественное определение в пересчете на безводное вещество, %	От 95,0 до 100

2.1.2 Основные характеристики сырья

Нами разработана спецификация на сырье исходя из требований Государственной Фармакопеи ГФ ХI, ГФ ХII (Таблица 4) [28, 29].

Таблица 4 - Спецификация на гречихи траву и цветки

№	Наименования показателей	Требования
1	2	3
1	Описание	Цельное сырье: стебель прямой, в верхней части ветвистый, красноватый. Листья очередные, треугольные или яйцевидные со стреловидным основанием, на верхушке заостренные; черешки нижних листьев длинные, верхние листья почти сидячие. Цветки собраны в кисти, образующие щитовидную метелку; околоцветник простой, венчиковый, розовый, красный
2	Потеря в массе при высушивании, %	Не более 12
3	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %	Не менее 2,5
4	Содержание дубильных веществ в пересчете на танин, %	Не менее 2,7
5	Экстрактивные вещества, извлекаемые водой, %	Не менее 20,0
1	2	3
6	Зола нерастворимая в 10 % растворе хлористводородной кислоты, %	Не более 2,0
7	Органические примеси, %	Не более 2,0
8	Минеральные примеси	Не более 2,0
9	Зараженность амбарными вредителями	Не допускается
10	Инородные включения: плесень, гниль, стекло, камни, помет грызунов и птиц, примесь ядовитых растений	Не допускаются
11	Наличие устойчивого постороннего запаха не исчезающего при проветривании	Не допускается

2.2 Методики анализов

2.2.1 Методы анализа гречихи травы и цветков

Оценка качественных и количественных показателей в траве гречихи, проводилась по Государственной Фармакопеи XI, часть 1-2.

2.2.1.1 Описание

Внешние признаки. При определении внешних признаков обращают внимание на строение стеблей, листьев, цветков (плодов), рассматривая невооруженным глазом или с помощью лупы (10Х). При необходимости сырье размачивают, погружая его на несколько минут в горячую воду, а затем раскладывают на стекле или другой гладкой поверхности, расправляя стебель, листья, цветки. Если трава измельченная, то для размачивания выбирают куски стебля, листья, цветки.

В строении стебля отмечают его особенности: простой или ветвистый характер ветвления; форму поперечного сечения - стебель цилиндрический, ребристый, четырехгранный и т. д.; опушение; размеры (длину и диаметр у основания); расположение на стебле листьев (очередное, супротивное, мутовчатое); тип соцветия; строение листьев, цветков, плодов.

Цвет определяют на сухом сырье при дневном освещении; запах - при растирании; вкус - пробуя кусочек сухого сырья или его отвар (только у неядовитых объектов) [27].

2.2.1.2 Потеря в массе при высушивании, %

Под влажностью сырья понимают потерю в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ, которую определяют в сырье при высушивании до постоянной массы.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц около 10 мм, перемешивают и берут две навески массой 3-5 г, взвешенные с погрешностью +/- 0,01 г. Каждую навеску помещают в предварительно высушенную и взвешенную вместе с крышкой бюксу и ставят в нагретый до 100-105 °С сушильный шкаф. Время высушивания отсчитывают с того момента, когда температура в сушильном шкафу вновь достигнет 100 - 105 °С. Первое взвешивание листьев, трав и цветков проводят через 2 ч, корней, корневищ, коры, плодов, семян и других видов сырья - через 3 ч.

Высушивание проводят до постоянной массы. Постоянная масса считается достигнутой, если разница между двумя последующими взвешиваниями после 30 мин высушивания и 30 мин охлаждения в эксикаторе не превышает 0,01 г.

Определение потери в массе при высушивании для пересчета количества действующих веществ и золы на абсолютно сухое сырье проводят в навесках 1-2 г (точная навеска), взятых из аналитической пробы, предназначенной для определения содержания золы и действующих веществ вышеописанным методом, но при разнице между взвешиваниями, не превышающей 0,0005 г.

Влажность сырья (X) в процентах вычисляют по формуле:

(1)

где m - масса сырья до высушивания в граммах; m1 - масса сырья после высушивания в граммах.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, вычисленных до десятых долей процента. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать 0,5 % [27].

2.2.1.3 Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, % (разработанная аналитическая методика)

Точную навеску измельченного сырья 0,5 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляют 30 мл спирта 50 % и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее извлечение фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл и повторяют экстракцию еще два раза. После охлаждения объем раствора в колбе доводят спиртом 50 % до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр, получают раствор (А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 2,0 мл раствора А, 1,0 мл 10 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора спиртом 50 % до метки и перемешивают испытуемый раствор. Через 40 минут измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2, мл раствора А, 1,0 мл 1 % раствора уксусной кислоты и доведенный спиртом 50 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно, в тех же условиях, измеряют оптическую плотность рабочего раствора СО рутина, приготовленного следующим образом: 1,0 мл раствора СО рутина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1,0 мл 10 % спиртового раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора спиртом 50 % до метки и перемешивают. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1,0 мл раствора СО рутина, 1,0 мл 1 % раствора уксусной кислоты и доведенный спиртом 50 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в % (Х) вычисляют по формуле:

(2)

где А0 - оптическая плотность рабочего раствора СО рутина, А - оптическая плотность испытуемого раствора, а - навеска образца в г, а0 - навеска СО рутина в г, Р - содержание основного вещества в СО рутина, %, W-потеря в массе при высушивании, %.

Приготовление раствора СО (стандартного образца рутина). Берут около 0,05 г СО рутина (Sigma, каталожный номер R5143 или аналогичного качества) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 85 мл спирта 96 % при нагревании на теплой водяной бане, охлаждают, доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и перемешивают. Срок годности раствора 6 месяцев при хранении в защищенном от света месте.

Приготовление 10 % спиртового раствора алюминия хлорида. Берут 10,0 г алюминия хлорида, растворяют в 50 мл спирта 96 % в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем тем же спиртом до метки и перемешивают. Срок годности раствора 6 месяцев при хранении в защищенном от света месте.

2.2.1.4 Содержание дубильных веществ в пересчете на танин, %

Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья, просеянного сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Жидкость охлаждают до комнатной температуры и процеживают около 100 мл в коническую колбу вместимостью 200-250 мл через вату так, чтобы частицы сырья не попали в колбу. Затем отбирают пипеткой 25 мл полученного извлечения в другую коническую колбу вместимостью 750 мл, прибавляют 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титруют при постоянном перемешивании раствором перманганата калия (0,02 моль/л) до золотисто - желтого окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт:1 мл раствора перманганата калия (0,02 моль/л) соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин.

Содержание дубильных веществ (X) в процентах в пересчете на абсолютное сухое сырье вычисляют по формуле:

(3)

где V - объем раствора перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование извлечения, в миллилитрах; V1 - объем раствора перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование в контрольном опыте, в миллилитрах; 0,004157 - количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл раствора перманганата калия (0,02 моль/л) (в пересчете на танин), в граммах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах; 250 - общий объем извлечения в миллилитрах; 25 - объем извлечения, взятого для титрования, в миллилитрах [27].

2.2.1.5 Экстрактивные вещества извлекаемые водой, %

Определение экстрактивных веществ в сырье проводят в случае отсутствия в нормативно - технической документации метода количественного определения действующих веществ.

Около 1 г измельченного сырья (тонкая навеска), просеянного сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 200-250 мл, прибавляют 50 мл растворителя, указанного в соответствующей нормативно-технической документации на лекарственное растительное сырье, колбу закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью +/- 0,01 г) и оставляют на 1 ч. Затем колбу соединяют с обратным холодильником, нагревают, поддерживая слабое кипение, в течение 2 ч. После охлаждения колбу с содержимым вновь закрывают той же пробкой, взвешивают и потерю в массе восполняют растворителем. Содержимое колбы тщательно взбалтывают и фильтруют через сухой бумажный фильтр в сухую колбу вместимостью 150-200 мл. 25 мл фильтрата пипеткой переносят в предварительно высушенную при температуре 100-105 °С до постоянной массы и точно взвешенную фарфоровую чашку диаметром 7-9 см и выпаривают на водяной бане досуха. Чашку с остатком сушат при температуре 100-105 °С до постоянной массы, затем охлаждают в течение 30 мин в эксикаторе, на дне которого находится безводный хлорид кальция, и немедленно взвешивают.

Содержание экстрактивных веществ в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

(4)

где m - масса сухого остатка в граммах; m1 - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах [27].

2.2.1.6 Зола нерастворимая в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, %

Около 1 г препарата или 3-5 г измельченного лекарственного растительного сырья (точная навеска) помещают в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый, кварцевый или платиновый тигель, равномерно распределяя вещество по дну тигля. Затем тигель осторожно нагревают, давая сначала веществу сгореть или улетучиться при возможно более низкой температуре. Сжигание оставшихся частиц угля надо тоже вести при возможно более низкой температуре; после того как уголь сгорит почти полностью, увеличивают пламя. При неполном сгорании частиц угля остаток охлаждают, смачивают водой или насыщенным раствором аммония нитрата, выпаривают на водяной бане и остаток прокаливают. В случае необходимости такую операцию повторяют несколько раз. Прокаливание ведут при слабом красном калении (около 500 °С) до постоянной массы, избегая сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждают в эксикаторе и взвешивают. К остатку в тигле, полученному после сжигания препарата или лекарственного растительного сырья, прибавляют 15 мл 10 % раствора хлористоводородной кислоты, тигель накрывают часовым стеклом и нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. К содержимому тигля

прибавляют 5 мл горячей воды, обмывая ею часовое стекло. Жидкость фильтруют через беззольный фильтр, перенося на него остаток с помощью горячей воды. Фильтр с остатком промывают горячей водой до отрицательной реакции на хлориды в промывной воде, переносят его в тот же тигель, высушивают, сжигают, прокаливают, как указано выше, и взвешивают [28].

2.2.1.7 Органические и минеральные примеси

Оставшуюся часть аналитической пробы после отсева измельченных частиц (для цельного сырья) или сход с верхнего и нижнего сит (для резаного, дробленого и другого измельченного сырья) помещают на чистую гладкую поверхность и лопаточкой или пинцетом выделяют примеси, указанные в нормативно - технической документации на лекарственное растительное сырье. Обычно к примесям относят:

- части сырья, утратившие окраску, присущую данному виду (побуревшие, почерневшие, выцветшие и т. д.);

- другие части этого растения, не соответствующие установленному описанию сырья;

- органическую примесь (части других неядовитых растений);

- минеральную примесь (земля, песок, камешки).

Одновременно обращают внимание на наличие амбарных вредителей.

Каждый вид примеси взвешивают отдельно с погрешностью +/-0,1 г при массе аналитической пробы более 100 г и с погрешностью +/-0,05 г при массе аналитической пробы 100 г и менее.

Содержание каждого вида примеси в процентах (X) вычисляют по формуле:

(5)

где m1 - масса примеси в граммах; m2 - масса аналитической пробы сырья в граммах [27].

2.2.1.8 Зараженность амбарными вредителями

Исследование на наличие амбарных вредителей проводят в обязательном порядке при приемке лекарственного растительного сырья, а также ежегодно при хранении.

Сырье проверяют на наличие живых и мертвых вредителей путем осмотра невооруженным глазом и с помощью лупы (5 - 10X) при внешнем осмотре, а также при определении измельченности и содержания примесей. При этом обращают внимание на наличие частей сырья, поврежденных амбарными вредителями. Кроме сырья, тщательно просматривают швы, складки упаковочного материала, щели в ящиках. При обнаружении в сырье амбарных вредителей определяют степень его зараженности, используя специально выделенную аналитическую пробу.

Аналитическую пробу сырья просеивают сквозь сито с размером отверстий 0,5 мм. В сырье, прошедшем сквозь сито, проверяют наличие клещей; в сырье, оставшемся на сите, - наличие моли, точильщика и их личинок и других живых и мертвых вредителей. Количество клещей подсчитывают, используя лупу, моли, ее личинок, куколок и других вредителей - невооруженным глазом и с помощью лупы. Количество найденных вредителей и их личинок пересчитывают на 1 кг сырья и устанавливают степень его зараженности.

При наличии в 1 кг сырья не более 20 клещей (клещ мучной, клещ волосатый, клещ хищный, сухофруктовый клещ) зараженность сырья клещом относят к I степени; при наличии более 20 клещей, свободно передвигающихся по поверхности сырья и не образующих сплошных масс, - ко II степени; если клещей много, они образуют сплошные войлочные массы, движение их затруднено - к III степени.

При наличии в 1 кг сырья амбарной моли и ее личинок, а также хлебного точильщика и других вредителей в количестве не более 5 зараженность сырья относят к I степени; при наличии 6-10 вредителей - ко II степени, более 10 вредителей - к III степени.

В случае обнаружения в лекарственном растительном сырье амбарных вредителей его подвергают дезинсекции, после чего просеивают сквозь сито с размером отверстий 0,5 мм (при зараженности клещами) или с диаметром отверстий 3 мм (при зараженности другими вредителями).

После обработки сырье используют в зависимости от степени зараженности. При I степени зараженности сырье может быть допущено к медицинскому применению, при II степени и в исключительных случаях при III степени зараженности сырье может быть использовано для переработки с целью получения индивидуальных веществ [27].

2.2.1.9 Инородные включения

При установлении при внешнем осмотре наличия плесени и гнили, засоренности посторонними растениями в количествах, явно превышающих допустимые нормы, партия может быть принята только после того, как будет рассортирована и вторично предъявлена к сдаче [29].

2.2.1.10 Наличие устойчивого постороннего запаха

При обнаружении в сырье затхлого, устойчивого постороннего запаха, не исчезающего при проветривании, ядовитых растений и посторонних примесей (помет грызунов и птиц, стекло и др.), зараженности амбарными вредителями II и III степеней партия сырья не подлежит приемке [29].

2.2.2 Методы анализа рутина

Оценка качественных и количественных показателей в готовом продукте рутине, проводилась по Европейской Фармакопеи 7.0, том 1., Государственной Фармакопеи XII, часть 1.

2.2.2.1 Описание

Желтый или зеленовато-желтый, кристаллический порошок [27].

2.2.2.2 Подлинность

Идентификация А: 50,0 испытуемого вещества растворяют в метаноле R, доводят объем до 250,0 мл тем же растворителем и при необходимости фильтруют. 5,0 мл раствора доводят до 50,0 мл метанолом R, Определение проводят в диапазоне от 210 нм до 450 нм, у раствора должно наблюдаться 2 максимума поглощения, при длинах волн 257 нм и 358 нм. Удельный показатель поглощения в максимуме поглощения при длине волны 358 нм должна составлять от 305 до 330, в пересчете на безводное вещество.

Идентификация Б: абсорбционная спектрофотомерия в инфракрасной области. Препарат сравнения: рутозоида тригидрата CRS.

Идентификация С: тонкослойная хроматография. Испытуемый раствор. 25 мг испытуемого вещества растворяют в метаноле R и доводя объем до 10,0 мл тем же растворителем. Стандартный раствор. 25 мг рутозоида тригидрата CRS растворяют в метаноле R и доводят объем до 10, 0 тем же растворителем. Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля GR. Подвижная фаза: бутанол R, уксусная кислота безводная R, вода R, метилэтиленкетон R, этилацетат R (5:10:10:30:50), нанесение 10 мкл. Хроматографирование: расстояние, пройденное подвижной фазой от линии старта, должно составлять не менее 10 см, высушивание проводить на воздухе. Детектирование: пластинку опрыскивают смесью 7,5 мл 10 г/л раствора калия феррицианида R и 2,5 мл железа (III) хлорида раствора R1 и исследуют в течении 10 минут. Результаты: основное пятно на хроматограмме испытуемого раствора по расположению, окраске и размеру должно соответствовать основному пятну на хроматограмме стандартного раствора.

Идентификация D: 10 мг испытуемого вещества растворяют в 5 мл спирта R, прибавляют 1 г цинка R и 2 мл хлороводородной кислоты R1. Должно появиться красное окрашивание [27].

2.2.2.3 Родственные примеси

Испытания проводят методом жидкостной хроматографии. Испытуемый раствор: 0,10 г испытуемого вещества растворяют в 20 мл метанола R и доводят объем до 100,0 мл подвижной фазы В. Стандартный раствор (a): 10,0 мг рутозоида тригидрата CRS растворяют в 10,0 мл метанола R.Стандартный раствор (b): 1,0 мл стандартного раствора (а) доводят до объема 50,0 мл подвижной фазы В.

Колонка:

- размеры: длина - 0,25 м, диаметр - 4,0 мм;

- наполнитель: силикагель октилсильный для хроматографии R (55 мкм),

- температура: 30 °С.

Подвижная фаза:

Подвижная фаза А: смешивают 5 объемных частей тетрагидрофурана R и 95 объемных частей 15,6 г/л раствора натрия дигидрофосфатаR, pH которого доводят до 3,0 фосфорной кислоты R.

Скорость потока 1 мл/мин. Детектирование: спектрофотометрический детектор при длине волны 280 нм, вводимая проба 20 мкл.

Относительное время удерживания по пику рутозоида (время удерживания - около 7 мин.): примесь В - около 1,1; примесь А - около 1,2; примесь С - около 2,5.

Пригодность хроматографической системы: стандартный раствор (а) :

- отношение максимум/минимум - не менее 10, где Н_з - высота пика примеси В, считая от нулевой линии, а Н_v_-высота самой нижней точки кривой, соединяющей пик примеси В и пик рутозоида, считая от нулевой линии.

Норм: идентифицируют пики примесей путем сравнения с хроматограммой, прилагаемой к рутозоида тригидрата CRS:

- поправочные коэффициенты: для правильной оценки содержания умножают площади пиков следующих примесей на соответствующий поправочный коэффициент: примесь А - 0,8; примесь С - 0,5;

- примесь А: не более площади основного пика на хроматограмме стандартного раствора (b) (2,0 %);

- примесь В: не более площади основного пика на хроматограмме стандартного раствора (b) (2,0 %);

- примесь С: не более площади основного пика на хроматограмме стандартного раствора (b) (2,0 %);

- общее содержание примесей: не более 2-кратной площади основного пика на хроматограмме стандартного раствора (b) (4,0 %);

- неучитываемые примеси: пики площадью не более 0,05 площади основного пика на хроматограмме стандартного раствора (b) (0,1 %) [27].

2.2.2.4 Растворимость

В фармакопейном анализе понятие растворимости приводится в качестве характеристики приблизительной растворимости лекарственного вещества при температуре от 15 до 25 °С. Испытание следует проводить при фиксированном значении температуры, обычно 20 +/- 2°С, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Если растворимость является показателем чистоты субстанции (что должно быть указано в частной фармакопейной статье), то в разделе следует представлять конкретные количественные соотношения субстанции и растворителей.

Рекомендуется использовать растворители разной полярности (обычно три); не рекомендуется использование легкокипящих и легковоспламеняющихся растворителей (например, диэтиловый эфир) или очень токсичных (например, бензол, метилен-хлорид).

В фармакопее растворимость вещества выражают в следующих терминах (в пересчете на 1 г), по таблице 5.

Таблица 5 - Растворимость веществ

Термин	Примерное количество растворителя (мл), необходимое для растворения 1 г вещества
1	2
очень легко растворим	до 1
легко растворим	от 1 до 10
растворим	от 10до 30
умеренно растворим	от 30 до 100
мало растворим	от 100 до 1000
очень мало растворим	от 1000 до 10000
практически нерастворим	10000 и выше

Субстанцию считают растворившейся, если в растворе при наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества. В растворе могут содержаться следовые количества физических примесей, таких как волокна фильтровальной бумаги и других. Для субстанций, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в частной фармакопейной статье.

Термин "смешивается с..." используется для характеристики жидкостей, смешивающихся с указанным растворителем во всех соотношениях.

Если указано, что субстанция растворима в жирных маслах, то имеется в виду, что она растворима в любом масле, относящемся к классу жирных масел.

Методика определения растворимости. К навеске, растертой в тонкий порошок субстанции прибавляют отмеренное количество растворителя и непрерывно встряхивают в течение 10 мин. при 20 +/- 2 °С.

Для медленно растворимых препаратов, требующих для своего растворения более 10 мин., допускается нагревание на водяной бане до 30 °С. Наблюдение производят после охлаждения раствора до комнатной температуры и энергичного встряхивания в течение 1-2 мин.

Условия растворения медленно растворимых препаратов указывают в частных фармакопейных статьях.

Для субстанций с неизвестной растворимостью испытание проводят по следующей методике.

К 1,00 г растертой субстанции прибавляют 1,0 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она очень легко растворима.

Если субстанция растворилась не полностью, к 100 мг растертой субстанции прибавляют 1,0 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она легко растворима.

Если субстанция растворилась не полностью, добавляют 2,0 мл растворителя и продолжают растворение. Если субстанция полностью растворилась, она растворима.

Если субстанция растворилась не полностью, добавляют 7,0 мл растворителя и продолжают растворение. Если субстанция полностью растворилась, она умеренно растворима.

Если субстанция растворилась не полностью, к 10 мг растертой субстанции прибавляют 10,0 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она мало растворима.

Если субстанция растворилась не полностью, к 10 мг растертой субстанции прибавляют 100 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она очень мало растворима.

Если субстанция не растворилась, она практически нерастворима в данном растворителе.

Для субстанций с известной растворимостью испытание проводят по описанной выше методике, но только для крайних значений, относящихся к указанному термину. Например, если субстанция растворима, то 100 мг растертой субстанции не должны растворяться в 1,0 мл растворителя, но должны раствориться полностью в 3,0 мл растворителя [31].

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Результаты лабораторной отработки получения и очистки рутина

Полученные нами фактические данные подтверждают, что сорта гречихи накапливают максимальное количество рутина во всех органах в фазу - массового цветения. Содержание рутина в стеблях, листьях и цветах гречихи в разные фазы развития было также проверено методом ВЭЖХ. На хроматограммах очень хорошо подтверждается закономерность - увеличение содержания рутина в период массового цветения и уменьшение его по мере созревания плодов. Полученные данные приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Сравнительная характеристика содержания рутина в разные периоды вегетации

Время сбора	Фаза вегетации	Сумма флавоноидов в пересчете на рутин, %	Содержание рутина, ВЭЖХ, %
1	2	3	4
06.07.14	начало цветения	5,27	2,77
09.08.14	массовое цветение	5,41	3,57
28.08.14	образование спелых плодов	2,51	1,98

Известно, что содержание рутина в различных частях травы гречихи неодинаково. Так, содержание рутина выше в цветах и листьях по сравнению со стеблями. Проанализировав, несколько сортов гречихи мы пришли к выводу, что сорта, имеющие более яркую окраску, накапливают больше флавоноидов в листьях, чем в цветках, а менее окрашенные - в цветках больше, чем в листьях. В листьях в зависимости от сорта содержание рутина составляет от 5 до 55 мг/г; в цветках - от 5 до 65 мг/г; в стеблях от 0,5 до 20 мг/г в пересчете на сухое вещество [24].

На разных партиях сухой травы гречихи проверено соотношение стебли: листья и цветы, оно составляет от 40 до 60 %. Проведен анализ сырья, разделенного на компоненты, и показано, что отделение стеблей на стадии подготовки сырья дает увеличение содержания рутина в исходном сырье почти вдвое (Таблица 7). Для лабораторной отработки далее использовали траву с отобранными стеблями. Содержание рутина определяли методом ВЭЖХ, а сумму флавоноидов - спектрофотометрическим методом.

Таблица 7 - Содержание рутина в различных частях травы гречихи

№	Образец	Содержание рутина, %	Сумма флавоноидов, %
1	2	3	4
1	Листья и цветы	7,4	9,2
2	Стебли	1,1	1,8
3	Цельное растение (50:50)	4,3	5,5

3.1.1 Описание разработанного лабораторного метода получения рутина из травы гречихи посевной

Для лабораторной отработки использовали траву с отобранными стеблями. Для получения рутина выбран сорт Башкирская Красностебельная, содержащий в цветах около 5 %, в листьях около 10 % рутина [24, 25].

Для получения рутина из травы гречихи посевной необходимо взять навеску травы в количестве 100 г поместить ее в подогреваемую емкость с 2,0 л экстрагента, выдержать при слабом кипении 30 минут, отфильтровать в горячем виде через двойной тканевый фильтр и отжать. Экстракт охладить до комнатной температуры и выдержать при температуре 10 ^оС не менее 16 часов. Шрот залить второй порцией экстрагента, довести его до кипения и выдержать 30 минут при слабом кипении, далее обработать так же, как первую порцию. Выпавший осадок отфильтровать на воронке Бюхнера через тканевый фильтр плюс бумагу фильтровальную «белая лента» в вакууме водоструйного насоса, промыть осадок 20-30 мл ледяной воды очищенной и отжать.

Осадок сушить до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 80 ^оС. Высохший продукт размолоть в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния. Порошок рутина - сырца поместить в подогреваемую емкость, загрузить спирт в соотношении 50 мл на 1 г продукта. Суспензию довести до кипения (около 78 ^оС), выдержать при слабом нагреве 30 мин и отфильтровать через фильтровальную бумагу «белая лента». Осадок на фильтре промыть 100 мл горячего спирта, объединяя с фильтратом.

Фильтрат поместить в грушевидную колбу, заполняя ее не более чем на 0,4 объема, отогнать растворитель на ротационном испарителе при температуре 50 ^оС досуха. Сухой остаток перенести в обогреваемую емкость, загрузить горячую воду в соотношении 150 мл на 1 г продукта и нагреть при перемешивании до полного растворения. Водный раствор охладить до комнатной температуры, поместить в холодильник и выдержать при температуре 10 ^оС не менее 16 часов.

Выпавший осадок отфильтровать на воронке Бюхнера через тканевый фильтр плюс бумагу фильтровальную «белая лента» в вакууме водоструйного насоса, промыть осадок 20-30 мл ледяной воды очищенной и отжать. Полученный рутин сушить до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 80 ^оС. Высохший продукт размолоть в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния.

Разработанная нами схема получения рутина из травы гречихи посевной в лабораторных условиях представлена в виде блок-схемы на рисунке 2.

Лабораторные эксперименты показали, что использование травы гречихи с большим содержанием рутина дает более высокий выход готового продукта с большей степенью извлечения. В опытах использовалось сырье с содержанием рутина 8,5 %, средний выход рутина составил около 6,5 %, степень извлечения из сырья около 80 %. В следующих опытах 31-40 использовалось сырье с содержанием рутина 5,9 %, средний выход рутина составил около 4,2 %, степень извлечения из сырья около 70 %. Около 1-2 % рутина остается в шроте, использование более бедного по рутину сырья значительно понижает выход до 3,5-4,5 %.

Подготовка сырья

трава гречихи

Трава гречихи с содержанием рутина 6 % и более

Экстракция, фильтрация

горячая

вода 100 °С

Кристаллизация, отделение рутина-сырца 1

фильтрат

Растворение рутина-сырца

горячая

Кристаллизация, отделение рутина-сырца 2

вода 100 °С

фильтрат

Сушка рутина-сырца

Очистка рутина-сырца

спирт 96 %

76 °С

Готовый продукт рутин 96 %

Рисунок 2. - Блок-схема получения рутина в лабораторных условиях

Повысить содержание рутина в исходном сырье можно:

- спользуя сорт гречихи, более богатый рутином (например, Башкирская Красностебельная или подобный) и используя более редкий посев, чем на зерно, что даст больший процент листьев и цветов в сырье;

- проводя сбор травы гречихи в оптимальные сроки - от начала массового цветения до первых созревших плодов (показано, что содержание рутина уменьшается при массовом поспевании зерен);

- Отделяя стебли, возможно на фазе сушки. Стебли гречихи содержат много балластных веществ, значительно осложняющих процесс фильтрования осадка, и только 2÷1 процента рутина (наши данные), составляя 40-60 % от массы травы гречихи. Отделение стеблей позволяет вдвое увеличить содержание рутина в исходном сырье, повысить эффективность извлечения рутина и на последующих стадиях очистки снизить расходные нормы.

3.1.2 Подбор экстрагента

Опробован метод извлечения рутина с использованием в качестве экстрагента горячей воды и растворов солей кальция. Растворимость рутина в воде при 100 °С составляет 5 г/л, при охлаждении раствора до 20 °С она уменьшается в 40 раз, что обеспечивает хорошую кристаллизацию и высокий выход. Однако при экстракции рутина водой из растительного материала попутно экстрагируются посторонние примеси - компоненты клеточных стенок: полисахариды и пектин, которые повышают вязкость раствора, осложняя фильтрацию, а при охлаждении экстракта также выпадают в осадок, что снижает чистоту конечного продукта.

Проведено два эксперимента с использованием в качестве экстрагента воды. В одном сырьем служила цельная трава гречихи со стеблями, извлечено 33 % рутина. Во втором сырье отобрано от стеблей, извлечено 70 % рутина. Суспензия фильтруется плохо.

При использовании в качестве экстрагента водных растворов солей кальция образуются нерастворимые в воде комплексы, что способствует снижению экстракции посторонних примесей из сырья и помогает повысить чистоту целевого продукта. Из сырья извлекается 70- 80 % рутина. Улучшаются и режимы фильтрации суспензии рутина (в лабораторных условиях до 8 часов фильтруется сырец при водной экстракции и 10-30 мин при экстракции раствором хлористого кальция).

Использование 1,0 % хлористого кальция не дает преимуществ по выходу и составу рутина по сравнению с 0,6 % раствором, поэтому после сравнения в качестве экстрагента использовался 0,6 % раствор хлористого кальция.

Для проведения второй экстракции применяли 0,6 % раствор хлористого кальция, затем, предположив, что нерастворимые соединения кальция уже образовались на первой стадии, попробовали в качестве экстрагента на этой стадии использовать воду очищенную. Результат получился не хуже, чем для раствора хлористого кальция, остановились на данном варианте для дальнейшей работы - первая экстракция 0,6 % раствором хлористого кальция, вторая - водой очищенной. Полученные данные приведены в Таблице 8.

Таблица 8 - Зависимость выхода рутина от способа экстракции хлористым кальцием

Стадия, гидромодуль, экстрагент	Выход рутина, %	К^*, %	Содержание рутина, %	Родственные примеси, %
1	2	3	4	5
1 стадия (1:10) - раствор 0,6 % СаСl₂ 2 стадия (1:10) - раствор 0,6 % СаСl₂	3,0 г - 6,0 1,9 г - 3,8 ∑ 4,9 г - 9,8	79	89,8	В - 1,3 А - 2,9 С - 1,0 ∑ - 5,2
1 стадия (1:20) - раствор 0,6 % СаСl₂ 2 стадия (1:20) - вода	2,7 г - 5,4 1,8 г - 3,6 ∑ 4,5 г- 9,0	73	93,8	В - 1,3 А - 3,1 С - 1,2 ∑ - 5,6
1 стадия (1:20) - раствор 0,6 % СаСl₂ 2 стадия (1:20) - вода	3,4 г - 6,8 1,4 г - 2,8 ∑ 4,8 г- 9,6	89	92,2	В - 1,4 А - 3,2 С - 1,0 ∑ - 5,6
1 стадия (1:15) - раствор 1,0 % СаСl₂ 2 стадия (1:5) - раствор 1,0 % СаСl₂ 3 стадия (1:5) - раствор 1,0 % СаСl₂ 4 стадия (1:5) - раствор 1,0 % СаСl₂	5,23 г - 4,8 1,54 г - 1,4 1,4 г - 1,3 1,17 г - 1,1 ∑ 9,4 г - 8,5	79	88,4	В - 1,8 А - 2,4 С - 1,5 ∑ - 5,7

где * - коэффициент извлечения рутина

3.1.3 Альтернативная схема получения рутина

Опробована схема получения рутина китайской фирмы Aplanat, в которой экстракция рутина проводится раствором окиси кальция (Таблица 9). Применялись растворы с концентрациями от 0,02 % до 0,1 % (в схеме производителя концентрации не указаны). Большие концентрации не использовались из-за высокого рН, т.к. рутин в щелочных растворах хорошо растворяется и его не удается извлечь из раствора, поэтому большие концентрации не использовали. При использовании в первом опыте 0,1 % раствора окиси кальция получена практически нефильтруемая суспензия, при меньшей концентрации экстрагента фильтрование было немного лучше.

Таблица 9 - Зависимость выхода рутина от способа экстракции окисью кальция

Стадия, гидромодуль, экстрагент	Выход рутина, %	К*, %	Содержание рутина, %	Родственные примеси, %
1	2	3	4	5
1 стадия (1:20) - раствор 0,1 % СаО	5,6 г - 5,6	70	88,7	В - 1,2 А - 2,5 С - 0,6 ∑ - 4,3
1 стадия (1:20) - раствор 0,02 % СаО 2 стадия (1:20) - раствор 0,02 % СаО	2,5 г - 5,0 0,3 г - 0,6 ∑ 2,8 г - 5,6	52	89,2	В - 1,3 А - 3,6 С - 1,0 ∑ - 5,9
1 стадия (1:20) - раствор 0,03 % СаО 2 стадия (1:20) - вода	2,8 г - 5,6 0,5 г - 1,0 ∑ 3,3 г - 6,6	67	88,5	В - 1,4 А - 3,3 С - 1,2 ∑ - 5,9
1 стадия (1:20) - раствор 0,05 % СаО 2 стадия (1:20) - раствор 0,05 % СаО	2,8 г - 5,6	69	89,3	В - 1,4 А - 3,7 С - 1,0 ∑ - 6,8

где * - коэффициент извлечения рутина

Были проведены эксперименты экстракции травы гречихи горячей очищенной водой, результаты отражены в таблице 10.

Таблица 10 - показатели процесса экстракции рутина очищенной водой

Стадия, гидромодуль, экстрагент	Выход рутина	К^*, %	Содержание рутина, %	Родственные примеси, %
1 стадия (1:15) - вода 2 стадия (1:15) - вода	5,5 г - 5,5 % 3,0 г - 3 % ∑ 8,5 г - 8,5 %	70	91,5	В - 1,3 А - 2,9 С - 0,8 ∑ - 5,0

Стадия, гидромодуль,

экстрагент

Выход рутина

К^*, %

Содержание

рутина,

Родственные примеси,

1 стадия (1:15) - вода

2 стадия (1:15) - вода

5,5 г - 5,5 %

3,0 г - 3 %

∑ 8,5 г - 8,5 %

91,5

В - 1,3 А - 2,9

С - 0,8

∑ - 5,0

где * - коэффициент извлечения рутина

Количество экстрагента и количество экстракций зависит от содержания рутина в исходном сырье и определяется растворимостью рутина. Если рутина содержится более 8 %, необходимы две экстракции; если рутина около 6 %, достаточно одной экстракции. Вторую экстракцию можно проводить очищенной водой. При содержании рутина менее 6 % вторую экстракцию можно заменить промывкой небольшим количеством горячей воды.

3.1.4 Родственные примеси в рутине

В соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи было определено содержание родственных примесей в образцах полученного рутина:

В - кемпферол-3-рутинозид.

А - изокверцитрин.

С - кверцетин.

Примеси определяли методом ВЭЖХ.

Фармакопейные требования: содержание не более 2 % каждой из этих примесей, в сумме они не должны составлять более 4 %. Из приведенной таблицы 11 видно, что больший вклад в завышение вносит примесь А - изокверцитрин.

Таблица 11 - Сравнительная характеристика содержания примесей в разных частях гречихи

№	Вид сырья	В	А	С	∑
1	2	3	4	5	6
1	трава гречихи с преобладанием листьев	1,3	1,8	0,1	3,2
2	трава со стеблями	0,7	5,0	2,0	8-9
3	трава с отобранными стеблями	1,2-1,5	2,5-3,0	0,7-1,0	4,3-5,5
4	норма, не более	2,0	2,0	2,0	4,0

3.1.5 Оценка возможности очистки рутина от родственных примесей

Изучена возможность очистки рутина от родственных примесей следующими сорбентами:

- силикагель 200-400 меш пор 60Å;

- уголь активированный ОУ-А;

- окись алюминия для хроматографии;

- полиамид 6 DF;

- цеолиты 3Х.

Для очистки использовали рутин с наибольшим количеством родственных примесей, результаты очитки от примесей представлены в таблице 12.

Таблица 12 - Результаты очистки рутина

№ опыта

Сорбент

Исходный образец (родственные примеси)

Очищенный образец

силикагель 200-400 меш, пор 60Å для колоночной хроматографии

примесь В - 0,6

примесь А - 8,8

примесь С - 0,3

нп* - 1,0

∑10,7 (9,7)

примесь В - 0,5

примесь А - 9,3

примесь С - 0,9

нп* - 1,1

∑11,8 (10,7)

уголь ОУ-А, активированный 5 часов при 120^оС

примесь В - 0,6

примесь А - 8,8

примесь С - 0,3

нп* - 1,0

∑10,7 (9,7)

примесь В - 0,6

примесь А -8,0

примесь С - (-)

нп* - 0,5

∑ 9,1 (8,4)

окись алюминия для хроматографии

примесь В - 0,6

примесь А - 8,8

примесь С - 0,3

нп* - 1,0

∑ 10,7 (9,7)

примесь В - 0,6

примесь А - 9,1

примесь С - (-)

нп* - 2,6

∑ 12,3 (9,7)

полиамид 6 DF

примесь В - 1,0

примесь А - 5,3

примесь С - 1,7

нп* - 0,7

∑ 8,7 (8,0)

примесь В - 0,9

примесь А - 5,5

примесь С - (-)

нп* - 3,7

∑ 10,1 (6,4)

цеолиты 3 X

примесь В - 0,7

примесь А - 5,2

примесь С - 3,8

нп* - 0,5

∑ 10,2 (9,7)

примесь В - 0,6

примесь А - 5,4

примесь С - (-)

нп* - 5,8

∑ 11,8 (9,7)

где * - неопределенные примеси

Все сорбенты, кроме силикагеля, привели к уменьшению количества примеси С - кверцетина до нуля, при этом практически не изменилось количество примеси А - изокверцитрина и возросло количество неопределенных примесей, т.е. в целом продукт не становится лучшего качества. Лучшие результаты дал активированный уголь, но лишь по сравнению с другими сорбентами, незначительно снизив количество изокверцитрина и не увеличив количество кемпферол-3-рутинозида и неопределенных примесей.

4 МЕТРОЛОГИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ

В ходе проведения исследований нами использовалось следующее лабораторное оборудование, посуда и реактивы (Таблица 13).

Таблица 13 - Лабораторное оборудование, посуда и реактивы

Название лабораторного оборудования, посуды, реактивов	Нормативный документ
1	2
спектрофотометр	-
хроматограф жидкостной	-
плита электрическая	-
эксикатор	ГОСТ 6371-73
шкаф сушильный	ГОСТ 7148-70
весы лабораторные	ГОСТ 19491-74
сита лабораторные	ГОСТ 6613-86
колба коническая	ГОСТ 25336-82
колба мерная	ГОСТ 1770-74
пробирка стеклянная	ГОСТ 1770-74
чашка фарфоровая	ГОСТ 9147-80
стакан стеклянный	ГОСТ 7148-70
обратный холодильник	ГОСТ 25336-82
алюминия хлорид	ГОСТ 3759-75
уксусная кислота ледяная	ГОСТ 61-75
спирт	ГОСТ 5962-2013
нитрат аммония	ГОСТ 29302-92
соляная кислота	ГОСТ 3118-77
метанол	ГОСТ 2222-95
кислота ортофосфорная	ГОСТ 6552-80
железа (III) хлорид	ГОСТ 4147-74
калия феррицианид	ГОСТ 4207-75
бутанол	ГОСТ 6006-78
метилэтиленкетон	каталожный номер CAS 78-93-3
этилацетат	ГОСТ 8981-79
натрия дигидрофосфат	ГОСТ4328-77
калий марганцовокислый	ГОСТ 20490-75
со рутина	sigma, каталожный номер R5143

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанных нами работ, был разработан лабораторный способ получения рутина, который мы отобразили в виде блок-схемы. Нами получен готовый продукт рутин, который по содержанию примесей флавоноидной природы не отвечает требования Европейской Фармакопеи и не может являться рутином фармакопейного качества. По всем проверенным требованиям, наши образцы готового продукта рутина соответствуют рутину пищевого качества, и могут применяться для производства биологически активных добавок к пище. В ходе проведенной работы нами были сделаны следующие выводы и рекомендации:

- для производства рутина использовать сорт гречихи богатый рутином, например, Башкирская Красностебельная; сбор и сушку травы проводить в фазу массового цветения начала плодоношения, когда в растении накапливается наибольшее содержание флавоноидов - 5,67 %, в пересчете на рутин. Для получения высокого выходы рутина удалять стебли на стадии сушки сырья. Так как стебли гречихи содержат много балластных веществ, значительно осложняющих процесс фильтрования осадка. Отделение стеблей позволяет вдвое увеличить содержание рутина в исходном сырье, повысить эффективность извлечения рутина на последующих стадиях очистки и снизить расходные нормы растворителей. При этом нами показано, что содержание суммы флавоноидов в листьях и цветах составляет 9,2 %, а содержание рутина 7,4 %.

- при проведении лабораторных экспериментов по получению рутина наилучшие результаты экстракции дает использование раствора хлористого кальция при первой экстракции, и горячей воды - при второй экстракции. Степень извлечения рутина при этом составляет 89 %, а содержание основного вещества - 92 %.

- используемые сорбенты, которые применялись для очистки рутина от примесей, кроме силикагеля, привели к уменьшению примеси кверцетина до нуля, при этом практически не изменилось количество изокверцитрина и возросло количество неидентифицированных примесей, т.е. в целом продукт не становится лучшего качества. Лучшие результаты дает активированный уголь, но лишь по сравнению с другими сорбентами, незначительно снижая количество изокверцитрина при постоянстве примеси кемпферол-3-рутинозида и неопределенных примесей.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Евдокимова, О.В. Препараты растительного происхождения при хронической венозной недостаточности / О.В. Евдокимова // Новая аптека. - 2006. - №4. - С. 11-12.

2. Крикова, А.В. Биологическая активность растительных источников флавоноидов / А.В. Крикова, Р.С. Давыдов, Ю.Н. Мокин // Фармация. 2006. - Т 54. - № 3. - С 17-18.

3. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов) / В.А. Куркин. - 2-е изд., перераб. и доп. - Самара: Офорт, 2007. - 1239 с.

4. Кисилев, В. Е., Коваленко, В. Е., Минаева В. Г. Гречиха как источник флавоноидов / В.Е. Кисилев, В.Е. Коваленко, В.Г. Минаева - М.: Наука, 1995. - 96 с.

5. Гречиха как источник флавоноидов / под ред. В.К. Шумного. - Новосибирск: Наука, 1985. - 243 с.

6. Патент США, патент № 2478168, 1949 г.

7. Патент Союза Советских Социалистических Республик. Способ получения рутина / Гренкевич Н.И., Баландина И.А., Эрман Б.И., Андреев В.С., Довженко Л.И., Ткачев А.Т. - № 681841, заявл. 2590118/23-04; опубл. 07.03.81, Бюл. №9. 2 с.

8. Патент Союза Советских Социалистических Республик. Способ получения препарата рутин / Альберг В.М., Синка А.Я., Ансо Я.Я. - № 112548, заявл. 1104576309; опубл. 24.04.58, Бюл. № 3. - 2 с.

9. Патент Союза Советских Социалистических Республик. Способ получения препарата рутин / Баландина И.А., Глызин В.И., Гринкевич Н.И., Городецкий Л.Ш., Кристалл З.Б., Шемеренкин Б.В. - № 904709, заявл. 2767467/28-13; опубл. 15.02.82, Бюл. № 6. - 2 с.

10. Патент Корея, KR20020015805, 2002 г.

11. Патент Украина, № 12544, 2005 г.

12. Минина, С.А. Каухова, И.Е. Химия и технология фитопрепаратов / С.А. Минина, И.Е. Каухова. - М.: ГОЭТАР - Медиа, 2009. - 559 с.

13. Георгиевский, В.П., Комисаренко, Н.Ф., Дмитрук, С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П. Георгиевский, Н.Ф Комисаренко, С.Е. Дмитрук. - Новосибирск: Наука, 1990. - 303 с.

14. Солдатенеков, А.Т., Колядина, Н.М., Шендрик, И.В. Основы органической химии лекарственных веществ / А.Т. Солдатенеков, Н.М. Колядина, И.В. Шендрик. - М.: Мир, 2001. - 192 с.

15. Аничков, С.В., Беленький, М.Л. Учебник фармакологии / С.В. Аничков, М.Л. Беленький. Ленинград: Медгиз, 1955. - 498 с.

16. Мелентьева, Г.А., Антонова, Л.А. Фармацевтическая химия / Г.А. Мелентьева, М.Л. Беленький. М.: Медицина, 1993. - 480 с.

17. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. Харьков: Торгсин, 1997. - 456 с.

18. Государственный реестр лекарственных средств. Том I. Официальное издание. - М.: 2008. - 1398 с.

19. НД 42-11607-01. Рутин.

20. НД 42-11781-01. Рутин.

21. Анисимова, М. М. Трава гречихи посевной - перспективный источник рутина / М.М. Анисимова // Труды X Всероссийского конгресса «Экология и здоровье человека». - , 2005. №10 - C. 17-18.

22. Смирнова, Е.Б. Гречиха как источник рутина ценного лекарственного сырья / Е.Б. Смирнова, В.А. Кузьминов // Вестник Саратовского госагроуниверситета имени Н.И. Вавилова. - 2010 . - № 8. - С. 35-38.

23. Анисимова, М. М. Анатомо-морфологическое исследование травы гречихи посевной // М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко II Медицинский альманах. - 2010. - № 3 (12). - С. 204-206.

24. Анисимова, М. М. Качественный и количественный анализ флавоноидов травы гречихи посевной / М.М. Анисимова, В.А. Куркин, В.Н. Ежков // Известия Самарского научного центра РАН. - 2010. - № 12 (33), № 1 (8). - С. 2011-2014.

25. Куркин, В.А. Создание ресурсосберегающих технологий переработки лекарственного растительного сырья / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, О.Е. Правдивцева, А.В. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, Ф.Ш. Сатдарова, Л.Н. Зимина, Д.Г. Буланкин, М.М. Анисимова, Л.Р. Сулейманова, Н.Р. Шагалиева, А.И. Хусаинова // Известия Самарского научного центра РАН. - 2010. - № 12. - С. 737-740.

26. Минина, С.А. Каухова, И.Е. Химия и технология фитопрепаратов / С.А. Минина, И.Е. Каухова. - М.: ГОЭТАР - Медиа, 2009. - 559 с.

27. Европейская Фармакопея 7.0, Т. 1, 2007. - 324 с.

28. Государственная Фармакопея СССР XI издание (выпуск 1). - М.: Медицина, 1987. - 594 с.

29. ОФС 42-0013-03 Общая фармакопейная статья. Правила приемки лекарственного растительного сырья методы отбора проб.

30. Государственная Фармакопея СССР XI издание (выпуск 2). - М.: Медицина, 1989. - 399 с.

31. Государственная Фармакопея Российской Федерации XII издание Т. 1. - М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - 704 с.

Просмотров работы: 6463

Код для цитирования:

VII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2015

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ РУТИНА

Студенческий научный форум - 2015
VII Международная студенческая научная конференция