VII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2015

Введение

Вирусы представляют собой особую форму жизни неспособную к функционированию вне организма хозяина. Являются облигатными внутриклеточными паразитами состоящие из молекулы нуклеиновой кислоты, носителя генетической информации, окруженной защитной белковой оболочкой. Вирусы не обладают собственным аппаратом для синтеза органических молекул, для осуществления их репликации необходим материал клетки хозяина. В живой природе существует огромное количество разнообразных вирусов, способных вызывать инфекционные заболевания у человека, животных, растений и бактерий (http://www.erudition.ru/).

С точки зрения эпидемиологии вирусные заболевания можно классифицировать на две составляющие: антропонозные – при которых болеет только человек, и зооантропонозные – заболевания, предающиеся от животных к человеку (http://med-books.info/).

В настоящее время особый интерес вызывает изучение сохранения и обнаружения вирусов в окружающей среде, при этом объекты внешней среды становятся причиной инфекций как животных, так и человека. Так, например, вирус гепатита А способен сохраняться в воде от 3 до 10 месяцев, в почве и окружающих предметах до 1 мес., попадая в восприимчивый организм способен вызвать инфекционный процесс (http://www.infectology.ru/).

Представители рода Hantavirus являются возбудителями особо опасных, природно-очаговых зоонозных инфекций: хантавирусного легочного синдрома (ХЛС) в Новом Свете и геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) на евразийском континенте. Среди мелких млекопитающих, инфицированных хантавирусами, важную роль в эпидемиологии инфекции играют мышевидные грызуны, выделяющие вирус с экскретами (мочой, фекалиями, слюной) в окружающую среду. Заражение человека происходит аэрогенным путем, при вдыхании контаминированных хантавирусом экскретов и субстратов внешней среды. (Ткаченко, Бернштейн 2012).

Для обнаружения хантавирусов в живой природе существуют различные методы диагностики. К сожалению, не все они являются результативными и легко доступными. Поэтому на данный момент времени, вопрос об установлении наиболее эффективного метода выявления хантавирусов в окружающей среде остаётся открытым.

Цель и задачи исследования:

Цель – на основании экспериментальных данных изучить возможность обнаружения хантавируса во внешней среде.

Задачи:

1.Отобрать разнообразные субстраты внешней среды на территории Приморского края для проведения экспериментов по сохранению хантавируса.

2. В экспериментальных условиях установить способность хантавируса сохраняться на разнообразных объектах окружающей среды.

3. Показать возможность использования некоторых методов обнаружения хантавирусов во внешней среде.

4. Показать эффективность использования метода иммуноадсорбции в качестве предварительной оценки образцов субстратов внешней среды, возможно контаминированных хантавирусом.

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Современное состояние проблем хантавирусных инфекций

1.1.1 Характеристика рода Hantavirus

Впервые возбудитель ГЛПС был обнаружен с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител в криостатных срезах легких полевой мыши, отловленной на эндемичной территории Южной Кореи в районе реки Хантаан, давшей название выделенному вирусу (Nichol, Spiropoulou, Rollin, Ksiazek).

В 1982 году в результате электронно-микроскопического исследования вируса Hantaan (McCormick, White еt al., Hung, 1982), были представлены доказательства о морфологическом сходстве его с вирусами семейства Bunyaviridae. При анализе РНК вируса Hantaan, адаптированного к клеткам VeroE6, оказалось, что геном хантавируса, подобно геному вирусов семейства Bunyaviridae, состоит из 3-х сегментов одноцепочечной РНК отрицательной полярности.

Сама классификация хантавирусов была предложена только в 1982 году в составе Доклада №4 международного комитета по таксономии хантавирусов. С тех пор эти правила подвергались лишь частичной корректировке. В последующих Докладах лишь подтверждался статус вновь открытых видов. В 2005 году вышел 8-й Доклад, полностью посвященный описанию нового вида. В настоящее время в международном комитете по таксономии вирусов зарегистрированы 23 иммунологически и генетически отличающихся друг от друга вида хантавирусов и их число продолжает увеличиваться (Nichol 2005; Vaheri 2008).

Научнаяклассификация:

Домен: Virus

Семейство: Bunyaviridae

Род: Hantavirus

Виды: Adenes virus; Bayou virus; Black Creek Canal virus; Cano Delgadito virus; Dobrava-Belgrade virus; El Moro Canyon virus; Hantaan virus; Isla Vista virus; Khabarovsk virus; Laguna Negra virus; Muleshoe virus; New York virus; Prospect Hill virus; Puumala virus; Rio Mamore virus; Rio Segundo virus; Saaremaa virus; Seoul virus; Sin Nombre virus; Thailand virus; Thottapalayam virus; Topografov virus; Tula virus, и др.

1.1.2 Географическое распространение рода Hantavirus

Наиболее многочисленную группу, среди инфицированных хантавирусами, мелких млекопитающих представляют мышевидные грызуны.

На европейской части России, а также в большинстве стран Европы, где регистрируется ГЛПС (Германия, Бельгия, Польша, Финляндия, Швеция, Норвегия, страны бывшей Югославии), доминирует вирус Puumala – носителем которого является рыжая полевка. В европейских странах, за исключением Финляндии, Швеции и Норвегии, обнаружена циркуляция вируса Dobrava-Belgrade, основным хозяином которого на Балканах является желтогорлая мышь. (Gligic, 1989, 1992; Avsic-Zupanc, 1995). Этот же вирус в странах восточной и центральной Европы, а также в центральных областях России циркулирует в популяциях полевой мыши. В 2005 году был выявлен геновариант вируса Dobrava-Belgrade в популяциях кавказской лесной мыши в Краснодарском крае (Ткаченко 2005).

Вирус Tula, циркуляция которого впервые была выявлена у Microtus arvalis на территории центральной России (Деконенко, 1996; Plyusnin, et al., 1996), позже был обнаружен у этого вида полевок и в других странах Европы (Pejcoch, et al., 1992). В Западной Сибири обнаружен в популяциях узкочерепной полевки и степной пеструшки (Якименко и соавт., 2002).

Изолят от сибирского лемминга, отловленного на полуострове Таймыр, оказался новым генотипом, получившим название вируса Topograpfov (Plyusnin et al., 1996).

На территории Хабаровского и Приморского краев в популяциях дальневосточной полевки выявлена циркуляция генотипа Khabarovsk (Яшина 2006).

Широкое распространение в странах Евразии имеет вирус Seoul, поскольку его природный хозяин – серая крыса- встречается практически повсеместно (Lee 1990).

Учитывая, что структура природных вирусных популяций определяется природным хозяином, занимающим определенный ареал, в Приморском крае разработаны и представлены (Симонов 2005) картографические данные о распространении доминирующих генотипов хантавируса, циркулирующих в регионе значительную площадь лесопокрытой территории края занимает носитель вируса Amur - восточноазиатская мышь и геноварианта Shokotovo вируса Puumala - красно-серая полевка. На равнинной территории доминирует полевая мышь – носитель геноварианта FarEast вируса Hantaan и дальневосточная полевка – носитель вируса Khabarovsk. В крае имеются очаговые территории, где в качестве носителей разных серотипов/генотипов в разной степени обитают два и более носителя хантавирусов.

По экспериментальным данным вирус Puumala (Kalilo 2006) способен сохранять инфекционность в течение 2-х недель при комнатной температуре в подстилке, зараженной выделениями грызунов. Вирус Hantaan по данным J/ Hardestam и соов., в условиях эксперимента сохранял инфекционность в течение 96 дней при +4ºС, при +20ºС до 9 дней.

Так как природными резервуарами хантавирусов и источником заражения людей являются в основном мышевидные грызуны, а аэрогенный путь заражения хантавирусом является одним из основных, то способность хантавируса сохраняться на субстратах внешней среды и его обнаружение с помощью лабораторных методов остается открытым по сей день. Рядом исследователей, при помощи полимеразной цепной реакции с образцами тотальной РНК, экстрагированной из проб субстратов внешней среды, РНК хантавируса была выявлена в пробах почвы, содержавших мелкие остатки хвойно-лиственной подстилки. Также подтверждением присутствия хантавирусов во внешней среде, могут служить результаты обнаружения хантавирусного антигена и РНК хантавируса в органах выделения у инфицированных восточноазиатских мышей.

Способность хантавирусов сохранять инфекционные свойства вне организма хозяина имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение. Выявление субвирионных компонентов хантавируса вне организма мышевидных грызунов, служит доказательством присутствия хантавируса во внешней среде очаговых территорий (Кушнарева, Слонова, Иунихина, Кушнарев 2010).

1.1.3 Эпидемиология хантавирусной инфекции

Согласно литературным данным, в настоящее время различают две нозоформы хантавирусной инфекции – геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), хорошо известная в странах евразийского континента, в том числе и в России, и хантавирусный кардиолёгочный синдром (ХКЛС), регистрируемый в странах Северной и Южной Америки.

Большая часть территории Приморского края является природным очагом ГЛПС для циркуляции трех основных серотипов хантавируса (Amur, Hantaan, Puumala). При этом заболевание характеризуется тяжелым течением и высокой летальностью (1,2-7,8%) (Иванис 2008).

В зависимости от разнообразия серотипов, циркулирующих на определённых территориях, различают весенне-летний и осенне–зимний подъёмы заболеваемости ГЛПС (Слонова 1999; Компанец 2002).

Важным фактором, влияющим на заболеваемость населения, является не только биологический (численность и инфицированность грызунов), но и социальный фактор, к которому относится, прежде всего, контакт населения с природными очагами инфекции и самим источником инфекции.

Как считает ряд авторов, воздушно-пылевое распространение хантавируса связано с инфицированием пылевых частиц воздуха при попадании на объекты внешней среды вируса от животных-носителей и образовании пылевого аэрозоля (Lee, Amer, 1981; Schmaljohn, Hjelle 1997). В связи, с чем воздушно-пылевой путь заражения хантавирусом человека и животных, признается как основной при хантавирусной инфекции.

Аэрогенный путь заражения предполагает определенную стабильность хантавирусов во внешней среде после выделения с экскретами мышевидными грызунами – природными носителями, однако, исследования по обнаружению хантавируса во внешней среде, условия длительности его сохранения вне организма хозяина пока единичные и получены в основном экспериментально.

1.2 Лабораторная диагностика хантавирусных инфекций

Первые штаммы вируса-возбудителя ГЛПС были выделены от инфицированных грызунов (полевой мыши и рыжей полевки), используя для заражения те же виды грызунов, отловленных на не эндемичных по ГЛПС территориях (Lee et al., 1978). Затем они были адаптированы к размножению в перевиваемых клетках А-549 и Vero E6 (McCormick et al., 1982). За сравнительно короткий период, используя клеточные культуры, во многих лабораториях на территориях эндемичных стран от больных ГЛПС и разных видов животных были выделены десятки хантавирусных штаммов, что способствовало детальному изучению антигенных и молекулярно-биохимических свойств хантавирусов.

При использовании клеточной культуры Vero E6, хантавирусы удается выделить не только из суспензий легких инфицированных животных, органа – где наиболее часто присутствует вирус, но и из других органов, а также из крови (Yan еt al., 1986). Установлено, что при размножении хантавируса на клеточной культуре Vero E6 происходит накопление гемагглютининов, которые выявляются при дополнительной обработке вируссодержащей жидкости высокоскоростным центрифугированием, сорбентами по методикам, предложенным Okuno et al. (1986), Кушнаревой и соавт. (1993).

Также хантавирусы способны размножаться на лабораторных животных: новорожденных белых мышах и крысах разных линий, монгольских песчанках при заражении вируссодержащей культуральной жидкостью (Компанец и соавт., 1996; Lee et al., 1981; Yanahigara et al. 1985; Lokugamage et al., 2004).

В настоящее время наибольшее распространение получил метод диагностики ГЛПС на основе использования флуоресцирующих антител. В 1978 году корейским ученым впервые удалось с помощью метода флуоресцирующих антител (МФА) обнаружить антиген вируса геморрагической лихорадки в легочной ткани диких грызунов, а также специфические антитела к этому вирусу в сыворотках крови людей, переболевших данной инфекцией. (Lee 1989). В прямом МФА флуоресцентным красителем (обычно флуоресцеин изотиоцианатом) метятся антитела, узнающие вирусный антиген. В непрямом МФА, который используется для детекции антивирусных антител в физиологических жидкостях больных ГЛПС (Верета, Елисова, Воронкова, 1993) антивирусные антитела находятся в исследуемом образце и немечены, после связывания с антигеном добавляются антитела против иммуноглобулинов человека, несущие флуоресцентную метку. По окончании реакции образцы микроскопируются в ультрафиолетовом свете с соответствующей длиной волны. В случае присутствия антител к вирусу в клетках с помощью флуоресцентного микроскопа наблюдают специфическое свечение.

Несмотря на свою широкую распространенность, МФА имеет ряд серьезных недостатков. Метод малопроизводительный и достаточно трудоемкий. Оценка результатов реакции носит субъективный характер, а в ряде случаев регистрируется неспецифическое свечение.

Новый метод диагностики был предложен Engvall и Perlmann и Van Weemen и Schuurs — твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на принципе меченых антител или антигенов с использованием в качестве метки определенного фермента (Enzyme Linked Immunosorbent Assay — ELISA, ИФА). Иммуноферментный анализ высокочувствителен, специфичен, прост и быстр в постановке. Используется, главным образом, метод непрямого ИФА. В качестве антигена применяется очищенный вирус, рекомбинантные белки или синтетические полипептиды, представляющие собой отдельные детерминанты структурных вирусных белков — нуклеокапсидный белок (который экспрессировался в бактериях Е. сoli), G1 и G2 (Schmaljohn, Sugiyama 1988).

Молекулярно — биологические методы — определение специфического участка ДНК/РНК в геноме возбудителя очень перспективны в плане ранней диагностики ГЛПС. Преимущества ПЦР имеют особое значение именно в отношении хантавирусов, поскольку эти вирусы плохо размножаются в клеточных культурах, не оказывают цитопатического действия и до сих пор не имеют удачной лабораторной модели. Диагностика ГЛПС с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) является высокочувствительным методом ранней диагностики. Данный метод трудоемок и требует наличия высококвалифицированного лабораторного персонала.

В настоящее время существует достаточное количество методов для выявления хантавирусов, но многие из них являются недостаточно чувствительными и легко доступными для обнаружения хантавирусов в окружающей среде. Поэтому на данный момент времени вопрос об установлении более эффективного метода диагностики хантавирусов остается открытым по сей день.

Глава 2 Материалы и методы

2.1 Материалы, использованные в процессе исследования

В ходе проведения эксперимента в качестве субстратов использовались частицы природного цеолита Чугуевского месторождения и бентонита Устиновского месторождения размером 0,05 мм. Образцы лесной почвы были взяты в кедрово-широколиственном лесу в б. Шамора (лето 2013), садово-огородной и луговой почвы в Уссурийском районе (лето 2013). Соевая солома и растительная подстилка из крольчатника, пыль из бытовых помещений были привезены из Яковлевского района (декабрь 2013), где периодически регистрируются случаи инфицирования людей особо опасной инфекцией ГЛПС.

Сбор материала проводился с соблюдением всех правил безопасности, для возможного предотвращения заражения инфекционными агентами с применением средств индивидуальной защиты (маска, шапочка, резиновые перчатки, защитные очки). Материал отбирался в пластиковые контейнеры, инструменты для сбора проб перед утилизацией были продезинфицированы.

2.1.1 Приготовление экспериментальных образцов

Подготовленные субстраты были автоклавированы при температуре 132ºС 2 бар в течение 60 минут.

Для сорбции хантавируса на частицах к 0,5 г сорбента добавляли 5 мл вируссодержащей культуральной жидкости (супернатант клеток Vero E6, инфицированных штаммом Aa 60343 геновариант Far East вируса Хантаан), затем содержимое тщательно перемешивали периодическим встряхиванием в течение 2-3 минут и смесь оставляли для осаждения сорбента в статическом состоянии оставляли при температуре +4ºС. Адсорбция препаратов проводилась в течение 1-3 дней, на 3 день надосадочную жидкость убирали, образцы помещали в холодильник при температуре +4ºС. Элюция проводилась через 1 и 2 недели. В качестве элюирующих растворов использовались: фосфатно – солевой буфер (ФСБ) с pH 7,2 и 5-10% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) приготовленный на ФСБ pH 7,2. Наличие хантавируса изучалось не только после использования элюирующих растворов, но и при исследовании комплексов «субстрат+вирус».

2.2 Методы, использованные при проведении эксперимента

2.2.1 Метод индикации инфекционных фокусов

Инфекционный титр вируса в надосадочной жидкости после адсорбции определяли методом индикации инфекционных фокусов под полужидким покрытием карбоксиметилцеллюлозы. После контакта в течение часа вируссодержащей жидкости в десятикратных разведениях с монослоем клеток при 37ºС, инокулят сливали, а монослой покрывали средой МЭМ, содержащей 0,6% карбоксиметилцеллюлозы. Панели с инфицированными клетками инкубиировали в течение 7 дней при температуре 37ºС в термостате с 5% содержанием СО₂. Затем среду покрытия сливали, монослой однократно отмывали раствором ФСБ (рН7,2) и дважды фиксировали абсолютным спиртом (в течение 15-20 минут), после чего в каждую лунку добавляли антихантавирусную сыворотку человека. После контакта при 37ºС в течение часа монослой трижды отмывали раствором БСА и вносили меченные пероксидазой антивидовые антитела или белок А. После контакта при 37ºС и отмывания панелей, присутствие хантавирусного антигена в клетках выявляли с помощью окрашивания смеси 3,3диаминобензидином и перекиси водорода. Инфекционные фокусы проявлялись в течение 15 минут. Опыт учитывается подсчетом инфекционных фокусов в соответствующих разведениях вируса. Титр вируса выражается в lg фокусообразующих единиц в 1 мл (ФОЕ/1 мл). Исходный титр хантавируса, используемого в эксперименте составлял 5-5,6 lg/ ФОЕ/мл.

2.2.2 Биологический метод

Одним из способов изучения биологических свойств хантавирусов является заражение чувствительных моделей лабораторных животных. В качестве лабораторной модели хантавирусной инфекции были взяты беспородные белые мыши в возрасте 12-24 часа после рождения. Животных заражали путем введения вирус содержащей культуральной жидкости в мозг в дозе 0,01 мл с помощью инсулинового шприца с соблюдением всех правил асептики.

В качестве опытных вирусов были взяты:

1. Хантавирус ПМ – 95 (геновариант Far East вируса Hantaan, выделенный из легких инфицированной полевой мыши в Спасском районе Приморского края в 1995 г. и адаптированного для культуры Vero E6) - контроль вируса.

2. Хантавирус ПМ-95-луг – экспериментальный вирус полученный при хранении на образцах луговой почвы в течение 7 дней при температуре +4˚С и успешно десорбированный белковым раствором. (опытный вирус).

В контрольном опыте было заражено 10 мышей (одна клетка) – (А). Опытным вирусом заражено 20 мышей (две клетки) (В) и (С).

На следующий день после заражения в контрольной клетке (А) выжило 6 мышей, в опытных из двух клеток (В) и (С) - 10 мышей.

Состояние животных оценивали ежедневно с 14 дня после заражения.

2.2.3 Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА), в иностранной литературе обозначенный как enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), является одним из эффективных, методов в лабораторной диагностике ГЛПС.

На основании авторских разработок А.П. Иванов и соавт. (1990) ФГУП Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН производит коммерческий препарат “Иммуноферментная тест-система (Хантагност) - для выявления хантавирусного антигена” - для обследования мелких млекопитающих на присутствие хантавирусной инфекции, этой же системой возможно определить наличие антигена и в других образцах при его достаточном количестве.

Методика выполнения:

1. Приготовление рабочих растворов и реагентов:

1.1 Используется концентрат фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) (*100) – рабочий раствор. Разводят до 1 л дистиллированной воды. Раствор предназначен для растворения иммуноглобулина человека класса G содержащий антитела к хантавирусу (ИГ+) и иммуноглобулина человека класса G не содержащий антител к хантавирусу (ИГ-). Хранят при температуре 2-8˚С в течение 3 суток.

1.2 Приготовление ФСБ-Т: во флакон, содержащий 0,5 мл твина-20 добавляют 5,0 мл рабочего раствора ФСБ и смесь осторожно перемешивают до однородного раствора, не допуская образования обильной пены. Полученный раствор переносят пипеткой в оставшийся объем (985 мл) рабочего раствора ФСБ. Раствор предназначен для отмывания планшета и для приготовления 1%-го раствора альбумина из бычьей сыворотки (БСА) в ФСБ-Т. Хранят при температуре 2-8˚С в течение 3-х суток.

1.3 ФСБ-Т –БСА – к 10 мл раствора ФСБ-Т добавляют содержимое из флакона с БСА и, не встряхивая, оставляют при комнатной температуре до полного растворения белка. Раствор предназначен для разведения коньюгата. Готовят перед употреблением.

1.4 Цитратно-фосфатный буферный раствор (ЦФБ)- к флакону с ЦФБ (*2) добавляют 6,0 мл дистиллированной воды и перемешивают. Раствор предназначен для приготовления раствора хромогена. Готовят перед употреблением.

1.5 Перекись водорода – таблетку гидроперита растворяют в 3 мл дистиллированной воды. Раствор перекиси водорода готовят перед употреблением.

1.6 Антиген хантавируса АГ+. Получают добавлением во флакон в объеме, указанном на этикетке. Готовят непосредственно перед употреблением.

1.7 ИГ+, ИГ- добавляют во флакон по 5,0 мл приготовленного раствора ФСБ. Растворы предназначены для сорбции планшет.

2. Проведение ИФА.

2.1 Сенсибилизация лунок планшета: планшет располагают согласно рекомендованной схеме, т.е вертикально так, чтобы буквы (от Н до А) находились вверху, а нумерация рядов (от1 до 12) справа. Вносят по 0,1 мл рабочего разведения анти-хантавирусного IgG (ИГ+) человека в нечетные ряды лунок и по 0,1 мл рабочего разведения нормального IgG человека (ИГ-) – в четные ряды лунок. Планшет накрывают крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре от 4 до 8˚С в течение 16-20 часов, или при температуре 37˚С в течение 3 часов.

2.2 Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют, лунки трижды промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края и сразу же удаляя раствор. Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.3 Внесение исследуемых образцов: в лунки планшета вносят по 0,5 мл исследуемых образцов суспензий, начиная от буквы Н до буквы А (один образец в две вертикально расположенные лунки- с анти-хантавирусным и нормальным IgG человека, а в последнюю пару лунок (А-11 и А-12) вносят по 0,05 мл контрольного антигена хантавируса. Панель накрывают крышкой и выдерживают в холодильнике при температуре от 4 до 8˚С в течение 16-20 часов, или при температуре 37˚С в течение 2 часов.

2.4 Промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки 5 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 4 раза, выдерживая с раствором по 5 мин.). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.5 приготовление рабочего разведения коньюгата: раствор для разведения коньюгата (1% р-р БСА в ФСБ-Т) в объеме 6,4 мл вносят во флакон, содержащий пероксидазный коньюгат и тщательно перемешивают. Коньюгат в рабочем разведении не хранить, использовать сразу.

2.6 Внесение коньюгата: по 0,05 мл рабочего разведения пероксидазного конъюгата вносят во все лунки планшета. Планшет накрывают крышкой и выдерживают при температуре 37˚С в течение 1 часа.

2.7 Приготовление раствора хромогена: 0,2 мл концентрата хромогена – тетраметилбензидина (ТМБ) добавляют при перемешивании в 12 мл цитратно-фосфатного буфера (ЦФБ), перемешать. Непосредственно перед внесением в лунки к приготовленному раствору ТМБ добавляют при перемешивании 0,02 мл раствора перекиси водорода.

2.8 промывание лунок планшета: после инкубации содержимое лунок удаляют и лунки 6 раз промывают раствором ФСБ-Т, заполняя их до края (1-й раз сразу же удаляя раствор, а последующие 5 раз, выдерживая с раствором по 5 минут). Планшет подсушивают постукиванием по 2-3 слоям фильтровальной бумаги до удаления видимых капель.

2.9 внесение раствора хромогена: приготовленный раствор хромогена немедленно вносят по 0,01 мл во все лунки планшета, который затем выдерживают при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

2.10 Стоп - реагент: для остановки реакции вносят во все лунки планшета по 0,05 мл стоп – реагента. Результат учитывают не позднее 20 минут.

3. Учет результата.

Результат учитывают спектрофотометрически по оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм. Положительной считают пробу в случае, когда ОП лунки с ИГ+ превосходит ОП лунки с ИГ- в 2,1 и более раз. При этом, если показатель ОП лунки с ИГ- менее 0,100 следует считать этот показатель как 0,100.

Рекомендуемая схема расположения панели и внесения образцов:

1	2	3	4	5	6	7	8	IgG анти-хантавирусный
1	2	3	4	5	6	7	8	IgG человека нормальный
9	10	11	12	13	14	15	16
9	10	11	12	13	14	15	16
17	18	19	20	21	22	23	24
17	18	19	20	21	22	23	24
25	26	27	28	29	30	31	32
25	26	27	28	29	30	31	32
33	34	35	36	37	38	39	40
33	34	35	36	37	38	39	40
41	42	43	44	45	46	47	АГ	Контрольный антиген
41	42	43	44	45	46	47	АГ

(1-47) исследуемые антигены.

2.2.4 Метод иммуносорбции с применением непрямого метода флюоресцирующих антител

Метод иммуносорбции основан на извлечении антител или антигенов из сложных смесей с помощью иммуносорбентов на основе реакции антиген-антитело.

Иммуносорбенты являются основными биоактивными компонентами тест-систем для иммунодиагностики. Иммуносорбенты для обнаружения антител к вирусам получают путем иммобилизации вирусов или антигенов на полимерном или неорганическом носителе.

Данный метод был взят в качестве ориентировочного экспресс метода диагностики. При проведении эксперимента (схема 1) нами была исследована возможность взаимодействия хантавируса, адсорбированного на различных субстратах (цеолит, бентонит, подстилка из крольчатника, пыль из жилых помещений, лесная почва), с гомологичными антителами. Приготовленный иммуносорбент смешивали с иммунной сывороткой, содержащей гомологичные антитела к данному вирусу (0,5 г иммуносорбента +0,5 мл сыворотки). Смесь ставили на контакт 24 ч при 4°С, затем центрифугировали. Надосадочную жидкость исследовали на наличие антител в растворе при применении НМФА. Титры полученных антител сравнивали с титром исходной сыворотки (1:2048).

Схема 1: Использование иммунных сывороток для установления наличия хантавируса, адсорбированного на субстратах внешней среды

СУБСТРАТ (0,5 г субстрата, проавтоклавирован) ВИРУССОДЕРЖАЩАЯ ЖИДКОСТЬ (5 мл супернатанта клеток Vero E6, инфицированных штаммом Aa 60343 геновариант Far East вируса Хантаан) адсорбция 24-72 ч +4°С ИММУНОСОРБЕНТ (методом индикации инфекционных фокусов установлено отсутствие в надосадочной жидкости хантавируса) ИММУННАЯ СЫВОРОТКА, содержащая гомологичые антитела к хантавирусу (получена при иммунизации белых лабораторных крыс) контакт 24 ч +4°С ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ Ат В НМФА (сравнение с исходным уровнем Ат)

2.2.5 Молекулярно-генетический метод

Наиболее современным, быстрым, точным и часто используемым методом для обнаружения вирусов в окружающей среде является молекулярно – генетический метод - полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данный метод позволяет обнаружить инфекционных возбудителей в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать практически невозможно.

Для выделения вирусной РНК использовали набор реагентов «АмплиСенс» («РИБО-сорб» и «РИБО-золь-С», «АмплиСенс Hantavirus-EPh», «Реверта-L», «ЭФ») для проведения полимеразно-цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с электрофоретичеcкой детекцией продуктов амплификации в агарозном геле согласно инструкции производителя. Образцы элюирующих растворов и субстраты, с адсорбированным на них хантавирусом, были исследованы с помощью метода ОТ-ПЦР на наличие специфической РНК.

Глава 3 Результаты и обсуждения

3.1 Результаты при использовании метода индикации инфекционных фокусов

В результате проведенного эксперимента все субстраты адсорбировали на себя хантавирус. За сутки были адсорбированы следующие субстраты: цеолит, бентонит, солома, растительная подстилка из крольчатника, пыль из бытовых помещений. В течение 3 дней полностью адсорбировали на себя вирус субстраты, полученные из лесной почвы (б. Шамора) и садово-огородной почвы (Уссурийский р-н) (рис 1).

Рисунок 1 Адсорбция хантавируса на почве и органических субстратах при температуре +4ºС.

При элюировании хантавируса из комплексов вирус + сорбент (Таб. 1) после адсорбции после 1 суток получили следующие результаты:

Эффективность эллюции, lg ФОЕ/1мл (исходный титр 5,5 lg ФОЕ/1мл)

Таблица 1 Элюция хантавируса из комплексов

«вирус + сорбент» после адсорбции.

Комплекс вирус + сорбент	5-10% БСА на ФСБ рН 7,2
Цеолит 0,05 мм	3,5
Бентонит 0,05 мм	3,5
Соевая солома	РНК
Садово-огородная почва	РНК
Лесная почва	>2,5
Растительная подстилка из крольчатника	н.и
Пыль из бытовых помещений	н.и

РНК - обнаружена специфическая РНК в ОТ-ПЦР

н.и – не исследовали

Через 1 и 2 недели хранения, при элюции раствором методом индикации инфекционных фокусов титр не определялся.

3.2 Результаты проведения биологического метода

До 19 дня клиническое состояние лабораторных мышей оставалось удовлетворительным, визуальных изменений не наблюдалось.

На 19 день в клетке (А) у животных развилась характерная неврологическая симптоматика: повышенная возбудимость, взъерошенность шерсти, резкая потеря массы тела, судороги, парез и паралич задних конечностей. В течение 3-х последующих дней все животные в данной клетке погибли. После гибели животных у них были взяты образцы внутренних органов (головной мозг, легкое, печень, почки, селезенка, кишечник) для обнаружения антигена хантавируса и специфических антител в суспензии легких.

Животных из клетки (В), при появлении первых клинических симптомов в клетке (А), забили на 19 день при полном отсутствии клинической симптоматики заболевания. Для усыпления животных использовался диэтиловый эфир. Так же, как и в предыдущем случае, был взят определенный набор органов.

В клетке (С) в ходе проведения всего эксперимента - 40 дней, у животных отсутствовали какие-либо признаки экспериментальной хантавирусной инфекции характерной для данной модели животных. На 40 день животных усыпили, были изъяты органы для постановки ИФА и НМФА.

В ходе экспериментабыла исследована суспензия лёгких лабораторных грызунов с помощью метода НМФА и установлено (Таб.2), что:

1. В клетке (А) антитела определились у всех 6 животных в титре от 1:256 до 1:512;

2. В клетке (В) у 4-х животных антитела в суспензии лёгких обнаружено не было, что может свидетельствовать о более поздней выработке специфически защитных антител в ответ на заражение экспериментальным вирусом;

3. В клетке (С) у 4-х грызунов были обнаружены специфические антитела с титром от 1:256 до 1:512, у остальных двух мышей антител обнаружено не было.

При изучении суспензии лёгких грызунов методом ИФА получены следующие результаты (Таб.2):

1. В клетке (А) – антиген в суспензиях легких обнаружен у всех животных (100%);

2. В клетке (В) – антиген в суспензии легких грызунов не обнаружен;

3. В клетке (С) – антиген обнаружен у 2-х из 6 грызунов (33%).

Таблица 2 Результаты исследования на 40-й день:

Мышь №		1	2	3	4	5	6
Клетка (А) хв-ПМ-95	АГ	+	+	+	+	+	+
	АТ	1:256	1:256	1:512	1:512	1:512	1:512
Клетка (В) хв ПМ-95луг	АГ	-	-	-	-
	АТ	-	-	-	-
Клетка (С) хв-ПМ-95луг	АГ	-	-	-	-	+	+
	АТ	-	-	1:512	1:512	1:256	1:256

*АГ- антиген;

*АТ-антитела.

Таким образом, в ходе эксперимента было установлено, что штамм вируса ПМ-95 (Far East вируса Hantaan) является высоковирулентным для новорожденных лабораторных белых мышей при внутримозговом заражении с развитием характерной клинической симптоматикой, наличием антигена в легких и высоким титром специфических антител.

Опытный вирус, полученный после долгого хранения на образцах почвы, утратил свою вирулентность для новорожденных белых лабораторных мышей, что проявилось в отсутствии клинических признаков в течение всего срока наблюдения (40 дней). Однако сохранил свои иммуногенные свойства, о чем свидетельствует наличие в крови высоких титров специфических антител.

Возможно, что при попадании хантавируса из организма чувствительного животного в окружающую среду под влиянием различных абиотических факторов происходит изменение его биологических свойств.

3.3 Результаты серологических методов

а. иммуноферментного анализа (ИФА)

Все образцы, полученные в ходе эксперимента (контроль вируса, элюаты, полученные после хранения комплекса «вирус+субстрат» в течение 2 недель) были изучены в ИФА. В результате определить АГ хантавируса удалось только в исходной вируссодержащей жидкости.

Таким образом, не смотря на то, что ИФА считается одним из наиболее эффективных методов в лабораторной диагностике, присутствие АГ хантавируса удается выявить, если его содержание в биологическом материале будет в большом количестве. Так как содержание хантавируса в субстратах окружающей среды является низким, получить результаты данным методом не удалось.

б. Иммуносорбция

Для установления снижения титра исходного вируса в надосадочной жидкости использовали непрямой метод флюоресцирующих антител.

В результате проведения серии опытов установлено, что все используемые иммуносорбенты снижали исходный титр вируса: максимальное снижение до 1:128 (в 16 раз) наблюдалось при использовании в качестве сорбентов бентонита, цеолита и растительной подстилки из крольчатника (Таб.3).

Таблица 3 Сравнение результатов иммуносорбции

вид субстрата в иммуносорбенте	титры антител в иммунной сыворотке
	до взаимодействия с иммуносорбентом	после взаимодействия с иммуносорбентом
цеолит 0,5 мм	1:2048	1:128
Бентонит	1:2048	1:128
подстилка из крольчатника	1:2048	1:128
пыль из жилых помещений (дом, летняя кухня)	1:2048	1:256
лесная почва б. Шамора)	1:2048	1:512

3.4 Результаты ОТ-ПЦР

В результате проведения ОТ-ПЦР получены данные о присутствии РНК хантавируса в элюатах не только при десорбции белоксодержащим раствором, но также при использовании раствора ФСБ (pH 7). Отмечено наличие специфической РНК после хранения элюатов (ФСБ pH 7,2 и 5% БСА) с цеолита (фракция 0,05 мм) и лесной почвы после хранения при +4°С до 7 дней (Таб.4).

Таблица 4 Результаты ОТ-ПЦР

Субстрат	Условия опыта	Результат ОТ-ПЦР
Контроль	Исходный	РНК+
Лесная почва	ч/з 1 сутки при t + 4ºС, элюция 5-10% БСА на ФСБ (pH 7,2) и ФСБ (pH 7,2)	РНК+
Садово-огородная почва	ч/з 1 сутки при t + 4ºС элюция 5-10% БСА на ФСБ (pH 7,2) и ФСБ (pH 7,2)	РНК+
Цеолит	7 дней при t + 4ºС элюция 5-10% БСА на ФСБ (pH 7,2)	РНК+
Лесная почва	7 дней при t + 4ºС элюция 5-10% БСА на ФСБ (pH 7,2)	РНК+
Соевая солома	ч/з 1 сутки при t + 4ºС элюция 5-10% БСА на ФСБ (pH 7,2) и ФСБ (pH 7,2)	РНК+
Пыль из помещений	н.и	-
Растительная подстилка	н.и	-

На современном этапе существует достаточное количество разнообразных методов диагностики хантавирусной инфекции, направленных на установление специфических антител, антигена или РНК вируса в биологических жидкостях, суспензиях органов больных и грызунов-носителей. Однако не все из методов применимы к поиску хантавируса вне организма природного хозяина, в окружающей среде.

В ходе проведенных экспериментов установлено, что хантавирус способен адсорбироваться на всех природных субстратах, отобранных на территории Приморского края и сохраняться определенное время (до 7 дней при + 4ºС). Что подтверждалось обнаружением специфической РНК в элюирующей жидкости в ОТ-ПЦР и присутствием антител у зараженных лабораторных животных.

Методом ИФА выявить антиген хантавируса в экспериментальных образцах не удалось, возможно, в связи с низким содержанием его после хранения на природных субстратах.

В связи с тем, что методы, которые можно использовать для обнаружения хантавируса в окружающей среде (ОТ-ПЦР, заражение лабораторных животных, вирусологический метод) являются трудоемкими, требуют дорогостоящих реактивов или требуют специальных условий для содержания лабораторных животных, необходимы способы, позволяющие предварительно оценить возможность заражения субстратов хантавирусами. Использование иммуноадсорбции с детекцией снижения титра антител после взаимодействия с иммуносорбентом (в эксперименте максимально в 16 раз по сравнению с исходным титром антител) позволяет применять данный подход в качестве ориентировочного, для обнаружения хантавируса на субстратах внешней среды.

Выводы

1. Всего было отобрано 7 образцов субстратов внешней среды из эндемичных по ГЛПС районов Приморского края.

2. Установлена возможность сохранения хантавируса в комплексе с цеолитом и образцами лесной и луговой почв в течение 7 дней при +4°С в экспериментальных условиях.

3. Установлена эффективность биологического и молекулярно-генетического методов для выявления хантавируса в субстратах внешней среды.

4. Методика иммуноадсорбции (с детекцией снижения титра антител в НМФА) может быть использована в качестве предварительной оценки образцов субстратов внешней среды, возможно контаминированных хантавирусом, для отбора и последующего исследования их с применением современных методов, таких как ПЦР.

Список литературы

1. Башкирев Т.А. К клинико-эпидемиологической характеристике лихорадки с почечным синдромом // Инфекции с природной очаговостью и заболевания вирусной этиологии. Тр. Казанского института эпидемиологии и гигиены. - 1959. – вып. 4. – С. 64-74.

2. Бузолева Л.С. Бифазные бентонитовые среды для диагностики кишечных инфекций: автореф. дис… канд. биол. наук. Владивосток,1990. –С. 22.

3. Верета Л. А., Елисова Т. Д., Воронкова Г. М. Обнаружение антител к вирусу Хантаан в моче больных ГЛПС // Вопр. вирусологии. — 1993. — № 1. — С. 18—21.

4. Вирусы [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.erudition.ru/

5. Вирусные гепатиты [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.infectology.ru/

5. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом/ Слонова Р.А., Ткаченко Е.А., Иванис В.А., Компанец Г.Г., Дзагурова Т.К. 2006г.

6. Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., Липская Г.Ю. и соавт. Генетическая дифференциация хантавирусов с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования// Вопросы вирусологии – 1996. Т.41, №1. С. 24-27.

7. Иванис В.А. Современные представления о патогенезе хантавирусной инфекции / Тихоокеанский медицинский журнал №2 - 2008.

8. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.medicum.nnov.ru/doctor/library/immunology/

9. Иунихина О.В. Вирусо-эпизотологическое обоснование воздушно – пылевого пути заражения хантавирусом: автореф. дис. канд. мед. наук Владивосток - 2010.

10. Кушнарева Т.В., Слонова Р.А. Роль прямого пути передачи хантавирусов – возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом среди мышей рода Apodemus // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2008. - № 2. – С. 57-61.

11. Кушнарева Т.В., Слонова Р.А., Иунихина О.В., Кушнарев Е.Л. Хантавирусы во внешней среде в природных очагах хантавирусной инфекции. Тихоокеанский медицинский журнал 2010, №3.

12. Медицинская и санитарная микробиология: учебное пособие для студ. высш. мед. учеб. заведений/ А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин, В.П. Широбоков,-2-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академика» 2006. Стр. 259-279.

13. Методы лабораторной диагностики геморрагической лихорадки с 

почечным синдромом. – М. – 1982.

14. Пути, механизмы и факторы передачи возбудителя инфекции [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://med-books.info/

15. Распространенность хантавирусов в окружающей среде (электронный ресурс) режим доступа http://elibrary.ru/item.asp?id=15242416

16. Симонов С.Б. Структурная организация сообществ грызунов и ее роль в поддержании очагов хантавирусной инфекции в Приморском крае: Дис. …д-ра геогр. наук. – Владивосток 2005. – С. 259.

17.Слонова Р. А., Астахова Т. И., Компанец Г. Г.  Итоги изучения ГЛПС на юге Дальнего Востока России // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1997. - № 5. – C. 97-101.

18.Слонова Р.А., Компанец Г.Г., Подогова Л.М. и соавт. Циркуляция хантавируса Сеул в популяциях синантропных грызунов и его значение в заболеваемости геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в Приморском крае // Вопр. вирусол. — 1999. - № 5. - С. 213 -217.

19. Ткаченко Е.А., Бернштейн А.Д., Дзагурова Т.К., и соавт. Сравнительный анализ эпидемических вспышек геморрагической лихорадки с почечным синдромом, вызванных вирусами Пуумала и Добрава/ Белград// Эпидемиол. вакцинопрофил. – 2005. -№4 (23) – С. 28-34.

20. Хантавирус - (электронный ресурс) режим доступа: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Hantavirus

21. Хантавирус- (электронный ресурс) режим доступа: http://www.eurolab.ua/dictionary

22. Хантавирусные инфекции – (электронный ресурс) режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

23. Хатько Н.И., Матусевич Л.Е., Добло А.Д. и соавт. К характеристике 

геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Среднем Поволжье и Предуралье // Природноочаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения. - Омск, 1998. – С. 97-98

24. Частная вирусология [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://vmede.org/

25. Якименко В.В., Деконенко А.Е., Дзагурова Т.К. и соавт. О распространении хантавирусов в Западной Сибири // Мед. паразитология и паразитарные болезни. – 2000. - № 3.- С. 21-28.

26. Яшина Л.Н. Генетическая характеристика хантавирусов, циркулирующих в Приморском крае России // Журнал микробиол., эпидемиол., и иммунобиол. – 2006. - № 3. – С. 78-81

27. Avsic-Zupanc T., Toney A., Anderson K. et al Genetic and antigenic properties of Dobrava virus: a unique member of the Hantavirus genus, family Bunyaveridae//J. Gen. Virol. 1995. - Vol.76.- P.2801-2808

28.Clement J., Underwood P., Ward D. et al. Hantavirus outbreak during military maneuvers in Germany // Lancet. -  1996. - P. 346-347.

29. Frey M.T., Vial P.  C., Castillo C.H., Godoy P.M., Hjelle B., Ferrés M.G. 

Hantavirus Prevalence in the IX Region of Chile. // Emerging Infectious Diseases. – 

2003. - Vol. 9, No. 7. – P. 827-832.

30. Gligic A., Dimkovic N., Xiao S.Y. et al. Belgrade virus: a new Hantavirus causing severe hemorrhagic fever with renal syndrome in Yugoslavia// J. Infect. Dis. – 1992. – N166. – P. 113-120.

31. Gligic A., Frusic M., Obradovic M. et al. Hemorrhagic fever with renal syndrome in Yugoslavia: antigenic characterization of Hantaviruses isolated from Apodemus flavicollis and Clethrionomys glareolus// Am. J. Trop. Med. Hug. – 1989. – Vol. 41, N 1. – P. 109-115.

32. Korva M., Duh D., Saksida A., Trilar T., AvsicZupanc T. The Hantavirus load in tissues of naturally infected rodents // Microbes.  Infect. – 2009.  Vol. 11, issue 3. – P. 344-351.

33. Lee H.W., Lee P. W., Baek L.J., Chu Y.K. Geographical distribution of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantaviruses // Arch. Virol. – 1990. – Suppl 1. – P. 5 – 18.

34. Lee H. W. Hemorrhagic fever with renal syndrome in Korea // Rev. infect, dis. - 1989. — Vol. 11, №. 4. — P. 864—876.

35. Lee H.W., Lee P. W., Johnson K. Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever // J. Infect. Dis. – 1978. – Vol.137. –P 298-308.

36. Nichol S.T., Spiropoulou C.F., Morzunov S., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Feldmann H., et al. Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness // Science – 1993. – Vol. 262. – P. 914-917.

37. Niklasson B., Jonsson M., Widegren I., Persson K., LeDuc J. A study of 

Nephropathia epidemica among military personnel in Sweden // Res. Virol.  1992. – 

Vol. 143, issue 3. – P. 211-214.

38. Pejcoch M., Danes L., Unar J. et al. Prevalence of Hantavirus infection in small mammals in the South Moravian Region // Cesk. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. – 1992. – Vol. 41, N 2. – P. 92-100.

39. Plyusnin A., Vapalahti O., Lundkvist A., et al. Newly recognized Hantavirus in Siberian lemmings // Lancet. – 1996. – Vol. 347. – P. 1835-1836.

40. Schmaljohn C, Sugiyama K,. et al Baculovirus expression of the small genome segment of Hantaan virus and potential use of the expressed nucleocapsid protein as a diagnostic antigen // J. Gen. Virol. — 1988. — Vol. 69. — P. 777—786.

41. Shi X., McCaughey C., Elliott R.M. Genetic characterisation of a Hantavirus isolated from a laboratory-acquired infection // J. Med. Virol. – 2003. Vol. 71. – P. 105–109.

42.Sin M.A., Stark K., van Treeck U., Dieckmann H., Uphoff H., Hautmann W., et al. Risk factors for hantavirus infection in Germany, 2005 // Emerg. Infect. Dis. - 2007 

41. Virus survival in the environment with special attention to survival al in sewage droplets and other environmental media of fecal or respiratory origin //M. D. Sobseyand J. S. Meschke 2003

42. McCormick J. et al., Sasso D.R., Palmer E. L. Kiley M. P. Morpholgical identification of the agent of Korean haemorrhagic fever (Hantaan virus) as a memmer of the Bunyaviridae // Lancet. -1982. – Vol. 3, N 1. – P 765-768.

43. Yan D. Y., Xie Y.J., Zhang C.A. et al. New isolates of HFRS virus in Sichuan, China and characterization of antigenic differences by monoclonal antibodies // Lancet. – 1986. – Vol.7, N 1. – P. 1328.

44.Yashina L., Zdanovskaya N., Ivanov L. Slonova R., Kompanez G., Hay R., Yanagihara R. Hantaviruses in Microtus fortis and Microtus maximowiczii in far-east Russia // Abst. 19 European Congress of Clinical Microbiology and Infection 

Deases, 16-19 May, 2009, Helsinki, Finland.

Код для цитирования: Скопировать