VII Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2015

Огромная роль во всех циклических процессах жизни в море принадлежит бактериям. Бактерии обладают громадной биохимической энергией и им свойственны многие разнообразные процессы гетеротрофного и аутотрофного характера. Благодаря своей высокой и разносторонней ферментной активности микроорганизмы, распространенные в водной толще, выступают как биокатализаторы реакций, составляющих основные звенья круговорота биогенных веществ. Им принадлежит выдающаяся роль в превращении и образовании органической материи.

Морские микроорганизмы чрезвычайно активны и являются важной составной частью морских экосистем. Бактерии способны образовывать метаболиты в процессе разложения и утилизации различных веществ, таких как: хитин, углеводороды нефти, лигнин, аммиак, мочевина и т.д. Бактерии выделяют токсины, тормозящие развитие других организмов, как защитные продукты метаболизма, вырабатываемые микроорганизмами в результате длительного естественного отбора.

Синтезируемые морскими микроорганизмами метаболиты можно использовать в различных областях пищевой и химической промышленности, медицины, экологии, научных исследованиях и т.д. что вызывает интерес для их изучения.

Цель работы: изучить биохимическую активность штаммов бактерий, выделенных из морской воды.

Задачи:

1. Отобрать пробы морской воды в б. Золотой рог, б. Круглая, б. Лазурная, б. Спортивная гавань и выделить из них изоляты и сформировать рабочую коллекцию морских микроорганизмов.

2. Охарактеризовать морфотипы выделенных бактерий.

3) Дать оценку биохимической активности выделенных культур микроорганизмов.

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Отбор проб

Пробы отбирались в летний период времени, 02.07.12 и 10.07.12 в бухте Золотой рог, бухте Лазурная, бухте Спортивная гавань, бухте Круглая (о. Русский).

Рис.1. Карта отбора проб

Пробы отбирались с глубины 10-15 см от поверхности воды в стерильную посуду (пластиковый шприц V=20 мл). Непосредственно перед отбором руки обрабатывали 95% этиловым спиртом. Бактериологическое исследование отобранных проб производился не позднее двух часов с момента отбора.

2.2 Описание мест отбора проб

Б.Золотой Рог — бухта в заливе Петра Великого Японского моря. По обоим берегам расположен город Владивосток. Бухта является удобным местом стоянки судов. Здесь также располагаются торговый и рыбный порты, судоремонтные предприятия.

Бухта вдаётся в северный берег пролива Босфор-Восточный между мысом Тигровый (43°06′ с. ш. 131°53′ в. д. (G) (O)) и находящимся в 1,2 морской мили к востоку-северо-востоку (ENE) от него мысом Голдобина. С северо-запада бухта ограничена полуостровом Шкота.

Глубины на входе в бухту составляют 20—27 м. Далее к вершине бухты они постепенно уменьшаются. Глубины у причалов от 5,2 до 15,2 метров. Грунт на дне илистый. Берега бухты Золотой Рог, изначально преимущественно холмистые и обрывистые, искусственно выровнены и местами расширены для портовых сооружений. Берег вершины бухты низкий, к нему выходит долина, по которой протекает речка Объяснения. Почти на всём протяжении берега укреплены стенками, оборудованы причалами и пирсами.

Бухта Золотой Рог защищена от волнения всех ветров, кроме штормовых. Осенью и зимой в бухте преобладают северные и северо-западные ветры, сопровождающиеся сухой и ясной погодой, а также понижением температуры и повышением атмосферного давления. Зимние и осенние ветры бывают продолжительными и достигают скорости 6—8 м/с и более. Летом дуют преимущественно южные и юго-восточные ветры, часты дожди и туманы. Летом и весной скорость ветра незначительно меньше, чем зимой.

Туманы в бухте наблюдаются с апреля по август. Чаще всего они наблюдаются в июне и июле. Как правило, туманы проявляются при юго-восточных ветрах, которые приносят их со стороны Уссурийского залива. Во время штиля туманы бывают реже.

Приливы в бухте Золотой Рог неправильные полусуточные.

Бухта расположена в центре Владивостока и интенсивно используется в городском хозяйстве. Её берега практически на всём протяжении обустроены причальными сооружениями и заняты под стоянку судов. На берегах бухты расположены Владивостокский морской торговый порт, Владивостокский рыбный порт, судоремонтный завод «Дальзавод», а также части Тихоокеанского флота. В результате небрежного использования экология Золотого Рога находится в бедственном положении. На поверхности её плавает мусор и видна масляная плёнка нефтепродуктов (Горкин А.П., 1998).

Б.Спортивная гавань в Приморском крае создана специально для судов, о чем и говорит ее название. Вдается залив в юго-восточный берег Амурского залива в нескольких километрах к северу от мыса Боброва. Здесь предусмотрена защита от нежелательных ветров и волнений двумя молами: южным, а также северным.

Северной вехой происходит ограждение оконечности южного мола, а у северного сооружена причальная стена, которая предназначена для катеров, а также судов. В средней части Спортивной гавани в Приморском крае ее глубина достигает от двух до четырех метров. От основания заграждения с юга гавани Спортивной в Приморском крае до мыса Бурный, вдоль обрывистого берега качественно оборудованы водные станции и купальные участки.

Амурский залив — внутренний залив у северо-западного берега залива Петра Великого (Японское море). Длина около 65 километров, ширина от 9 до 20 километров, глубина до 20 метров.

Амурский залив среди других акваторий Приморского края наиболее глубоко вдаётся в сушу и отличается значительной изрезанностью береговой линии. От открытого моря он отгорожен полуостровом Муравьёва-Амурского и протяжённой цепью островов архипелага Евгении. Вследствие относительно континентального климата, в заливе наблюдается наиболее раннее образование льда. Ледяной покров в заливе Угловом и бухте Новик появляется уже в конце ноября, а сходит только в конце марта — начале апреля. Тем не менее, уже в мае вода в этих заливах прогревается до +14 °C. Прочный припай, позволяющий безопасно передвигаться по льду, образуется в феврале и покрывает северную часть залива полностью. Максимальная граница распространения неподвижного льда обычно проходит восточнее линии мыс Песчаный — мыс Марковского (остров Попова).

Рельеф дна сравнительно ровный. От берегов вершины залива (в северной части) простираются обширные отмели. На юго-запад, в сторону выхода из залива глубины постепенно нарастают. К северу от линии мыс Песчаный — Вторая Речка средние глубины составляют 10—20 м. Напротив Владивостока и острова Русский глубины 15—30 м, напротив островов Попова и Рейнеке уже более 30 м. Максимальная глубина 50 м находится на входной линии залива между мысом Брюса и островом Рикорда.

На восточном берегу залива расположен порт и город Владивосток и посёлок Трудовое, а также большая курортная зона с пансионатами, санаториями и детскими лагерями. На северном побережье расположены населённые пункты Угловое, Прохладное, Зима Южная, Де-Фриз, Тавричанка и Девятый Вал.На западном побережье — Береговое, Перевозное и Безверхово.

На побережье залива находится мыс Щетининой.

Считается более тёплым по сравнению с соседним Уссурийским заливом (Горкин А.П., 1998; Лаппо Г.М., 1994).

Бухта Лазурная вдается в берег между мысом Зеленый, находящимся в 3 милях к NE от мыса Трех Камней, и мысом Крутой, отстоящим от мыса Зеленый на 1 милю к ENE. Входные мысы бухты обрывисты, скалисты, поросли лесом и окаймлены рифами. Берега бухты песчаные и отмелые, а прилегающая к ним местность представляет собой окаймленную горами низменность, покрытую луговыми травами и кустарником. В вершину бухты впадает река Лазурная.

Глубины в середине юго-западной части бухты Лазурная 4—7 м, по мере приближения к ее берегам они постепенно уменьшаются. Грунт — песок и камень.

Бухта Круглая расположена на острове Русский. Близко расположены бухты Воевода, Мелководная. Бухта Круглая вдается в северный берег бухту Воевода.

Северо-западным входным мысом бухты Круглая является низкий мыс Песчаный. Берега, прилегающие к входным мысам бухты Круглая, низкие, песчаные и отмелые (Горкин А.П., 1998).

2.3 Получение изолятов из проб морской воды

Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную, агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 – 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности до тех пор, пока среда не застынет. Поверхность araризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды. С этой целью чашки Петри открывают и застывшей средой вниз помещают на 20 – 30 мин в сушильный шкаф, нагретый до 70 – 80°. Предварительно шкаф необходимо простерилизовать.

После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем 0,1 мл исследуемой пробы и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

Колонии бактерий подсчитывают через день, колонии грибов и дрожжей – через 5 - 7, а колонии актиномицетов – через 7 - 15 суток инкубации в термостате.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки.

Из существующих способов выделения чистых культур наибольшее признание получил классический метод Коха. Он заключается в том, что посевной материал наносят на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри. Клетки микроорганизмов прикрепляются к определенному участку поверхности и при размножении образуют видимые глазом скопления-колонии. Из отдельных изолированных колоний микробов проводят пересев на питательную среду в пробирках («косяки») и через определенный промежуток времени (характерный для каждого вида микроорганизмов) получают чистую культуру в достаточном объеме.

2.4 Питательные среды

Для постановки биохимических тестов были использованы следующие питательные среды:

Питательный агар для культивирования микроорганизмов (г/л): пептон ферментативный, сухой для бактериологических целей – 9,0, гидролизат казеина ферментативный, неглубокой степени расщепления – 8,0, дрожжевой экстракт – 3,0, хлорид натрия – 5,0, натрий гидроортофосфат – 2,0+0,5, агар микробиологический – (10,5 +2,5), pH (7,2+0,2).

Среда для морских микроорганизмов (СММ)(питательная среда, адаптированная для морских гетеротрофов) – (г/л): CaCO₃ – 1.0, MgSO₄ – 1.0, пептон – 5.0, дрожжевой экстракт – 5.0, K₂HPO_{4 –} 0.2, глюкоза – 0.2, агар – 15.0, H₂O искусственная морская^* – 500 мл, H₂O дистиллированная – 500 мл; pH – 7.8–8.1 (YouchimizuKimura, 1976).

Искусственная морская вода (г/л): NaCl – 27.5, MgCl₂ – 5.0, MgSO₄·7H₂O – 2.0, CaCl₂ – 0.5, KCl – 1.0, FeSO₄ – 0.001 ( YouchimizuKimura, 1976 ).

Среда с твином. Питательный агар + твин 20, 60, 80. Инкубируют 3-5 дней при комнатной температуре, наблюдают рост и вокруг выросшей колонии помутнение среды.

Кровяной агар. Питательныйагар+ кровь. Инкубируют 3-5 дней при комнатной температуре, наблюдают рост и вокруг выросшей колонии просветление среды.

Гидролиз казеина. Способность бактерий минерализовать белки является таксономическим признаком и определяется по пептонизации казеина. Тестирование на протеолитическую активность проводили на молочномагаре. Для этого в стерильный голодный агар (1.8%) добавляли стерильное обезжиренное молоко (15 мл на 100 мл). Продолжительность культивирования от 3 до 5 дней. Гидролиз крахмала выявляется по зоне просветления вокруг укола.

Лицитиназная активность. Питательный агар+ 50 мл 10% эмульсия яичного желтка+ 0,5% активированного угля. Инкубируют 3-5 дней при комнатной температуре.

2.5 Определение активности летучих метаболитов бактерий методом Тирранен

Для качественной оценки действия летучих биологически активных веществ, продуцируемых сапрофитной микрофлорой, на рост патогенных бактерий L. monocytogenes использовали метод, предложенный Л.С. Тирранен (1989) в нашей модификации. Для этого с косого агара с испытуемыми культурами сапрофитных микроорганизмов, делали смыв. Полученной суспензией засевали чашки Петри со средой “газоном” (высевали штаммы бактерий выделенные из морской воды). Затем, бактериальными дисками, смоченными смывом с листериями, делаем реплики на поверхность незасеянной среды, разлитой равномерно на дно второй половины чашки Петри, так как разное количество среды в чашках может исказить полученные результаты. Одну половину чашки Петри с газоном испытуемой культуры закрывали другой половиной со свеженанесенными методом реплик тест-культурами и инкубировали в термостате при 20°С. Рост тест-организмов листерий зависел от действия летучих метаболитов, сапрофиты которые продуцировала испытуемая культура, выросшая на противоположной стороне чашки.

Реакции листерий на действие летучих метаболитов сапрофитов оценивали на 2-ой–3-ий день их совместного роста по разнице в размерах колоний тест-организмов в опыте и контроле, когда выросшие в контроле колонии тест-культур имели хорошо выраженный рост. Контролем служили чашки с тест-культурами, не подвергавшимися действию летучих продуктов жизнедеятельности испытуемых микроорганизмов.

Статистическую обработку данных проводили по Ф.Г. Лакину (1990). Учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний, ошибку средней арифметической. Воздействие испытуемой культуры на тест-культуру оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер колоний тест-культур в опыте был соответственно достоверно увеличен или снижен по сравнению с контролем.

Для построения кривой роста бактерий определяли динамику численности последних по мутности культуральной среды на спектрофотометре при длине волны 590 нм. Использовали среду Петерсона Кука с глюкозой. Продолжительность фаз роста определяли графическим методом (Шлегель, 1987).

А) Б)

В)

Рисунок 1- Определение активности летучих метаболитов (по Л. С. Тирра-нен, 1980): А) пример роста штаммов бактерий; Б) посев сапрофита газоном; В) скрепленные чашки

Глава 3. Результаты и обсуждения

В результате проведенной работы были получены следующие результаты. Всего было выделено 62 изолята бактерий из морской среды разных прибрежных акваторий. Для полученных изолятов были описаны морфотипы, представленные в таблице 1.

При проведении тестов из эксперимента были исключены штаммы которые давали эффект роения на агаре.

Таблица 1. Морфологическое описание, выделенных штаммов

04.07.2013

Место отбора проб

№ чашки

Штамм

Форма

Размер (мм)

Цвет

Край

Поверхность

Центр

порядковый номер

Бухта Круглая

1.1

1

круглая

1

бежевый

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

1

2

круглая

1

прозрачный

ровный

плоская,глянцевая

нет

2

3

круглая

0.5

прозрачный

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

3

4

круглая

0.7

прозрачный с бел.кр.

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

4

5

круглая

1.5

прозрачный с беж.кр.

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

5

1.2

1

круглая

1

бежевый с прозр.кр.

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

6

2.1

1

круглая

1.5

бежевая

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

7

2

круглая

1.5

прозрачная

ровный

плоская,глянцевая

нет

8

Бухта Золотой Рог

1.1

1

круглая

2

бежевая с прозр. кр.

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

9

2

круглая

1

светло-бежевая

не ровн.

выпуклая,глянцевая

есть

10

3

круглая

1.5-2

бежевая с темным кольц.

ровный

плоская,глянцевая

нет

11

4

овальная

3

бежевая с прозр. кр.

ровный

плоская,глянцевая

нет

12

5

округлая

4

прозрачная бледно-желт.

ровный

плоская,глянцевая

нет

12

2.1

1

круглая

2

бежевая с прозр. кр.

ровный

выпуклая,глянцевая

есть

14

2

круглая

2

молочная с пр. кр.

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

15

3

круглая

2

бежев. С прозр. Кольцом

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

16

4

круглая

1

центр желтый, ободок

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

17

5

круглая

2

прозрачно-желтая

ровный

плоская,глянцевая

нет

18

6

круглая

2

прозрачно-бежевая

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

19

Спортивная Гавань

1.1

1

круглая

4-5

бежев.с перламутр. кр.

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

20

2

округлая

3

бежевая

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

21

3

круглая

3

бежевая

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

22

2.1

1

круглая

5

бежево-прозрачная

не ровн.

плоская,глянцевая

есть

23/24/25

2

округлая

3-4

бежевая

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

26

3

овальная

6-7

прозрачная

не ровн.

плоская,глянцевая

нет

27

4

овальная

3

бежево-прозрачная

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

28

5

круглая

2

молочная

не ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

29

Шамора

1.1

1

круглая

1

молочно-бежевая

не ровн.

выпуклая,матовая

нет

30

2

круглая

3

бежевая

ровный

выпуклая,глянцевая

нет

31

05.07.2013

Бухта Круглая

1.2

1

круглая

5

бежевая

ровн.

выпуклая,глянцевая

есть

32

2

круглая

1

прозрачно-бежевая

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

33

Бухта Золотой Рог

1.2

1

круглая

5

прозрачно-бежевая

ровн.

выпуклая,глянцевая

есть

34

2

круглая

5

бежевая

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

35

2.2

1

круглая

5

бежево-прозрачная

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

36

2

круглая

5

бежево-молочная

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

37

Спортивная Гавань

1.1

1

округлая

2

прозрачно-бежевая с обод.

ровн.

плоская,матовая

нет

38

2

округлая

2

бежевая,вн.темная

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

39

3

круглая

5

прозрачно-бежевая

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

40

4

округлая

5

бежевая

не ровн.

плоская, глянцевая

есть

41

5

округлая

1

желтая

ровн.

плоская, глянцевая

нет

42

1.2

1

круглая

6-7

бежевая

ровн.

выпуклая,глянцевая

есть

43

2

круглая

4

молочная

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

44

3

круглая

2

желтая

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

45

4

круглая

5

розовая

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

46

Шамора

1.1

1

круглая

5-6

темно-желт.прозр. по кр.

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

47

2

круглая

7

молочная

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

48

3

круглая

5

ярко-желт.с пр. кр.

ровн.

плоская, глянцевая

есть

49

2.1

1

круглая

5

молочная

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

50

2

круглая

3-4

бледно-розовая

не ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

51

3

округлая

1

желто-оранжевая

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

52

4

круглая

4-5

бледно-желтая с пр. кр.

ровн.

плоская, глянцевая

есть

53

5

круглая

1-2

бежевая с пр. кр.

не ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

54

2.2

1

круглая

8

молочно-прозрачная

ровн.

выпуклая,глянцевая

есть

55

08.07.2013

Шамора

2.1

1

ромашк.

8-9

молочная

не ровн.

плоская,глянцевая

нет

56

2

ромашк.

4-5

молочная

не ровн.

плоская,глянцевая

нет

57

1.1

1

ромашк.

10

молочная

не ровн.

плоская,глянцевая

нет

58

1.2

1

круглая

3-4

желтая

ровн.

выпуклая,глянцевая

есть

59

Бухта Круглая

2.3

1

круглая

2-3

бледно-розовая

ровн.

выпуклая,глянцевая

нет

60

Спортивная Гавань

1.3

1

округл.

10-12

белая

не ровн.

плоская,матовая

нет

61

2

округл.

3-4

бледно-розовая

ровн.

выпуклая,глянцевая

есть

62

Определение активности летучих метаболитов

Для качественной оценки действия летучих метаболитов, продуцируемых сапрофитной микрофлорой, в качестве тест-культур использовали штаммы L. monocytogenes, взятых из музея НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, типичных по своим культуральным, серологическим и биохимическим свойствам.

Действие газообразных метаболитов испытуемых культур на рост тест-культур исследовали методом Л.С. Тирранен в нашей модификации. Результаты сравнения размеров колоний выражали в миллиметрах. При проведении статистической обработки данных учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний (M ).

Штамм сапрофита	Штамм Listeria monocytogenes
	9148/1	6144 № 315	15861 № 302	2780 № 318	5642/6 № 313	9156/2	12731/8- 8097	4835/6 № 310	8708	37206/4
										№ 311
1	5	4	4	5	5	4	3	3	4	5
4	5	5	5	4	5	4	4	5	5	4
5	4	3	4	5	5	5	3	3	4	3
10	6	7	7	8	9	7	9	8	8	8
12	9	9	8	8	9	8	7	7	6	7
13	6	7	6	8	8	8	6	7	7	7
14	8	8	8	7	9	7	6	7	8	8
15	6	5	7	7	6	6	8	6	7	6
17	6	6	6	7	7	7	6	6	7	6
18	8	7	7	6	6	7	6	8	7	6
20	15	8	12	9	15	12	13	7	10	12
22	13	8	9	15	14	11	8	9	10	11
23	13	9	15	10	15	13	13	10	14	10
25	5	6	6	7	5	6	6	7	7	8
27	6	6	7	8	6	7	7	7	8	5
29	9	9	8	6	7	8	8	9	5	6
30	8	9	9	10	10	9	9	10	10	9
31	9	8	9	8	7	9	9	9	8	8
33	4	5	5	5	4	4	4	5	4	4
34	9	9	8	8	7	8	7	8	7	8
35	9	8	9	9	6	7	9	9	8	9
36	7	7	7	8	7	6	7	7	9	10
37	5	5	4	6	5	5	4	4	4	3
38	6	6	5	6	7	6	5	6	6	4
40	7	5	6	4	7	5	6	6	6	5
41	8	8	9	6	7	8	7	6	6	7
42	9	8	6	7	8	9	10	9	8	9
43	8	8	9	8	8	9	8	9	8	9
44	8	6	7	8	8	7	7	7	8	6
46	8	8	7	7	6	7	7	6	9	7
47	8	8	8	9	10	9	9	8	8	11
50	10	9	9	9	10	10	9	9	8	8
51	10	10	9	9	8	8	8	8	8	5
53	8	8	7	9	9	7	8	9	9	9
54	9	8	9	9	8	8	7	8	9	9
55	8	8	7	6	5	7	8	8	8	7
56 пр.	9	8	7	8	9	10	10	9	8	8
56 бел.	9	8	7	6	6	6	6	6	8	7
57	8	9	9	10	10	10	9	9	9	8
58	9	8	8	7	7	8	9	8	8	9
59	8	7	8	9	9	7	8	9	9	9
60	4	4	5	5	3	4	4	5	4	4
61	9	8	7	7	6	6	8	7	6	7
62	9	7	7	8	8	9	9	8	7	7
63	6	6	8	4	7	6	5	5	6	5
66	8	8	7	6	8	7	7	8	8	7

Таблица 2. Диаметр роста колоний листерий (мм) под влиянием летучих метаболитов сапрофитных бактерий

Наиболее активные сапрофиты, отобранные с помощью метода Тирранен (штаммы № 20, 22, 23), в дальнейшем проверяли на активность метаболитов в жидкой среде. Для этого суточную культуру сапрофита смывали физиологическим раствором (5 мл на скошенный агар). Полученную жидкость отделяли от клеток центрифугированием при 5000 об/мин. в течение 15 мин и фильтровали через бактериальный фильтр с диаметром пор 0, 22 нм. Фильтрат добавляли во флаконы с 50 мл фосфатно-буферного раствора Петерсона–Кука, который использовали в качестве среды накопления для листерий. Культуру L. monocytogenes №7 и L. monocytogenes №8 вносили по 1 и 5 мл., их дальнейший рост наблюдали на спектрофотометре в течение 6 суток. Для определения биологического действия сапрофита снимали спектры поглощения серийных разведений суспензии на диапозоне длины волны 590 Нм. Затем данные спекторофатометра истользовали для посторения кривой роста.Контролем служила эмульсия L. monocytogenes (1 мл) без добавления фильтрата. Летучие метаболиты этих морских штаммов стимулировали рост всех штаммов L. monocytogenes, взятых в эксперимент по сравнению с контролем. Стимулирование роста культуры листерий наблюдали с максимумом на вторые и третие сутки. Для L. monocytogenes №7 в среде Петерсона - Кука с глюкозой с 1 мл. сапрофита большее влияние оказал сапрофит № 22 - рост культуры увеличился на 156%. Рост культуры с 5 мл. сапрофита составил 449%. Для L. monocytogenes №8 сапрофит № 23 оказал наибольшее влияние увеличив прирост биомассы в среде с 1 мл. сапрофита на 148%, а в среде с 5мл. сапрофита на 306% по сравнению с контролем.

В дальнейшем используемые штаммы были идентифицированны: Штамм № 20 E. Coli

Штамм № 22 Citrobacter freundii

Штамм №23 Acinetоbacter johnsorii

Таблица3. Динамика роста Listeriamonocytogenes №7 (штамм №318-2780) в среде Петерсона-Кука + 0,1% глюкоза с добавлением ЭМ (1 и 5 мл) сапрофитов № 20, 22, 23, выделенных из морской воды

Сутки	Контроль (L.m. 7)	Опыт (L.m.7+1 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.7+1 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.7+1 мл ЭМ 23)	Опыт (L.m.7+5 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.7+5 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.7+5 мл ЭМ 23)
исх	0,026	0,026	0,026	0,026	0,026	0,026	0,026
1	0,041	0,068	0,105	0,063	0,105	0,225	0,095
2	0,036	0,075	0,082	0,068	0,1	0,195	0,18
3	0,034	0,072	0,078	0,064	0,096	0,181	0,208
6	0,032	0,065	0,075	0,065	0,079	0,173	0,187

Таблица 4. Биологическое действие ЭМ (1 и 5 мл) сапрофитов № 20, 22, 23 на рост Listeriamonocytogenes №7 (штамм №318-2780) в среде Петерсона-Кука + 0,1% глюкоза

Сутки	Опыт (L.m.7+1 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.7+1 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.7+1 мл ЭМ 23)	Опыт (L.m.7+5 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.7+5 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.7+5 мл ЭМ 23)
исх	0%	0%	0%	0%	0%	0%
1	66%	156%	54%	156%	449%	132%
2	108%	128%	89%	178%	442%	400%
3	112%	129%	88%	182%	432%	512%
6	103%	134%	103%	147%	441%	484%

Рисунок 1. Динамика роста Listeriamonocytogenes №7 (штамм №318-2780) с ЭМ сапрофитов 20, 22, 23 (1 мл)

Рисунок 2. Динамика роста Listeriamonocytogenes №7 (штамм №318-2780) с ЭМ сапрофитов 20, 22, 23 (5 мл)

Таблица 5. Динамика роста Listeriamonocytogenes №8 (штамм №313 91791/В-5642/6) в среде Петерсона-Кука + 0,1% глюкоза с добавлением ЭМ (1 и 5 мл) сапрофитов № 20, 22, 23, выделенных из морской воды

Сутки	Контроль (L.m. 8)	Опыт (L.m.8+1 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.8+1 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.8+1 мл ЭМ 23)	Опыт (L.m.8+5 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.8+5 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.8+5 мл ЭМ 23)
исх	0,034	0,034	0,034	0,034	0,034	0,034	0,034
1	0,052	0,123	0,142	0,129	0,102	0,249	0,128
2	0,09	0,157	0,131	0,173	0,143	0,199	0,325
3	0,085	0,179	0,134	0,194	0,257	0,193	0,321
6	0,071	0,065	0,12	0,164	0,188	0,148	0,288

Таблица 6. Биологическое действие ЭМ (1 и 5 мл) сапрофитов № 20, 22, 23 на рост Listeriamonocytogenes №8 (штамм №313 91791/В-5642/6) в среде Петерсона-Кука + 0,1% глюкоза

Сутки	Опыт (L.m.8+1 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.8+1 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.8+1 мл ЭМ 23)	Опыт (L.m.8+5 мл ЭМ 20)	Опыт (L.m.8+5 мл ЭМ 22)	Опыт (L.m.8+5 мл ЭМ 23)
исх	0%	0%	0%	0%	0%	0%
1	137%	173%	148%	96%	379%	146%
2	74%	46%	92%	59%	121%	261%
3	111%	58%	128%	202%	127%	278%
6	-8%	69%	131%	165%	108%	306%

Рисунок 3. Динамика роста Listeriamonocytogenes №8 (штамм №313 91791/В-5642/6) с ЭМ сапрофитов 20, 22, 23 (1 мл)

Рисунок 4. Динамика роста Listeriamonocytogenes №8 (штамм №313 91791/В-5642/6) с ЭМ сапрофитов 20, 22, 23 (5 мл)

Таблица 7 . Постановка биохимических тестов

Место отбора проб	№ штамма	Протеолитическая активность (мм)	Гемолитическая ак-ть (мм)	Амилолитическая ак-ть (мм)	Лицитиназная ак-ть (мм)	Твин 20 Липолитическая акт-ть (мм)	Твин 60	Твин 80
Спортивная гавань	29	-	1,5	2,5	-	-	-	-
	44	-	-	1,6	-	3,5	3,5	3
	63	6	2	-	-	-	-	1
	22	4	-	-	-	2	1,5	-
	62	-	-	-	-	-	-	-
	42	-	-	-	-	-	-	-
	38	-	-	2,4	-	-	-	4
	40	1	-	-	-	-	2	-
	66	2,5	-	-	-	-	-	2
	23	2	-	2	-	2,5	-	2
	41	-	-	2,5	2	4	3	4,5
	43	-	-	-	-	-	-	-
	27	-	-	-	-	-	-	-
	25	-	-	-	-	1	2	2
	46	5,5	-	-	-	-	-	-
	20	3	-	-	-	-	2	-
	61	-	-	-	-	-	-	-
б. Золотой Рог	34	3,5	-	-	-	-	-	-
	14	6	4	2	-	2,5	2,5	2
	10	5,5	-	-	-	-	-	-
	13	-	-	1,5	-	2	-	-
	35	2,5	2	-	1	1	-	1
	15	3,5	-	-	2	4,5	4	5
	36	2	-	-	-	-	2,5	-
	17	4,5	-	2,5	-	-	-	-
	12	5	-	2	-	-	-	-
	37	3	-	-	-	5,5	2	6,5
	18	-	-	-	-	-	-	-
б. Лазурная	57	4	1	-	-	2	-	1
	56 пр	1	-	1	-	-	-	-
	51	2	2	1	-	-	-	-
	54	1	-	1	-	-	-	-
	56 бел.	-	1	-	-	-	-	-
	50	3	-	-	-	3,5	-	3
	59	1	-	-	1	2	3	3
	53	1	1	-	-	1	1	1
	47	1	1,5	-	-	-	-	-
	58	1,5	1	-	-	2	1	1
	56	-	1,5	-	1,5	1	-	-
	30	-	1	-	1	-	-	1
	31	2	1	-	1	1	-	1
	55	-	-	-	-	2	2	3
б. Круглая	4	1,5	-	-	-	-	1	-
	5	1	1	-	-	1	2	3
	60	1	-	-	-	-	-	-
	1	2	2,5	-	-	1	1	-
	33	-	-	-	-	-	-	-

Известно что развитие и жизнедеятельность микроорганизмов связанны с условиями внешней среды. Загрязнение окружающей среды, может оказывать влияние на биологическую активность микроорганизмов.

В ходе проведенных биохимических тестов была выявлена биологическая активность морских изолятов.

Наибольшая степень протеолитической, гемолитической, лицитиназной и липолитической активности наблюдается в бухте Лазурная что обусловлено высокой степенью антропогенной нагрузки данной бухты.

Высокая степень протеолитической и липолитической активности наблюдается в Спортивной Гавани. Так же в Спортивной Гавани были выделены штаммы, которые оказали наибольшую стимуляцию на рост патогенов.

Наименьшая степень биологической активности была выявлена в бухте Круглая. Данная бухта отдалена от города и практически не подвержена загрязнению что является причиной низкой биологической активности изолятов.

Выводы

1. Сформирована рабочая коллекция морских микроорганизмов.

2. Охарактеризованы морфотипы выделенных бактерий.

3. Методом Тирранен оценена степень активности летучих метаболитов сапрофитных бактерий, выделенных из морской воды.

4. Все штаммы исследуемых сапрофитов в той или иной степени стимулировали рост листерий по сравнению с контролем.

5.Наибольшее влияние на размножение листерий в жидкой среде оказали экзометаболиты штаммов № 20 № 22 №23.

6. В результате проведенных биохимических тестов была выявлена биологическая активность морских микроорганизмов.

7. Наибольшая степень протеолитической, гемолитической, лицитиназной и липолитической активности наблюдается в бухте Лазурная.

8. Высокая степень протеолитической и липолитической активности наблюдается в Спортивной Гавани. Так же в Спортивной Гавани были выделены штаммы, которые оказали наибольшую стимуляцию на рост патогенов.

9. Наименьшая степень биологической активности была выявлена в бухте Круглая.

Приложение

Рис. Биологическая активность в бухтах

Список литературы

Бузолева Л.С.// Микробиологическая оценка качества природных вод, летняя учебно-полевая практика: учебное пособие по летней полевой практике студентов. Владивосток 2001.

Гусев М.В., Минаева Л.А. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов.-2003.-С.466

Егоров Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология.- 1982.- Т.18, Вып.6.- С.835-849.

Егоров Н.С., Практикум по микробиологии: учеб. пособие // Изд. Мос. Университета. - 1976. - 307 с.

Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichiacoli М-17 // Журн. микробиол 2005а - № 1- С. 16-21.

Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров J1.H. Экзометаболиты пробиотиков как фактор восстановления микробиоценоза человека // Цитокины. Воспаление. Иммунитет: Материалы междунар. на-учно-практич. школы-конф СПб, 2002. - С.24.

Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Шалаева О.Н., Петров J1.H. Состав и биологическая активность экзометаболитовEscherichiacoli М-17 // Журн. микробиол 2003-№6-С.20-25.

Горкин А.П. География России: энциклопедический словарь. М.: Большая Российская энциклопедия, 1998. стр. 109-110

Израиль Ю.А.// Антропогенная экология океана. С. 45

Кузнецова Т.А., Михайлов В.В. // Морская микробиология и биотехнология. Вестник ДВО РАН. 1999 №4. С. 5-10.

Лаппо Г.М. Города России: энциклопедия. М.: Большая Российская энциклопедия, 1994. стр. 71-75

Стоник В.А. // Морские физиологически активные вещества. Вестник ДВО РАН. 1999. №4

Тирранен Л.С.// Роль летучих метаболитов в межмикробном взаимодействии. Новосибирск: Наука, 1989. 104 с.

Тирранен Л.С., Ковров Б.Г., Черепанов О.А. // Характер взаимодействия микроорганизмов через их газообразные метаболиты // Микробиология. 1980. Т. 49. № 5. C. 788-793.

Федосов Ю.В., Михайлов В.В., Плисова Е.Ю. и др. II Биосинтез ферментов микроорганизмами// Ред. ХалмурадовА.Г., Безбородое A.M. Ташкент: Фан, 1988. С. 155 -156.

Youchimizu M., Kimura T. Study on intestinal microflora of Salmonids // Fish. Pathol.– 1976.– Vol.10.– N.2.– P. 243–259.

Elyakov G.B., Kuznetsova T.A., Mikhailov V.V., Maltsev I.I., Voinov V.G., Fedoreyev S.A. Brominated diphenyl ethers from a marine bacterium associated with the sponge Dysidea sp. // Experientia, 1991, v. 47, p. 632-633.

Интеренет - источники:

1)http://wikimapia.org

2) http://www.sea-biology.ru

30

Код для цитирования: Скопировать