VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Современные достижения науки и техники стали обыденным делом, и сегодня без внедрения новых технологий немыслима ни одна отрасль медицины. За последние десятилетия здравоохранение претерпело значительные изменения, которые в том числе затронули и микробиологическую диагностику.

Появление новых прописей питательных сред, открытие ранее неизвестных микроорганизмов, современные модификации методов диагностики и идентификации, наряду с революционными разработками в сфере биоинженерии, позволили микробиологии стать фундаментальной отраслью медицины.

Актуальными вопросами уже стали не выявление возбудителей и определение их чувствительности к лекарственным препаратам, а максимальное снижение времени, затрачиваемое на выполнение этих методик, что ведет к минимальным срокам задержки назначения специфической терапии.

Обычно этот вопрос решался небольшими изменениями рецептур питательных сред и методов ускоренной диагностики. Но это позволяло лишь незначительно сократить сроки культивирования, что не имело большой клинической ценности, заметно усложняло работу сотрудников лаборатории, а, подчас, было недоступным для некоторых лечебных учреждений.

Современные разработки лабораторной экспресс-диагностики туберкулеза шли тремя основными путями:

• подбор оптимальных стимуляторов роста и ингибиторов побочных реакций;

• минимализация субъективной оценки результатов за счет внедрения в практику компьютерных и автоматизированных систем;

• внедрение радикально новых методов исследований и пересмотр отдельных рутинных манипуляций.

В качестве методов, альтернативных классическому культуральному исследованию, стало возможным использование автоматизированных и полуавтоматизированных систем культуральной диагностики, основанной на использовании жидких питательных сред и различных способах индикации роста микобактерий. К ним относятся фенотипические методики, которые основаны на культуральном методе и для интерпретации результатов требуют визуального обнаружения колоний M. tuberculosis. Ввиду низкой скорости роста M. tuberculosis, на выполнение этих методов уходит от нескольких недель до 1,5-2 месяцев.

Сейчас в лабораторную диагностику туберкулеза активно внедряются новые, высоко-технологичные фенотипические методы, которые позволяют получить «экспресс-результаты» путем использования различных технологий для выявления ранних признаков роста микобактерий, основанных на измерении метаболизма с помощью цветных индикаторов, определении потребления кислорода или ранней визуализации микроколоний.

Одна из недавно разработанных коммерческих систем «экспресс-выявления» роста микобактерий - это пробирка-индикатор роста микобактерий MGIT (Mycobacteria Growth Identification Tube), которая была испытана в нескольких сравнительных исследованиях с целью раннего выявления M. tuberculosis и других микобактерий. Впоследствии система была адаптирована для определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis.

Система MGIT состоит из стеклянных пробирок, содержащих модифицированную жидкую среду Миддлбрука с флюоресцентным датчиком кислорода, встроенным в дно каждой пробирки. При налиии биоматериале M. Tuberculosis, потребление растворенного кислорода вызывает флюоресценцию пробирок при освещении ультрафиолетовой лампой.

Для разжижения и деконтаминации мокроты используется патентованный состав с N-ацетил-L-цистеином и гидроксидом натрия, который полностью готов к использованию и стабилен при хранении.

Непосредственно в исследуемую пробирку добавляют специальные компоненты для подавления роста неспецифической микрофлоры и стимуляции роста микобактерий, в состав которых входят: олеиновая кислота; альбумин для защиты микобактерий от связывания со свободными жирными кислотами; декстроза – источник энергии; каталаза – для разрушения токсичных перекисей; полимиксин, амфотерицин, налидиксовая кислота, триметоприм, азлоцилин – для подавления роста неспецифичной флоры.

При исследовании лекарственной чувствительности в набор контрольных и содержащих препараты пробирок вносится исследуемый изолят. После периода инкубации при температуре 37^оС, сравнивается рост в пробирках с препаратом и контролеях, что позволяет установить чувствительность и устойчивость M.tuberculosis к лекарственным препаратам.

Согласно утверждениям компании, новая система позволяет значительно сократить время исследования (3-8 дней), облегчая обработку и считывание результатов при большом числе образцов, сводит к минимуму контакт персонала с биоматериалом.

Метод ВACTEC был одобрен для качественного исследования четырех препаратов первого ряда: изониазида, рифампицина, этамбутола, и стрептомицина. Жидкая среда, используемая в этой методике – бульон 7Н12, содержит: основу 7Н9; гидролизат казеина; бычий сывороточный альбумин; каталазу; меченную ¹⁴С жирную кислоту.

Для дополнительного исследования с пиразинамидом требуется особая среда BACTEC. Потребление ¹⁴С-субстрата размножающимися бактериями приводит к выделению ¹⁴СО₂, количество которого регистрируется аппаратом как индекс роста (ИР) по шкале от 0 до 999. В присутствии антимикробного препарата чувствительность проявляется замедлением ежедневного прироста. Результаты учитывают, исходя из кривых ежедневного изменения индекса роста в сравнении с контролем. Считают, что культура содержит более 1% устойчивых бактерий (10% в исследовании с пиразинамидом), если рост в исследуемой среде быстрее, чем в контроле 1:100 (1:10 для пиразинамида).

Однако, практически все, предлагаемые в качестве «экспресс-диагностики», фенотипические методики имеют свои достоинства и недостатки в определении лекарственной устойчивости M. tuberculosis.

Исследователи сравнили надежность MGIT для исследования лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину с системой BACTEC, использовав 29 изолятов. По их данным время исследования составило 3-8 дней для MGIT и 4-10 дней для BACTEC. Отмечалось полное совпадение по изониазиду и совпадение по 28 из 29 изолятов по рифампицину. В других исследованиях система MGIT хорошо выдержала сравнение с методом пропорций на среде Левенштейна-Йенсена, агарной среде и с системой BACTEC, особенно для рифампицина и изониазида. Однако для этамбутола и стрептомицина необходима дополнительная стандартизация.

Однако, в отношении системы BACTEC, в практическом здравоохранении некоторые лаборатории, использующие этот метод высказывают определенный негатив. Производитель внес изменения в критические концентрации для некоторых препаратов, желая повысить диагностическую разрешающую способность исследования. В ряде публикаций сообщалось, что новые концентрации очевидно занижены. Вследствие этого лаборатории вынуждены применять для использования иные концентрации препаратов, опираясь на свой многолетний опыт работы. Кроме этого, метод не позволяет определить истинную долю устойчивых бактерий в культуре и недостаточно надежно обнаруживает устойчивость в культурах, содержащих менее 10% лекарственно-устойчивых микобактерий в культуре.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Спб., 2002. 592с.

2.Покровский В.И., Поздеев О.К. Медицинская микробиология. Москва,1998. 1200с.

3.И.Бастиан, Ф. Порталс «Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью», гл.8 Л. Хейфец «Традиционные методы исследования лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis», гл.9 Дж. Паломино «Новые экспресс-методы определение чувстивтельности Mycobacterium tuberculosis».

4.Инструкция по унифицированным методам микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждениях. Приложение №10, 11 к приказу Минздрава России от 21.03.2003.

5. Карманный справочник по туберкулезу для работников первичной медико-санитарной помощи для стран Европейского региона ВОЗ. Всемирная организация здравоохранения,2003.

Код для цитирования: Скопировать