VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Исследования популяций медоносной пчелы в Башкортостане начались с экспедиции Г.А. Кожевникова в 1928 году. На обсуждение был поднят вопрос о сохранении бурзянской популяции бортевых пчел, который и поныне остается актуальным [2]. Одним из условий сохранения аборигенных популяций пчел является установление породной принадлежности пчел. Так как применение морфометрических методов[1] было осложнено гибридизацией, им на смену пришли генетические методы [5]. Удобным здесь оказалось использование митохондриального генома, структура и особенности наследования которого позволяют анализировать эволюционные связи и определять породную принадлежность пчел. При определении породы пчел исследуют область между генами цитохромоксидазы I и цитохромоксидазы II мтДНК. Участок, расположенный между этими генами, образован последовательностью гена тРНКLeu и сложными повторяющимися последовательностями. Элемент Р этих повторов (54 п.н.) состоит из АТ-пар, а в элементе Q их содержание составляет 93%[7]. Именно на специфичном строении этих повторов основана идентификация подвидов. У Apis mellifera mellifera L. межгенный локус представлен фрагментом PQQ, длиной около 600 пар нуклеотидов и включает 3’- область гена цитохромоксидазы I, ген тРНКLeu , Р-элемент, 2 Q-элемента и 5’-конец гена цитохромоксидазы II. У южных пород пчел фрагмент Q представлен только одной копией, а длина локуса мтДНК составляет около 350 п.н.. В лаборатории биохимии адаптивности насекомых Института биохимии и генетики УНЦ РАН, где и была выполнена данная работа, была разработана методика ПЦР-идентификации пчел на основе полиморфизма локуса COI-COII митохондриальной ДНК, комбинация PQQ которого характеризует происхождение пчел от Apis mellifera mellifera L. по материнской линии[4,5]. С помощью этого метода была доказана уникальность бурзянской популяции[2,5] и были обнаружены четыре сохранившиеся популяции A.m.mellifera на Урале: вишерская, южно-прикамская, татышлинская и бурзянская [3].

Целью настоящей работы являлось установление породной принадлежности пчелиных семей популяции Зилаирского района основе полиморфизма локуса COI-COII митохондриальной ДНК.

Пробы по 3-5 пчел из 116 семей были собраны в период с 21 по 22 мая 2013 года в Зилаирском районе. ДНК выделяли из мышц торакса и кишечника пчел, фиксированных в 96%-ном этаноле [8]. Выделение ДНК проводили смесью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ. Популяции пчел изучали на основе анализа полиморфизма межгенного локуса COI-COII мтДНК. ПЦР проводили в термоциклере “Циклотерм” в объеме 15 мкл при следующем режиме:

1 – 1 цикл 5 мин при 94°С , 1 мин при 80°С, 2 мин при 44°С;

2 – 25 циклов 1 мин при 64°С , 1 мин при 94°С , 30 сек при 45°С;

3 – 1 цикл 5 мин при 72°С;

4 – 1 цикл 10°С хранение,

с использованием следующих праймеров:

F-5’-tggcagaataagtgcattgaa-3’

R-5’-cagcataatatgaatttgattcttga-3’.

Амплификаты разделяли в 8%-м полиакриламидном геле с использованием TBE-буферного 1% раствора и окрашивали раствором бромистого этидия. Гели визуализировали в ультрафиолетовом трансиллюминаторе Vilber Lourmat.

В результате анализа локуса COI-COII мы получили следующее: 50% пчелосемей Зилаирского района по материнской линии происходят от пчел среднерусской породы. Притом в д. Бердяшево (25 семей) и в д. Дмитриевка (20 семей) Зилаирского района проанализированные семьи происходят от подвида Apis mellifera mellifera L. с частотой 0,96 и 0,9 соответственно и могут быть использованы для распространения популяции.

Рисунок 1 Электрофореграмма локуса COI-COII мтДНК

На рисунке 1 представлена электрофореграмма локуса COI-COII мтДНК изученных семей, где образцы в 9 и 10 лунках – элементы Q, соответствующие пчелам южных пород А.m.carpatica илиз A.m.caucasica (350 п.н).; образцы в 1-8 лунках – элементы PQQ, соответствующие среднерусской расе Apis m.mellifera L. (600 п.н.).

Рисунок 2 Географическое распределение вариантов локуса COI-COII митохондриальной ДНК проанализированных пчелосемей

На рисунке 2 изображено географическое распределение вариантов локуса COI-COII мтДНК. В центральной части Зилаирского района наблюдается вариант PQQ, в восточной части района популяция содержит как вариант PQQ, так и Q. Наблюдаемая граница варианта PQQ соответствует границе лесных массивов, из чего можно сделать вывод, что лес является естественным барьером для интенсивной гибридизации пчел и его сохранение важно для предотвращения дальнейшей гибридизации.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Алпатов, В. В. Породы медоносной пчелы[Электронный ресурс ]/ Алпатов В. В. – М.: Московское общество испытателей природы, 1948. – 143 с.

2. Ильясов, Р.А., Поскряков, А.В., Николенко, А.Г. Бурзянский экотип бортевой пчелы среднерусской расы Apis mellifera mellifera L.[ Электронный ресурс] / Материалы международной конференции, Биоразнообразие, проблемы горного Алтая и сопредельных регионов: настоящее, прошлое и будущее. – Горно-Алтайск, 2008 - с.94-95.

3. Ильясов, Р. А. Полиморфизм Apis mellifera mellifera L на Урале[Текст]/ автореферат дисс. канд.биол.наук: 03.00.15 / Р.А.Ильясов- Уфа,2006. – с. 22

4. Минченко, А.Г. Митохондриальный геном[Текст]/ А.Г. Минченко, Н.А. Дударева. – Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990. – 194 с.

5. Н и к о л е н к о, А.Г., П о с к р я к о в, А.В. Полиморфизм локуса COI-COII митохондриальной ДНК медоносной пчелы Apis mellifera L. на Южном Урале[Электронный ресурс]/ Генетика. – 2002. – с. 38(4).

6. Николенко, А.Г. Ареал бурзянской популяции темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L/А.Г. Николенко, С.А.Фахретдинова, Р.А.Ильясов, А.В. Поскряков/Труды русского энтомологического общества. – С.-Петербург, 2010. – Т.81(2).-с. 202-208

7. Crozier, R. H., Crozier, Y. C. The Mitochondrial Genome of the Honeybee Apis melliferа: Complete Sequence and Genome Organization /Department of Genetics and Human Variation - Australia,1993

8. Chomezynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thio-cyanate-phenol-chloroform extraction // Analytical Biochemistry. 1987. V.162. P.156-159

Код для цитирования: Скопировать