VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Механизм РНК-интерференции очень древний. Скорее всего, биологическая эволюция создала его более миллиарда лет назад. С его помощью они получили возможность защищаться от нападений вирусов. Позже эту способность у них переняли далекие потомки, грибки и растения, а потом и животные. Многоклеточные организмы также научились прицельно отключать с помощью РНК-интерференции свои собственные гены, прерывая процесс синтеза кодируемых ими белков.

Итак, длительное время никто не мог объяснить происходившие феномены, рассматривая их как артефакты. И лишь в последние 8-10 лет удалось установить, что во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества так называемых "малых" РНК. К еще большему удивлению привело исследование структуры таких молекул. Оказалось, что эти РНК являются копией отдельных участков тех самых генов (ДНК), которые вводились в клетку, и активность которых подавлялась. Долгое время генетикам были известны только три вида РНК: информационная, транспортная и рибосомная. Информационная РНК (иРНК) несет в себе всю информацию гена, кроме интронной, которая вырезается на промежуточном этапе, и передает ее на рибосомную (рибРНК), которая образует в клетке круглые тельца-рибосомы. Транспортная РНК (тРНК) доставляет к рибосоме составные части белков (аминокислоты), соответствующие тем требованиям, которые содержатся в иРНК. А на рибосоме строится полипептидная цепь, затем из полипептидных цепей (одной или нескольких) образуются молекулы белков.

Малые РНК, состоящие всего из нескольких десятков нуклеотидов, могли показаться просто мусором, остатками от своих "больших братьев". И даже несмотря на то, что роль отдельных малых молекул РНК в процессах превращения информационных РНК (сплайсинге), а также при упаковке нитей нуклеиновых кислот, была доказана ранее, истинным "хитом" в биологии малые РНК стали только лишь с открытием своей способности подавлять экспрессию генов у животных [1].

Ещё двадцать лет назад молекулярная биология не знала такого удивительного феномена, как РНК-интерференция. У простейших РНК-интерференция обеспечивает иммунитет, в частности — защиту от вирусов. У более развитых организмов этот механизм включается в борьбу не только (и не столько) с внешними, но и с внутригеномными паразитами, а также становится важнейшим регулятором активности генов. На сегодняшний день идентифицированы уже тысячи коротких регуляторных РНК, а механизм РНК-интерференции изучен очень подробно, однако бесспорно и то, что мы наблюдаем пока только верхушку этого айсберга. Открытие РНК-интерференции, несомненно, одно из главных событий молекулярной биологии и генетики на рубеже веков, а наиболее важное следствие этого открытия - обнаружение новых фундаментальных механизмов, с помощью которых молекулы РНК могут влиять на экспрессию генов. Кроме того, в настоящее время этот подход уже широко применяется как лабораторный метод для выявления функций генов, в том числе и при изучении генома человека. Уже в ближайшем будущем могут появиться основанные на принципе РНК-интерференции лекарства нового поколения, действующие специфично на определенный ген и выключающие синтез кодируемого им белка. Такими мишенями РНК-интерференции могут быть, например, гены, активные в клетках опухолей, или гены, обеспечивающие размножение вирусов.Впервые об открытии было объявлено в феврале 1998 г., когда Файер и Меллоу опубликовали в журнале «Nature» статью, в которой на одной из самых популярных генетических моделей круглом черве (нематоде) Caenorhabditis elegans объяснили ряд полученных ранее экспериментальных результатов, казавшихся весьма странными. Так, для селекции сорта цветков петуний, который обладал бы более яркими бордовыми лепестками, генетики вводили в ее клетки ген, отвечающий за синтез красного пигмента. К удивлению ученых, многие цветы, вместо того, чтобы усилить окраску, вовсе теряли пигмент и получались белыми. Как позже выяснилось из работ Файера и Меллоу, в основе этого парадокса лежит РНКинтерференция. Во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества так называемых малых РНК копий отдельных участков ДНК, вводимых в клетку, активность которых подавлялась. В класс малых РНК включают молекулы, содержащие от 20 до 300 нуклеотидов. За эффект РНК интерференции отвечают самые короткие из них, состоящие всего из 2128 нуклеотидов. Особенностью этих молекул является то, что они, в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являются двуцепочечными (дцРНК). Нуклеотиды с противоположных цепочек дцРНК спариваются друг с другом аналогично двуцепочечным ДНК в хромосомах. При попадании в клетку дцРНК непонятного происхождения начинается уничтожение последней. Специальные белки разрезают ее на мелкие кусочки, которые с помощью комплекса ферментов атакуют и разрушают информационную РНК, произведенную клеткой. Сигнал от гена гасится, белок не производится, ген замолкает. В этом и состоит РНК интерференция. На языке генетиков ею называется специфическая деградация одноцепочечной молекулы информационной РНК в присутствии двуцепочечной РНК с такой же. Объявлены имена лауреатов самой престижной премии в мире. Как уже сообщала «МГ», Нобелевская премия по физиологии и медицине 2006 г. присуждена двум американским ученым  47летнему Эндрю Файеру (Массачусетский технологический институт) и 46летнему Крейгу Меллоу (Медицинский колледж Массачусетского университета) за открытие явления РНКинтерференции, которое положило начало новой эре биомедицинских исследований последовательностью. Открытое нобелевскими лауреатами явление широко распространено среди большинства организмов. Одно из возможных объяснений роли РНК интерференции защита организмов от РНК содержащих вирусов и мобильных элементов, перемещающихся посредством РНК. Таким образом, дцРНК может быть важным звеном иммунной системы, распознающим и ликвидирующим чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, дцРНК будет мешать ему производить вирусные белки. Этот защитный механизм, предохраняющий клетку от вирусов и мобильных генетических элементов, можно использовать в терапевтических целях [2]

Ключевые этапы РНК интерференций. В нормально работающей клетке каждый ген выполняет собственную, строго определенную функцию, например, отвечает за выработку белка, мРНК, или за взаимодействие с другими регуляторными белками. При этом говорят о нормальной экспрессии (от лат. expressus - выразительный, явный) гена в клетке. Если же количество продукта данного гена (например, белка) снижается, то говорят о снижении экспрессии данного гена. Эффект "гашения" экспрессии определенных генов малыми РНК и получил название РНК-интерференции, а молекулы, вызывающие его, назвали siRNA (small interfering RiboNucleic Acids - малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты) [3]

Bernstein с соавторами изучили потенциальную возможность участия нескольких белков дрозофилы, содержащих домены РНКазыIII и dsRBD, в процессинге двухцепочечной РНК на siRNA ( Bernstein et al. 2001 ). Оказалось, что очищенный после экспрессии в E.coli белок, содержащий кроме доменов РНКазыIII и dsRBD еще и РНК-хеликазный- и PAZ-домены, способен к расщеплению двухцепочечной РНК на короткие 21-22 нуклеотидные РНК, в то время как другие белки не обладают такой активностью. Соответствующий ген был назван Dicer (от английского резать на мелкие кусочки). Введение в бесклеточную систему антител, полученных против DICER , ингибирует активность, необходимую для процессинга двухцепочечной РНК. Сейчас известно, что белок Dicer одним из своих доменов может “заякорить” конец молекулы дцРНК, при этом другой домен, находящийся на расстоянии в 20-25 пар нуклеотидов, производит разрывы в обеих цепях дцРНК. Таким образом, Dicer действует как “молекулярная линейка”, безошибочно отмеряющая и штампующая короткие дцРНК с заданным размером и определенными структурными особенностями. Затем Dicer передает короткие РНК другим комплексам, содержащим белки семейства Argonaute *. На следующем этапе происходит расплетание дуплекса коротких РНК, одна из цепей которого обнаруживает в клетке комплементарные ей молекулы РНК (мишени), в результате чего белок Argonaute катализирует подавление их экспрессии. На данный момент известно несколько молекулярных механизмов, с помощью которых может подавляться экспрессия мишеней при РНК-интерференции: белок Argonaute обладает способностью разрезать РНК-мишень, а также блокировать трансляцию матричной РНК. Кроме того, в некоторых случаях комплексы коротких РНК с белками Argonaute могут подавлять непосредственно транскрипцию (синтез РНК) гена-мишени в клеточном ядре.

Белки Argonaute также участвуют в образовании и регуляции активности микроРНК. Ago2 разрезает пре-микроРНК и образует дополнительный предшественник (ac-pre-miRNA);^[4] 2) Ago2 также входит в RISC и опосредует связывание микроРНК с 3'НТР, соответствующей мРНК и ингибирует трансляцию (в некоторых случаях - вызывает деаденилирование и деградацию мРНК). Ago2 взаимодействует с TRBP и Dicer (который процессирует пре-миРНК в миРНК) и образует вместе с ними тройной комплекс, который также связывает миРНК, на базе которого происходит дальнейшая сборка RISC путём присоединения других белков [4]

Семейство белков Argonaute представлено среди эукариот, некоторых архей и даже бактерий, например, Aquifex aeolicus. На основании сравнения геномов, семейство Argonaute, по-видимому, произошло от ферментов инициации трансляции.

Итак, суть РНК-интерференции заключается в ингибировании одноцепочечных молекул РНК, несущих информацию о структуре гена, после присоединения к ним siRNA - малых двухцепочечных РНК, циркулирующих в цитоплазме клетки.

1. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

2. Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K. D., Carrington, J. C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313, 68-71.

3. Ding, S. W., and Voinnet, O. (2007) Antiviral immunity directed by small RNAs. Cell 130, 413-426.

4. Moissiard, G., Parizotto, E. A., Himber, C., and Voinnet, O. (2007) Transitivity in Arabidopsis can be primed, requires the redundant action of the antiviral Dicer-like 4 and Dicer-like 2, and is compromised by viral-encoded suppressor proteins. RNA 13, 1268-1278.

Код для цитирования: Скопировать