VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Bordetellabronchiseptica(B.bronchiseptica) – возбудитель бордетеллёза собак, лошадей, свиней, коз, кроликов, кошек, хорьков, хомяков, крыс, морских свинок, обезьян, лис, птиц и мн. др. [1, 2, 3, 5, 6]. Важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение бордетеллёза обусловлено возможностью межвидовой передачи возбудителя, перемещениями очага из природных в антропоургические зоны [3, 8, 9].

Согласно МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий» (2008) для учета штаммов B.bronchiseptica используют бактериологический метод с серологическим подтверждением в реакции агглютинации [4].

Многие исследователи отмечают, что эффективность бактериологического метода редко превышает 40%, длительность анализа занимает до 8 суток. Это связано со слабой устойчивостью бордетелл во внешней среде, медленным ростом возбудителя, несовершенной рецептурой питательных сред, несвоевременным и неполным обследованием животных с затяжным кашлем, а также нарушением правил забора и транспортировки материала [3].

Целью нашего исследования явилась отработка методики забора материала от животных подозреваемых в заражении бордетеллезом.

Работа выполнялась на базе научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии (НИИЦМиБ) ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».

Для проведения эксперимента были взяты молодые собаки (n=4), кошки (n=4), крысы (n=4) и кролики (n=7). У всех исследуемых животных наблюдали длительный кашель или другие признаки поражений респираторного тракта: ринит, конъюнктивит, бронхит, чихание, сопящее дыхание, изменение «голоса».

В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и типирования бактерий, соответствующие им среды, оборудование и реагенты, а также методики, разработанные сотрудниками НИИЦМиБ [1-6, 10-14].

Нами были апробированы различные способы индикации бактерий B.bronchiseptica. Варьировали места забора материала от животных (глубокие мазки или смывы из носа или глотки), питательные среды для первичного посева (физиологический раствор, мясопептонный бульон, мясопептонный агар, бордетелагар, селективно-диагностическая среда BBR-57 УГСХА), а также наборы идентификационных тестов.

Учитывая, что отдельные фенотипические признаки имеют сходные черты у большого количества бактерий, при разработке схемы идентификации возбудителя мы отбирали биологические особенности B.bronchiseptica, позволяющие в максимальной степени добиться угнетения роста сопутствующей микрофлоры респираторного и пищеварительного трактов животных и повысить продуктивность биомассы искомого патогена. Методология базировалась на использовании совокупности уникальных биологических свойств, комбинация которых и послужила инструментом идентификации.

В результате проведенной серии экспериментов, на основании изучения комплекса морфологических, культуральных и биохимических свойств бактерий B.bronchiseptica и подбора минимального набора идентификационных тестов, позволяющего провести максимально точную дифференциацию среди близкородственных бордетелл и возможных носоглоточных ассоциантов, мы выявили наиболее эффективную схему детекции бактерий B.bronchiseptica от животных, представленную на рис. 1.

Рис. 1. Бактериологическая схема диагностики бордетеллёза

Идентификационная схема включает следующие этапы исследования.

1-е сутки исследования: взятие тампоном глубоких мазков из глотки животных на селективно-диагностическую среду BBR-57 УГСХА с культивированием в течение 24-48 ч в термостате при t 35-37°С. Мазок берут тампоном с задней стенки глотки и вынимают не касаясь щек и языка. Материал втирают Z-образным штрихом по центру чашки Петри и мелкими штрихами по периферии.

2-3-е сутки исследования (48-72 ч): отбор и изучение не менее 3-х характерных колоний бирюзового цвета, возможно с темно-синим центром, размером от 1 до 4 мм. Колонии других микроорганизмов могут изменять цвет среды с зеленого на жёлтоватый. Колонии B.bronchiseptica могут быть полиморфны. Подозрительными являются россинчатые, выпуклые, влажные, гладкие, блестящие с ровными краями, маслянистой консистенции, легко снимающиеся с поверхности среды колонии диаметром от 1 до 2 мм (фаза I) и более крупные (до 3-4 мм), плоские с приподнятым центром и шероховатыми краями колонии (фаза III) или переходные формы (фаза II) (рис. 2). При наличии значительного количества однотипных подозрительных колоний рекомендуем проведение микроскопии окрашенных по Граму мазков. Бактерии B.bronchiseptica - мелкие коккобацилы, равномерно располагающиеся в мазке одиночно, по парам или короткими цепочками, грамотрицательны.

По этим данным возможна постановка предварительного диагноза. Проводят отсев подозрительных колоний на скошенный МПА или другие агаровые среды (КУА, бордетелагар) для выделения чистой культуры и наращивания бактериальной массы в течение 24 ч (рис. 3).

При отсутствии роста подозрительных колоний на среде BBR-57 УГСХА чашки Петри вновь помещают в термостат на 24-48 ч и просматривают повторно.

3-4-е сутки исследования (72-96 ч):просматривают посевы для выделения чистой культуры, проводят микроскопию и биохимические тесты. Учитывают хороший рост B.bronchiseptica на простых питательных средах в течение 24-48 ч при 35-37°С, аэробность, способностью утилизировать цитраты и нитраты, отсутствие ферментации сахаров, многоатомных спиртов, пигментообразования и желатиназы, наличие уреазной, оксидазной и каталазной активности. На основании этих данных может быть выдан окончательный положительный ответ. Если в течение 4-х суток на среде выращивания не обнаружены подозрительные колонии дают окончательный отрицательный ответ.

Таким образом, постановка окончательного диагноза на бордетеллёз с использованием бактериологического исследования занимает 3-4 дня. Постановка диагноза возможна на 2-3-е сутки с условием дополнения схемы компонентами фагоидентификации и иммунологических тестов.

Используя данную схему было выделено 7 клинических изолятов от разных видов животных.

Апробация схемы на клиническом материале образцов показала, что результаты бактериологического исследования во многом зависят от тяжести симптомокомплекса (эффективнее ранняя диагностика до появления приступов спазматического кашля), от предшествующей антибактериальной терапии (исследование возможно до и через 2 недели после окончания курса лечения), соблюдения правил техники взятия биоматериала (мазки лучше отбирать из зева - задней стенки глотки, а не из носоглотки), его первичного посева (обязательно на селективную среду для ингибирования сопутствующей микрофлоры), транспортировки (желательно в течение 3 ч),.

Библиографический список:

1.  
   1.  
      1.  

         1. Васильев Д.А. Выделение и идентификация Bordetella bronchiseptica от животных / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Васильева // Естественные и технические науки. – 2010. - № 5. – С. 233-235.

         2. Васильева Ю.Б. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики бордетеллёза // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4; URL: http://www.science-education.ru/110-9751.

         3. Васильева Ю.Б. Разработка методов детекции бактерий Bordetella bronchiseptica // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 3 (23). - С. 46-51.

         4. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 2004. – 394с.

         5. Методические указания «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий». – М. – 2008.

         6. Никульшина Ю.Б. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, выделенных от домашних животных / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина // Ветеринарная патология. - 2007. - №4. (23). –– С. 103-106.

         7. Никульшина Ю.Б. Выделение бактерий рода Bordetella bronchiseptica от домашних животных. // Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина, Д.Н. Хлынов / Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК». Москва. МГАУ. – 2007. – Ч.1. С. 281-284.

         8. Семанин А.Г., Скорик А.С., Суркова Е.И., Васильева Ю.Б., Марьина О.Н. АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕНИЯ БОРДЕТЕЛЛЕЗА ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ // Материалы V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: www.scienceforum.ru/2014/645/2957

         9. Суркова Е.И., Скорик А.С., Семанин А.Г., Васильева Ю.Б., Мастиленко А.В. УСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ BORDETELLA BRONCHISEPTICA К НЕКОТОРЫМ ХИМИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ // Материалы V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: www.scienceforum.ru/2014/645/2954

         10. Голоушкина А.С., Зимукова С.Э., Феоктистова Н.А., Лыдина М.А., Васильев Д.А. РАЗРАБОТКА ФАГОВОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ПРОТЕЙНОЙ ИНФЕКЦИИ // Материалы V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: www.scienceforum.ru/2014/645/2960

         11. Пирюшова А.Н., Журавкова Ю.А., Феоктистова Н.А., Васильев Д.А. ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS // Материалы V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: www.scienceforum.ru/2014/645/2964

         12. Галушко И.С., Еремина Т.А., Барт Н.Г. ВЫДЕЛЕНИЕ ФАГОВ БАКТЕРИЙ РОДА PROVIDENCIA ИЗ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ И ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА // Материалы V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: www.scienceforum.ru/2014/666/2961

         13. Воротников А.П., Молофеева Н.И. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ESCHERICHIA COLI О157 // Материалы V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: www.scienceforum.ru/2014/666/2967

         14. Кудряшова К.В., Феоктистова Н.А., Васильев Д.А. МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАЦИЛЛ // Материалы V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: www.scienceforum.ru/2014/666/2963