VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Работа была выполнена в лаборатории генетики и радиологии Азовского Научно-Исследовательского Института Рыбного Хозяйства (ФГУП «АзНИИРХ») под руководством выпускницы Южного Федерального Университета, Коваленко Дианы Васильевны. Нами разрабатывалась методика полимеразной цепной реакции (ПЦР) на примере особей судака азовской популяции. Коваленко Д. В. Освоила методику выделения ДНК и постановки ПЦР у осетровых рыб. Передо мной была поставлена задача освоить аналогичные методики на примере судака, являющегося ценным промысловым видом.

В коллекции присутствовали 59 образцов судака азовской популяции, отобранных в апреле. 2 образцов отобрано с КНП "Оселедняя", 7 особей женского и 5 особей мужского пола. Для 26 особей местом сбора является Приморско-Ахтарск ВНВХ, 16 особей женского и 10 мужского пола. 19 особей – Темрюк, среди них 9 особей женского и 9 мужского пола. Оставшиеся две особи отобраны в водоеме - охладителе Волгодонской АЭС, из них 1 особь женского, 1 мужского пола. В общем, из определенных особей 55,3% женского пола и 44,7% мужского пола.

В доступной нам литературе найти необходимые материалы по генетике судака нам не представилось возможным.

Пробы плавников исследовались у 59 особей. По каждой пробе была поставлена ПЦР.

Этапы работы:

1. Сбор и анализ литературы по выбранной теме;

2. Сбор и первичная фиксация образцов тканей, содержащих ДНК, пригодную для геномного анализа;

3. Выделение ДНК;

4. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР);

5. Визуализация результатов;

В работе использовались следующие приборы:

1. Микроцентрифуга/встряхиватель (Biokom, РФ)

2. Термостат Термо24-16 (Термо 48) (Biokom, РФ)

3. Центрифуга «Biofuge pico» на 13000 обмин (Heraeus, Germany)

4. Камера для вертикального электрофореза VE-3М («Хеликон», РФ).

5. Источник питания для электрофореза Эльф-8 (НПФ ДНК-Технология, РФ).

6. Амплификатор ДНК многоканальный ТП4-ПЦР-01 «ТЕРЦИК» (АО «ДНК-Технология», РФ).

7. Трансиллюминатор UVT-1 (Biokom, РФ).

8. Спектрофотометр СФ-46 («ЛОМО», РФ).

9. Дозаторы, рассчитанные на объемы: 1-20 мкл; 20-200 мкл; 200-1000 мкл.

10. Пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл (Biokom, РФ).

Отбор и консервация проб.

1. Отрезать небольшой кусочек (около 1,5 см³) выделенного внутреннего органа или части плавника. С плавника удалить слизь с помощью тампона, пропитанного 70%-ым этанолом. Кровь или сперму, отобрать в количестве 1,5 мл. Кровь отбирают одноразовым шприцем или стерильной пипеткой Пастера; сперму – пипеткой.

2. Поместить образец в специальную коллекционную пробирку объемом 5 мл, либо контейнер другого типа. При использовании для коллекционирования контейнеров объемом более 5 мл можно эквивалентно увеличить количество отбираемого образца. Отношение объемов – образец/ этанол - не должно превышать 1/3.

3. Залить коллекционную пробирку до верху этанолом 96%.

4. Подписать пробирку, надпись заклеить скотчем.

5. Во избежание ошибок при маркировке, параллельно с распределением образцов по пробиркам, следует составить список отобранных образцов с краткой характеристикой.

6. В характеристике необходимо отразить следующее стандартные ихтиологические характеристики рыбы: место и время отлова, вид отобранной ткани, морфометрические признаки рыбы. Учет образцов следует вести так, чтобы после анализа спилов полученную информацию можно было дополнить уточненными возрастными данными.

ab – длина всей рыбы; ас – Длина по Смитту; ad – длина без С; od – длина туловища; an – длина рыла; np – диаметр глаза (горизонтальный); po – заглазничный отдел головы; ao – длина головы; lm – высота головы у затылка; gh – наибольшая высота тела; ik – наименьшая высота тела; aq – антедорсальное расстояние; rd – постдорсальное расстояние; fd – длина хвостового слебля; qs – длина основания ID; q_1s1 – длина основания IID; tu – наибольшая высота ID; t₁u₁ – наибольшая высота IID; yy₁ – длина основания А; ej – наибольшая высота А; vx – длина Р; vx₁ – ширина основания Р; zz₁ – длина V; zy – расстояние между V и А; Ay – расстояние между анусом и А.

1. Через промежуток времени, не превышающий трое суток, этанол сливают, образец заливают тремя объемами 0,5 М суспензии ЭДТА в этаноле. Суспензию перед заливкой интенсивно перемешивают.

2. Пробе присваивают сквозной каталожный номер, которым маркируют саму пробирку. Кроме того, в пробирку помещают бумажную этикетку с каталожным номером образца.

3. Законсервированные образцы хранят при температуре –60⁰С и ниже.

4. Пробу и информацию о ней вносят в единый каталог генетической коллекции.

Выделение ДНК из образцов тканей

Чтобы проводить молекулярный анализ нуклеиновых кислот, необходимо прежде всего получить их в чистом виде.

Перед выделением ДНК образец ткани извлекают из коллекционной пробирки и ножницами или скальпелем отделяют фрагмент необходимого размера. Фрагмент ополаскивают дистиллированной водой, а затем переносят в отдельную чистую пробирку. С целью увеличения площади поверхности и, следовательно, ускорения процесса разрушения клеточных мембран, подготовительный образец подвергают гомогенизации.

Для выделения геномной ДНК разрушают плазматическую и ядерную мембраны и освобождаются от клеточных белков. Для разрушения мембран и денатурации белков применяют обработку образцов протеиназами (протеиназой К) в присутствии ЭДТА и детергентов (SDS).

Образцы (150 – 200 мг ткани) вносят в 1,5 мл пробирку типа «Эпендорф», содержащую 500 мкл лизирующего буфера следующего состава: 50мМ Трис-HCl (pH=8,0), 100 мМ EDTA, 100 мМ NaCl в 2% растворе SDS, после чего в пробирки добавляют 100 мкл раствора, содержащего 50 мкг протеиназы К, и инкубируют 3 – 6 часов при температуре 56⁰С.

SDS, sodium dodecyl sulfate, додецилсулфат натрия [C₁₂H₂₅SO₄Na] – поверхностно-активное вещество, солюбилилизирует белки и создает на них сильный отрицательный заряд, вследствие чего происходит денатурация белков и их отделение от нуклеиновых кислот. Вызывает разрушение структуры мембран, вследствие разрушения ее белковых составляющих.

EDTA, этилендиаминтетрауксусная кислота, N,N'-1,2-этандиилбис(N-карбоксиметил)-глицин [C₁₀H_16N2O₈ / ((HOOCCH2)₂NCH₂₎₂] – хелатирующий агент, связывающий ионы металлов переменной валентности, используется в качестве основы буферных растворов по определенным ионам металлов, а так же для устранения ингибирования катализируемых ферментами реакций следовыми количествами тяжелых металлов. Является антиоксидантом, вследствие связывания в частности ионов Fe²⁺ и Cu²⁺ и прерывания инициации свободно-радикальных реакций.

Протеиназа К, proteinase K – сериновая протеаза широкого спектра. Применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК или РНК. Протеиназа К устойчива ко многим денатурирующим агентам, таким как SDS и мочевина, хелатирующим агентам (EDTA) и сульфгидрильным реагентам, а также к ингибиторам трипсина и химотрипсина. Протеиназа К работает в широком диапазоне pH (4-12), её оптимум - pH 7,5-12. Всё это делает её чрезвычайно удобной в применении. Более этого, денатурирующие агенты повышают доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, даже ускоряют их гидролиз.

Очистка нуклеиновых кислот

Важнейшая процедура – очистка нуклеиновых кислот. Ключевой этап – удаление белков – проводится с помощью экстракции водных растворов нуклеиновых кислот фенолом и (или) хлороформом. Такая экстракция необходима, так как с помощью нее инактивируются и удаляются ферменты.

Для удаления белков из растворов нуклеиновых кислот их подвергают экстракции фенолом, затем смесью фенола и хлороформа (1:1) и наконец хлороформом.

Фенол, оксибензол [C₆H₅OH] – активно денатурирует белки, но не полностью ингибирует РНК-азную активность, в нем растворяются молекулы РНК, содержащие длинные последовательности поли(А).

Фенол – хлороформ – при использовании двух органических растворителей, депротеинизация протекает более эффективно.

Хлороформ, трихлорметан [CHCl₃] – удаляет из препарата остатки фенола.

Содержимое пробирок разделяют на две равные доли и в каждую добавляют по 500 мкл перегнанного фенола. Содержимое пробирок перемешивают вращательными движениями до гомогенного состояния, а затем центрифугируют при 8 тыс об./мин в течение 15 минут.

При центрифугировании происходит расслоение гомогената на три фазы: нижнюю фазу, состоящую из органических растворителей, интерфазу с белками и жирами, и водную фазу, содержащую ДНК.

Верхний слой центрифугата, без интерфазы, переносят в чистую пробирку и добавляют 500 мкл смеси перегнанных фенола и хлороформа. Содержимое пробирок перемешивают, а затем снова центрифугируют при 8 тыс.об./мин 15 минут.

Концентрирование ДНК

Для концентрирования ДНК применяется метод ее осаждения этанолом. Водную фазу (без интерфазы) переносят в чистую пробирку, добавляют 800 мкл абсолютированного этанола (допускается использование 96% этанола[C₂H₅OH] – спирт этиловый ректификованный высшей очистки) и перемешивают.

Разные функциональные группы ДНК связаны с водой в зависимости от относительной влажности. При относительной влажности 85% первичные и вторичные оболочки заполнены, что соответствует В-форме ДНК. При применении водоотнимающих средств – этанола, происходит дестабилизация молекул ДНК и выпадение ее в осадок. Выпавший осадок ДНК отделяют центрифугированием при 2 тыс.об./мин в течение 5 минут.

Для удаления примесей, захватываемых осадком, осадок промывают 70% раствором этанола, охлажденного до -20⁰С. После очередного центрифугирования (при 2 тыс.об./мин в течение 3 минут) надосадочный спиртовой раствор удаляют, а осадок подсушивают.

В конечном итоге получаются фрагменты ДНК размером 100 – 200 т.н. Конечный размер получающихся фрагментов ДНК зависит от двух основных факторов: действия клеточных нуклеаз и механического разрушения ДНК в процессе выделения. Эндогенные нуклеазы необходимо инактивировать сразу после лизиса клеток. Для этого лизат смешивают с ингибиторами нуклеаз. При этом следует иметь в виду, что если смешивание будет очень энергичным, может произойти гидродинамическая фрагментация молекул ДНК. Таким образом, образцы следует перемешивать тщательно, но осторожно. Механическое разрушение ДНК может происходить и во время экстракции органическими растворителями.

После высушивания проб ДНК, ее вновь растворяют в 50 – 100 мкл 10мМ ТЕ–буфера – буфер с низкой ионной силой.

Предварительная оценка качества ДНК проб

Качественную оценку выделенной ДНК проводят при помощи электрофореза в 1,0 % агарозном геле в присутствии бромида этидия в TBE-буфере (0,089 М трис-борат, 0,0025 М ЭДТА), в течение 16 часов при 20 В.

Для начала готовят 1 х ТВЕ в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля. К 1 х ТВЕ добавляют агарозу в количестве, необходимом для получения 0,35—0,45% раствора, и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. Затем охлаждают смесь до примерно 50 °С. За время охлаждения заклеивают края УФ - проницаемой кюветы для геля автоклавированной липкой лентой.

Теплую агарозу выливают в кювету для геля и равномерно распределяют ее по кювете.

Вертикально вставляют гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин, затем осторожно удаляют гребенку и липкую ленту.

Кювету с гелем помещают в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 х ТВЕ с бромистым этидием в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Подготавливают к электрофорезу образцы исследуемой и маркерной ДНК, для чего смешивают их с буфером для нанесения (5:1). Чтобы получить четкий сигнал при окрашивании бромистым этидием, в лунку шириной 5 мм достаточно внести 200 нг маркерной ДНК. Для построения стандартной кривой необходимо использовать маркерные фрагменты молекулярной массы: Low Range Mass Ruler (MBI Fermentas), маркирующий ДНК в пределах 80 – 1031 kb, и Lambda DNA/Eco R1 + Hind 3 Marker, маркирующий ДНК в пределах 564- 21226 kb.

Осторожно вносят в лунки исследуемую и маркерную ДНК. Для повышения точности определения размера маркерную ДНК наносят по обе стороны от исследуемой.

Элетрофорез осуществляют на приборе «Эльф-8» и электрофорезной камере «ЕС 13 X 12» фирмы Biocom. при 100В в течение 25 мин в 1x ТВЕ- буфере.

О наличии ДНК судят по свечению проб в агарозном геле, при его УФ-облучении на трансиллюминаторе. Визуально оценивают соотношение лёгких и тяжёлых фракций ДНК в пробе. Преобладание свечения дорожки ДНК в области от 1031 kb и выше свидетельствует о пригодности пробы для дальнейших молекулярных исследований ДНК

Для визуализации электрофореграмм необходимо использовать видеокамеру, подключенную к персональному компьютеру с лицензионным програмным обеспечением обработки изображений «Biotest» компании «Биоком». Контроль качества оценки выделения ДНК, а также её сохранности оценивают также методом спектрофотометрии на спектрофотометре СФ-46 при длинах волн 260 и 280 нм. В случае отношения экстинции 2,0>Е₂₆₀Е₂₈₀>1,5 пробы считаются очищенными от белковых фракций.

Спектрофотометрическая характеристика ДНК, выделенной из каталожных образцов тканей (плавника) судака

Каталожный номер пробы	Показатели экстинкции		Е260/Е280
	Е260	Е280
STU.1	0,062	0,034	1,8235294
STU.2	0,046	0,025	1,84
STU.3	0,077	0,041	1,8780488
STU.4	0,135	0,072	1,875
STU.5	0,116	0,06	1,9333333
STU.6	0,067	0,037	1,8108108
STU.7	0,058	0,032	1,8125
STU.8	0,039	0,021	1,8571429
STU.9	0,123	0,066	1,8636364
STU.10	0,076	0,039	1,9487179
STU.11	0,082	0,045	1,8222222
STU.12	0,032	0,017	1,8823529
STU.13	0,047	0,024	1,9583333
STU.14	0,068	0,036	1,8888889
STU.15	0,073	0,041	1,7804878
STU.16	0,124	0,065	1,9076923
STU.17	0,062	0,032	1,9375
STU.18	0,09	0,046	1,9565217
STU.19	0,039	0,021	1,8571429
STU.20	0,129	0,071	1,8169014
STU.21	0,114	0,062	1,8387097
STU.22	0,068	0,037	1,8378378
STU.23	0,057	0,031	1,8387097
STU.24	0,045	0,024	1,875
STU.25	0,104	0,054	1,9259259
STU.26	0,143	0,08	1,7875
STU.27	0,038	0,021	1,8095238
STU.28	0,071	0,037	1,9189189
STU.29	0,058	0,029	2
STU.30	0,087	0,047	1,8510638
STU.31	0,106	0,056	1,8928571
STU.32	0,164	0,084	1,952381
STU.33	0,067	0,034	1,9705882
STU.34	0,041	0,022	1,8636364
STU.35	0,092	0,05	1,84
STU.36	0,052	0,029	1,7931034
STU.37	0,042	0,022	1,9090909
STU.38	0,106	0,056	1,8928571
STU.39	0,068	0,037	1,8378378
STU.40	0,045	0,024	1,875
STU.41	0,097	0,051	1,9019608
STU.42	0,165	0,084	1,9642857
STU.43	0,129	0,066	1,9545455
STU.44	0,046	0,025	1,84
STU.45	0,067	0,037	1,8108108
STU.46	0,116	0,062	1,8709677
STU.47	0,036	0,019	1,8947368
STU.48	0,049	0,025	1,96
STU.49	0,041	0,021	1,952381
STU.50	0,062	0,033	1,8787879
STU.51	0,066	0,035	1,8857143
STU.52	0,11	0,061	1,8032787
STU.53	0,107	0,059	1,8135593
STU.54	0,039	0,02	1,95
STU.55	0,137	0,07	1,9571429
STU.56	0,048	0,024	2
STU.57	0,059	0,031	1,9032258
STU.58	0,08	0,044	1,8181818
STU.59	0,054	0,029	1,862069

Проведение ПЦР

Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp[6]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки.

Постановка амплификации

Небольшое (порядка 3,5 мкл) количество раствора ДНК переносят в пробирку для ПЦР, уже содержащую mix-раствор, приготовленный по заранее разработанным схемам:

	Единицы	нач конц	Кон конц	V1,мкл	Vt,мкл
10xбуфер	кратность	10	1	1,5	88,5
dNTPs	mM	2,5	0,25	1,5	88,5
MgCl2	mM	25	1,8	1,08	63,72
праймер	ое/мл	82	2	0,4	23,6
Hot Tag	U/mkl	5	0,05	0,2	11,8
DNA	ml		2	2
H2O	ml			12,8722	759,4598
Кол-во проб	1	59			1035,58
Объем 1р	20

	Единицы	нач конц	Кон конц	V1,мкл	Vt,мкл
10xбуфер	кратность	10	1	2	118
dNTPs	mM	2,5	0,25	2	118
MgCl2	mM	25	2	1,44	84,96
праймер	ое/мл	82	2	0,487805	28,7805
Hot Tag	U/mkl	5	0,05	0,2	11,8
DNA	ml		2	2
H2O	ml			12,7122	750,0198
Кол-во проб	1	59			1111,56
Объем 1р	20

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица (DNA), содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

• Термостабильная ДНК-полимераза (Hot Tag) — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

• Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTPs) – 10Х-смесь для ПЦР представляет собой смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) в эквимолярной концентрации (1,8 мМ). Такая концентрация компонентов в 10Х премиксе является оптимальной при проведении ПЦР.

Характеристика дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Дезокси-нуклеотид	Показатель
	Частота, %	λmax, нм	Коэффициент молярной экстинкции при рН=7,0	Е250/Е260	Е280/Е260
dATP	≥ 98%	259	15400	0,80±0,03	0,15±0,03
dCTP	≥ 98%	272	9100	0,82±0,03	0,97±0,03
dGTP	≥ 98%	252	13700	1,15±0,04	0,67±0,03
dTTP	≥ 98%	267	9600	0,64±0,03	0,70±0,03

• Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

• Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию [8].

• Праймеры (англ. primer) — это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, который служит стартовой точкой при репликации ДНК.

Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица.

Tm — температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Температуру плавления можно приблизительно определить по формуле:

Tm = 2 • (n_A + n_T) + 4 • (n_G + n_C), где n_X — количество нуклеотидов Х в праймере.

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

- GC-состав ~ 40—60 %;

- близкие Tm праймеров (отличия не более чем на 5 °C);

- отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек (внутримолекулярных самокомплементарных структур) и димеров (межмолекулярных структур, образуемых праймерами друг с другом или сами с собой);

- желательно, чтобы на 5’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий:

1. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

2. Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура проведения отжига зависит от длины затравки и содержания в ней GC-nap. Для типичной затравки длиной 20 нуклеотидов и 50%-ным содержанием GC-nap подбор температуры хорошо начинать с 50-60°С. Из-за большого молярного избытка затравки в реакционной смеси гибридизация происходит почти мгновенно и не требуется долгой инкубации при температуре отжига. Иногда оказывается возможным отжигать затравки и при 72°С, т.е. при температуре достройки. При этом значительно упрощается вся процедура: она сводится к двухтемпературному циклу.

В некоторых случаях, когда доступны только 12-15-нуклеотидные затравки, требуется температура отжига 40°С. Однако затравки такой длины не удерживаются на матрице при температуре достройки 72°С. Преодолеть эту трудность можно следующим образом. Используя частичную ферментативную активность полимеразы при низких температурах, можно удлинить затравки на несколько нуклеотидов и тем самым стабилизировать их. Это достигается либо за счет промежуточной инкубации в течение нескольких минут при 55-60°С или путем медленного нагревания от 40 до 72°С.

3. Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n, где n — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

Проведение электрофореза в полиакриламидном геле

После завершения ПЦР проводится вертикальный гель-электрофорез продуктов амплификации в 6%-ом полиакриламидном геле, 1 кратном ТВЕ-буфере, при 80-150 мА в течение 2-3 часов.

Перед приготовлением ПААГ собирается вертикальная камера для электрофореза:

Для заливки геля необходимо использовать две стеклянные пластины разного размера.

1. Поместить стеклянную пластинку большего размера на ровную горизонтальную поверхность, по ее краям расположить два спейсера. Сверху на спейсеры положить стеклянную пластинку меньшего размера.

2. Переместить стеклянные пластинке в вертикальное положение и поставить на горизонтальную поверхность. С помощью специальных зажимов зафиксировать стеклянные пластинки с находящимися между ними спейсерами.

3. Поместить зафиксированные стеклянные пластинки с находящимися между ними спейсерами на заливочный столик.

1. Для приготовления разделяющего геля необходимо смешать компоненты (за исключением ТЕМЕД и ПСА) в количествах, указанных в таблице. Полученную смесь тщательно перемешать.

2. Добавить ПСА и ТЕМЕД, тщательно перемешать полученный раствор, не допуская образования пузырьков с газа.

3. Полученный раствор разделяющего геля с помощью пипетки поместить между стеклянными пластинами так, чтобы его уровень составлял около 5 мм.

1. Необходимо дождаться пока разделяющий гель застынет. Это занимает около 39 минут. Далее приготовить концентрирующий гель.

2. Наслоить на поверхность застывшего разделяющего геля раствор концентрирующего геля и вставить гребенки, избегая появления пузырей воздуха.

3. Оставить гель застывать в течение 30 минут.

4. Поставить электрофорезную камеру на ровную горизонтальную поверхность.

5. Приготовить 5х стоковый раствор электродного буфера: 9 г трис, 43,2 г глицина, 3 г SDS растворить в деионизованной воде.

1. Добавить разведенный в 5 раз (60 мл стокового раствора + 240 мл деионизованной воды) электродный буфер в нижнюю и верхнюю часть электрофорезной камеры так, чтобы уровень электродного буфера на 0.5 см был выше уровня геля.

2. Осторожно удалить гребенку из геля, сразу же промыть лунки дистилированной водой.

1. Проводили предварительный электрофорез геля при постоянном токе 100А и напряжении 500В.

2. Образцы ДНК окрашивали двойным красителем в соотношении 1:2.

3. Нанести по 20 мкл полученных растворы образцов в лунки. В крайние лунки наносится маркер 100 bp ladder 20 bp ladder.

4. Подключить электрофорезную камеру к источнику тока. Электрофорез проводится при постоянном токе - 65 мА для и напряжении 399 В.

5. По истечении 3 часов отключить ток, удалить пластинки с гелем из электрофорезной камеры, осторожно вынуть спейсеры, находящиеся между стеклянными пластинками и отделить гель от стеклянных пластинок.

6. После окончания электрофореза поместить гели в ванночки с дистиллированной водой, добавить 25 мкл бромистого этидия (EtBr), и оставить на мешалке на 20 минут.

7. Удалить раствор для окрашивания и промыть гель дистиллированной водой.

8. Осторожно перенести гель на стекло трансиллюминатора и пронаблюдать свечение ДНК под ультрафиолетом.

Таким образом,

1. Метод ПЦР-диагностики позволяет обнаружить любые ДНК, обладает высокой специфичностью, возможностью проведения как качественной, так и количественной оценки содержания нуклеиновой кислоты, высокой технологичностью и автоматизацией, но вместе с тем этот метод предъявляет высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест-систем, полному отсутствию загрязнения посторонними молекулами ДНК

2. Было выделено 59 образцов ДНК из фрагментов плавников судака Азово-Черноморского бассейна и осуществлена ПЦР-диагностика с двумя праймерами. Установлено, что выбранные праймеры (GTC)8 и (GACA)4 не являются видоспецифичными поскольку не обнаружено ни одной аллельной частоты, по которой каждая проба дала свечение в ультрафиолете.

3. Исследования показали низкую гетерозиготность по выбранным праймерам. Гетерозиготность по праймеру (GTC)8 равна 0,27, а по праймеру (GACA)4 соответствует 0,2, что свидетельствует о низком генетическом разнообразии судака Азово-Черноморской популяции.

 

Код для цитирования: Скопировать