VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Введение

Вирусы, являясь облигатными внутриклеточными паразитами, не способны размножаться вне организма хозяина. Не смотря на достаточно простое строение и отсутствие таких защитных механизмов от агрессивных факторов, как спорообразование у некоторых микроорганизмов, многие вирусы способны сохраняться определенное время в окружающей среде. Особый интерес вызывает действие абиотических и биотических факторов на длительность выживания вирусов – возбудителей инфекционных заболеваний людей и животных, механизм заражения которыми несвязан с векторами-переносчиками (например, насекомыми), а происходит при непрямом контакте через субстраты внешней среды (воду, почву, пылевые частицы и т.д.). Устойчивость патогена с сохранением его жизнеспособности в разнообразных внешних условиях среды обитания зависит от свойств штаммов и частиц, на которые адсорбируется патоген, в частности, их размера, плотности, вязкости, пористости, а также атмосферных условий (влажности, температуры окружающей среды, солнечной радиации). Так энтеровирусы сохраняются в водопроводной воде до 18 дней, в речной - 33 дня, в сточных водах и влажной почве – до 2 месяцев, вирус африканской чумы свиней - в почве – более 100 суток, в стоячей воде до 2 месяцев, высокопатогенный вирус птиц сохраняется в подстилке до 10 дней (Багдасарян Г.А., 1970., Болоцкий И.А., 2008 г., Макаров В.В., 2007).

Одними из вирусов, передающихся при непрямом контакте, являются представители рода Hantavirus. Хантавирусы относятся к группе особо опасных возбудителей и вызывают две природно-очаговые зоонозные инфекции: хантавирусный легочный синдром (ХЛС) в Новом Свете и геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (ГЛПС) на евразийском континенте. Среди всех природно-очаговых инфекций, широко распространенных на территории РФ, в странах СНГ, Европы и Азии, ГЛПС занимает особое положение не только по распространенности, но и по тяжести клинических проявлений, эпидемиологии, терапии и профилактике. По данным Роспотребнадзора только в России число официально зарегистрированных случаев ГЛПС в последние годы неуклонно растет.

В настоящее время хантавирусная инфекция в форме ГЛПС представляет собой одно из наиболее распространенных на территории России природно-очаговых заболеваний. По данным Роспотребнадзора РФ в 2012 году рост заболеваемости на 20,7% превысил показатели 2011 г. Эти цифры в 10 раз и более превышают уровень заболеваемости клещевым энцефалитом, бешенством, лептоспирозом и другими традиционно фиксируемыми природно-очаговыми инфекциями. (Ткаченко Е.А., Бернштейн А.Д., 2012).

В виду отсутствия на данное время вакцины, состоящей из большинства серотипов хантавирусов, циркулирующих на территории Евразии, особую важную роль играет неспецифическая профилактика ГЛПС. Аэрогенный путь заражения предполагает определенную стабильность хантавирусов во внешней среде после выделения с экскретами мышевидными грызунами – природными носителями, однако, исследования по обнаружению хантавируса во внешней среде, условия длительности его сохранения вне организма хозяина пока единичные и получены в основном экспериментально.

Цель и задачи исследования:

Цель – наоснованиилитературных данныхпоказать возможность сохранения hantavirus вне организма природного хозяина на объектах внешней среды.

Задачи:

1. Дать характеристику рода Hantavirus;

2. Описать эпидемиологические и эпизоотологические аспекты проявлений хантавирусной инфекции;

3. Описать методы идентификации хантавирусов;

4. Показать влияние различных факторов, влияющих на сохранение вирусов в окружающей среде;

5. Показать способность и оптимальные условия адсорбции хантавируса на почве, почвообразующих компонентах.

6. По данным обнаружения специфической РНК, выявить наличие хантавируса в субстратах внешней среды.

Материалы и методы:

Информационные источники:

1) Библиотека ДВФУ (фундаментальная библиотека);

2) Краевая научно-медицинская библиотека (ст. переливания крови);

3) Библиотека им. Горького;

4) Интернет источники;

5) Микробиологические сайты, посвященные Hantavirusна русском и английском языках:

1) http://microbewiki.kenyon.edu

2) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

3) http://www.eurolab.ua

4) http://elibrary.ru/defaultx.asp

Ведущие научные институты и учреждения, занимающиеся изучением хантавирусов и хантавирусной инфекции:

1. ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН (Москва) - изучение этиологии, эпидемиология, специфической диагностики и профилактики геморрагических лихорадок (в том числе ГЛПС), экологии вирусов-возбудителей геморрагических лихорадок.Является референс-центром по борьбе с ГЛПС Министерства здравоохранения и социального развития РФ и РАМН

2. ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН (Владивосток) – изучение распространения и разнообразия хантавирусов, циркулирующих в Приморском крае. Изучение этиологии и эпидемиологии ГЛПС.

3. ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека – изучение генетического разнообразия хантавирусов, в том числе хантавирусов, выделенных от насекомоядных.

Исследователи:

Lee H.W. – корейский ученый, впервые обнаруживший хантавирус в легких полевой мыши.

Smaljon C.S. – американский ученый, один из ведущих специалистов по проблеме хантавирусов в мире (молекулярная биология хантавируса, разработка вакцины, эпидемиология хантавирусной инфекции)

Ткаченко Е.А. - заместитель директора ФГБУ «ИПВЭ им. М.П. Чумакова» РАМН, доктор медицинских наук, профессор – создание диагностических препаратов для диагностики ГЛПС, разработка специфической профилактики ГЛПС

Слонова Р.А. – доктор медицинских наук, профессор – изучение эпидемиологии ГЛПС и эпизоотологии хантавирусов, циркулирующих на территории Приморского края.

Яшина Л.Н. – (доктор биологических наук ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека) – изучение генетического разнообразия хантавирусов, молекулярно-генетическое изучение новых хантавирусов.

Журналы: 1) Applied Microbiology and Biotechnology (http://www.springer.com);2) Microbiology and Molecular biology reviews (http://mmbr.asm.org);3) Journal of Biotechnology (http://www.journals.elsevier.com). Глава 1 Характеристика рода Hantavirus 1.1 Появление нового рода Hantavirus в семействе Bunyaviridae Поиск возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) и вероятных животных – его источников начал проводиться в 30-е годы прошлого века после установления нозологической самостоятельности заболевания. Представление о том, что резервуаром возбудителя в природе являются мелкие млекопитающие, в частности мышевидные грызуны, сложилось в те годы на основании эпидемиологических и зоологических наблюдений. Впервые возбудитель ГЛПС был обнаружен с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител в криостатных срезах легких полевой мыши, отловленной на эндемичной территории Южной Кореи в районе реки Хантаан, давшей название выделенному вирусу (Nichol S.T., Spiropoulou C.F., Rollin P.E., Ksiazek T.G.,1993). В 1982 году в результате электронно-микроскопического исследования вируса Hantaan (McCormick J. B., White J. D. Et al., Hung T., 1982), были представлены доказательства о морфологическом сходстве его с вирусами семейства Bunyaviridae. При анализе РНК вируса Hantaan, адаптированного к клеткам VeroE6, оказалось, что геном хантавируса, подобно геному вирусов семейства Bunyaviridae, состоит из 3-х сегментов одноцепочечной РНК отрицательной полярности. После данных исследований были обозначены критерии для включения хантавирусов в семействоBunyaviridae, которые сводились к наличию: 1. Сферической формы вириона размером в среднем 95 нм, с наружной оболочкой; 2. 3-х сегментов одноцепочечной РНК отрицательной полярности с общим молекулярным весом 4.5 * 10⁶ в структуре генома, заключенные в нуклеокапсидную оболочку; 3. Наличие в оболочке вириона 2-х гликопротеидов; 4. Способности созревания вирионов в зараженных клетках в аппарате Гольджи. В дальнейшем, при изучении структуры генома хантавируса, физико-химических свойств вириона и серологических взаимосвязей вируса Hantaanс другими представителями семейства Bunyaviridae были выявлены существенные его отличия от других вирусов этого семейства (Tsai T.F., 1985). Основанием для выделения в самостоятельный род Hantavirusсемейства Bunyaviridae является (Schmaljohn C.S., 1985): 1. Уникальность нуклеотидной последовательности 3' конца вирионных сегментов вирусной РНК; 2. Отсутствие серологической связи с другими членами семейства Bunyaviridae. Сама классификация хантавирусов была предложена только в 1982 году составе Доклада №4 международного комитета по таксономии хантавирусов. С тех пор эти правила подвергались лишь частичной корректировке. В последующих Докладах лишь подтверждался статус вновь открытых видов. В 2005 году вышел 8-й Доклад, полностью посвященный описанию нового вида. В настоящее время в международном комитете по таксономии вирусов зарегистрированы 23 иммунологически и генетически отличающихся друг от друга вида хантавирусов и их число продолжает увеличиваться (Nichol S.T., 2005; Vaheri A., 2008). Трудности изоляции штаммов хантавирусов привели к тому, что ряд новых генетически значительно отличающихся хантавирусов был идентифицирован на основании анализа фрагментов их геномов (Klempa B., 2007;). В литературе до выделения штаммов и их иммунологического анализа генетически отличающиеся хантавирусы называют генетическими типами, а отличающиеся группы внутри каждого генетического типа – генетическими вариантами ( Kang W., 2009; Mir M.A., 2010). Научная классификация: Домен: Virus Семейство: Bunyaviridae Род: Hantavirus Виды: Adenes virus; Bayou virus; Black Creek Canal virus; Cano Delgadito virus; Dobrava-Belgrade virus; El Moro Canyon virus; Hantaan virus; Isla Vista virus; Khabarovsk virus; Laguna Negra virus; Muleshoe virus; New York virus; Prospect Hill virus; Puumala virus; Rio Mamore virus; Rio Segundo virus; Saaremaa virus; Seoul virus; Sin Nombre virus; Thailand virus; Thottapalayam virus; Topografov virus; Tula virus, и др. Критериями для выделения нового вида хантавируса, согласно данным международного комитета по таксономии вирусов являются: 1. прямое доказательство ассоциации с определенным видом или подвидом грызуна – резервуара; 2. около 7% степень различия аминокислотных последовательностей; 3. не менее 4-х кратной двухсторонней разницы в опыте перекрестной реакции нейтрализации; 4. отсутствие естественной реассорции с другими вирусами (Elliot R., 2000; Plyusnin A.,2002). За все время исследований число выявленных новых генотипов хантавируса при исследовании РНК вируса, выделенной непосредственно из инфицированных органов грызунов или крови больных ГЛПС, значительно превышает число серологических типов, выделенных и от дифференцировнных на клеточной культуре. По данным разных авторов, число серотипов/генотипов в настоящее время насчитывают от 20 до 30. В настоящее время общепризнанно, что каждый генотип/серотип хантавируса связан с единственным видом грызуна-хозяина в результате длительной коэволюции (Schmaljohn C. S., 1997). 1.2 Структура вириона и организация генома хантавируса По современным представлениям хантавирусный вирион имеет наружную оболочку и три сегмента вирусной РНК отрицательной полярности. Регион, кодирующий белок большого (L) сегмента состоит из 6530-6550 нуклеотидных оснований, средний (M)- 3613-3707 нуклеотидных оснований и малый (S) – 1696-2083 нуклеотидных оснований (но). Кроме того, в структуре 3' конца каждого сегмента имеется некодируемый регион: для L сегмента длиной 38-48 но, М-168-222 но, S-370-730 но. (Schmaljohn C.S., 1986, 1987, 1990) (рис.1) Рис.1. Схема строения хантавируса (Muranui W., 2005) Каждый геномный сегмент хантавируса имеет единственную открытую рамку считывания OPC(open reading frame (ORF)). Дополнительных ОРС в составе L, M, S сегментов хантавирусов, в отличие от представителей других родов в семействе Bunyaviridae, не обнаружено. Сегменты генома также имеют различную молекулярную массу. Для L сегмента она равна 2,6*10⁶ кДа, М-1,2*10⁶кДа, S -0,6*10⁶ кДа. (Schmaljohn C.S., 1983, 1986, 1987.) 1. L – сегмент, кодирует вирусный белок, обладающий полимеразной активностью (вирусную РНК-зависимую РНК полимеразу) с молекулярной массой 200-250 кДа. Сходство по этому белку для Hantaan и Puumala вирусов составило 64,0%, для Seoul и Hantaan-70,0%. 2. М – сегмент вирусной РНК кодирует белки наружной оболочки G1 и G2 с молекулярной массой в 64 кДа и 53,7 кДа. При этом оба белка хантавируса кодируются одной рамкой считывания, синтезируясь одновременно через полипептид – предшественник с молекулярной массой 125 кДа, который подвергается протеолизу, расщепляясь на два структурных белка G1 и G2. Белки G1 и G2 обладают гемаглютинирующей активностью и индуцируют pH-зависимое клеточное взаимодействие, что играет важную роль в прикреплении вируса к поверхности чувствительных клеток и при «раздевании» вируса на начальных стадиях инфекции. Вход вируса в чувствительную клетку осуществляется путем рецепторно – опосредованного эндоцитоза с помощью β₃ – интегринов, которые являются оболочечными поверхностными рецепторами эндотелиальных клеток, тромбоцитов и макрофагов. 3. S- сегмент вирусного генома кодирует нуклеокапсидный белок N с молекулярной массой 48 кДа. Нуклекапсидный белок N известных хантавирусов антигенно и генетически более консервативен, по сравнению гликопротеинами G1 и G2, что позволяет использовать его в качестве основы при разработке типоспецифических диагностических тестов. В то же время защитные свойства белков М и S сегментов учитываются при создании рекомбинантных хантавирусных вакцин. Наличие у хантавирусов 4-х вирусных белков с соответствующей молекулярной массой, было выявлено при использовании электрофореза в СDC – полиакриламидном геле и радиоиммунопреципитации. По данным электронно-микроскопических исследований вирионы хантавируса имеют округлую форму с диаметром 90-120нм, покрыты липидсодержащей оболочкой (суперкапсидом) с выступами, которые формируются за счет вирионных гликопротеинов. Плавучая плотность хантавируса в градиентесахарозы составляет 1.16-1.17 г/мл, хлорида цезия 1.20-1.21 г/мл, константа седиментации равна 350-450 S. По этим показателям хантавирусы также отличаются от других представителей семейства Bunyaviridae. Химический анализ хантавируса показал, что вирион содержит 2,0% РНК, 58,0% белка, 7,0% углеводов, 33,0% липидов. ( Слонова Р.А., Ткаченко Е.А., Иванис В.А., Компанец Г.Г., Дзагурова Т.К. 2006). 1.3 Географическое распространение хантавирусов Наиболее многочисленную группу, среди инфицированных хантавирусами, мелких млекопитающих представляют мышевидные грызуны. На европейской части России (таблица 1) , а также в большинстве стран Европы, где регистрируется ГЛПС (Германия, Бельгия, Польша, Финляндия, Швеция, Норвегия, страны бывшей Югославии), доминирует вирус Puumala – носителем которого является рыжая полевка. В европейских странах, за исключением Финляндии, Швеции и Норвегии, обнаружена циркуляция вируса Dobrava-Belgrade, основным хозяином которого на Балканах является желтогорлая мышь. (Gligic A., 1989, 1992; Avsic-Zupanc T., 1995). Этот же вирус в странах восточной и центральной Европы, а также в центральных областях России циркулирует в популяциях полевой мыши. В 2005 году был выявлен геновариант вируса Dobrava-Belgrade в популяциях кавказской лесной мыши в Краснодарском крае.(Ткаченко Е.А. 2005). Вирус Tula, циркуляция которого впервые была выявлена у Microtusarvalis на территории центральной России (Деконенко А.Е., 1996; Plyusnin A., et al., 1996), позже был обнаружен у этого вида полевок и в других странах Европы (Pejcoch M., et al., 1992, 2003; Song Z. W., et al., 2004). В Западной Сибири обнаружен в популяциях узкочерепной полевки и степной пеструшки (Якименко В.В., и соавт., 2002). Изолят от сибирского лемминга, отловленного на полуострове Таймыр, оказался новым генотипом, получившим название вируса Topograpfov(Plyusnin A., et al., 1996). На территории Хабаровского и Приморского краев в популяциях дальневосточной полевки выявлена циркуляция генотипа Khabarovsk (Яшина Л. Н., 2006., Horling J., et al., 1996; Kariwa H., et al., 1995). Широкое распространение в странах Евразии имеет вирус Seoul, поскольку его природный хозяин – серая крыса- встречается практически повсеместно (LeDuc J. W., 1986; Lee H.W., 1990). Учитывая, что структура природных вирусных популяций определяется природным хозяином, занимающим определенный ареал, в Приморском крае разработаны и представлены ( Симонов С. Б., 2005) картографические данные о распространении доминирующих генотипов хантавируса, циркулирующих в регионе значительную площадь лесопокрытой территории края занимает носитель вируса Amur - восточноазиатская мышь и геноварианта Shokotovo вируса Puumala - красно-серая полевка. На равнинной территории доминирует полевая мышь – носитель геноварианта FarEast вируса Hantaanи дальневосточная полевка – носитель вируса Khabarovsk. В крае имеются очаговые территории, где в качестве носителей разных серотипов/генотипов в разной степени обитают два и более носителя хантавирусов (рис.2). Рис.2 Карта – схема распространения грызунов – носителей различных серотипов/генотипов хантавирусов в Приморском крае (Симонов С.Б., 2003) Таблица1 Хантавирусы, циркулирующие в евроазиатских очагах России

Серотип генотип/ геновариант	Источник	Территория циркуляции	Значение в патологии людей	Автор
Hantaan Far East	Ap. agrarius	Дальневосточный регион России	ГЛПС	Yashina L. et al (2000)
Amur	Ap. peninsulae	Дальневосточный регион России	ГЛПС	Yashina L. et al (2001), H. Kariwa et al. (2001)
Seoul Vladivostok	R. norvegicus	Дальневосточный регион России	ГЛПС	Yashina L. et al (2000)
Puumala Shkotovo	M. rufocanus Myodes rutilus	Дальневосточный регион России	н/у	Яшина Л.Н. (2005), Н. Kariwa et al (2002)
Khabarovsk Vladivostok	Microtus maximowiczii Microtus fortis	Дальневосточный регион России	н/у	Яшина Л.Н. (2006), Н. Kariwa et al (2001)
Puumala Moscow	M. glareolus	Европейская часть России	ГЛПС	Ткаченко Е. А. (2005) Иванов А.Е.
Dobrava	Ap. argarius Ap.ponticus	Европейская часть России	ГЛПС	Ткаченко Е. А. (2005)
Tula	Microtus arvalis	Европейская часть России	н/у	Деконенко А.Е. (1996)
Topografov	Lemmus sibiricus	Европейская часть России, Сибирь	н/у	Vapalahti O. et al., 1999

Глава 2 Проявления хантавирусной инфекции 2.1 Обнаружение хантавируса в органах инфицированных мышевидных грызунов природных популяций Естественный резервуар хантавирусов — различные мелкие мышевидные грызуны семейства Mundae подсемейства Murinae, обитающие во влажной местности: широко распространенная в Европе и Азии полевая мышь Apodemus agrarius (Hantaan virus), повсеместно обитающая норвежская крыса Rattus norvegicus (Seoul virus), в европейском регионе и на Ближнем Востоке — рыжая, или желтогорлая полевка Apodemus flavicollis(Dobrava-Belgrade virus), в Европе, Западной и Центральной Азии — речная береговая полевка Myodesglareolus (Puumala virus), а также иные виды грызунов: полевок, полевых и лесных мышей, возможно, леммингов и других. У грызунов хантавирусы вызывают персистирующую бессимптомную инфекцию. К настоящему времени в отечественной и зарубежной литературе имеется мало данных о патогенезе хантавирусной инфекции у естественно инфицированных мышевидных грызунов, что связано с трудностью наблюдения за течением инфекции у грызунов в их естественной среде обитания.

В процессе многолетних эпизоотологических наблюдений было уста-новлено бессимптомное течение хантавирусной инфекции у грызунов при-родных популяций, при котором вирус длительно персистирует в различных органах зараженных животных без видимых клинических проявлений инфекции. Периодически вирус способен выделяться во внешнюю среду со слюной, мочой и фекалиями животных. Считается, что в течение совместной эволюции хантавируса с их природными хозяевами - грызунами у животных сформировались адаптационные свойства, включая иммунную реактивность, гормональный фон и генетические факторы, направленные на регуляцию негативных проявлений инфекции и возможность длительной персистенции вируса ( Desmyter J., LeDuc J. W., Johnson K.M., Brasseur F., Deckers C.,1983).

Впервые хантавирус в органах грызунов природной популяции был обнаружен с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител в криостатных срезах легких инфицированной полевой мыши, отловленной в эндемичном по ГЛПС районе Южной Корее (Nichol S.T., Spiropoulou C.F., Morzunov S., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Feldmann H., 1993). При обработке антигенсодержащих срезов легкого грызуна сывороткой крови, полученной от лиц, перенесших ГЛПС, с помощью НМФА удалось выявить специфическое изумрудно-зеленое свечение в цитоплазме клеток.

В Приморском крае у инфицированных мышевидных грызунов антиген хантавируса был выявлен иммуноферментным методом помимо легких в почках, селезенке, печени, буром жире, а так же содержимом кишечника, слюнных железах и моче(Деконенко А.Е., Дзагурова Т.К. Якименко В.В., и соавт., 2000).

У естественно инфицированных мелких млекопитающих в европейских очагах циркуляции хантавируса также установлено, что чаще и в более высоких концентрациях вирусный антиген у рыжей полевки присутствует в легких. (Хунафина Д.Х., Галиева А.Т., Бурганова А.Н., Шамсиева А.М., Кутуев О.И., 2008).

Помимо этого антиген был найден в буром жире, слюнных железах, селезенке, почках, печени, моче и фекалиях (Delfraro A., Tome L., Elia G.D., Glara M., Rego N., Achaval F., Arbiza J. 2007).

На настоящем этапе изучения хантавирусной инфекции у мышевидных грызунов эти данные подтвердились при использовании современных генетических методов исследования. При использовании ОТ-ПЦР метода РНК хантавируса была обнаружена в образцах крови и многих внутренних органах зараженных животных, при этом высокая вирусная нагрузка наблюдалась в первый месяц после инфицирования на фоне распространения вируса по внутренним органам и выделение его во внешнюю среду (Wu G., 1992).

Специфическая РНК была выделена из образцов бурого жира, слюнных желез, жевательных мышц, селезенки, почек, печени, легкого, сердца и мочевого пузыря, а также крови, мочи и орофаренгиального секрета. Впервые из мочи и орофаренгиального секрета оленьей мыши природной популяции был выделен инфекционный вирус, что означало непосредственную возможность передачи вируса с помощью экскретов (Botten J., Mirowsky K., Ye C., Gottlieb K., Saavedra M., Ponce L., et al., 2002.)

Высказано предположение о снижении вирусной нагрузки в крови и внутренних органах, что уменьшает возможность передачи инфекции, на фоне роста титра специфических антител (Olsson G.E., Dalerum F., Hornfeldt B., Elgh F., Palo T.R., Juto P., Ahlm C., 2003.; Yashina, L. N., Patrushev, N. A., Ivanov, L. I., Slonova R. A., Mishin,V. P., Kompanez, G. G., Zdanovskaya, N. I., Kuzina, I. I., Safronov, P. F. et al., 2000).

Таким образом, при наблюдении за спонтанно инфицированными природными носителями хантавируса были получены данные о бессимптомном проявления инфекции у грызунов, несмотря на наличие вируса во многих органах и тканях. Обнаружение специфического антигена/РНК, а особенно выделение инфекционного хантавируса не только из органов выделения, но и экскретов подтверждало возможность попадания хантавируса во внешнюю среду и загрязнение объектов внешней среды, что способствовало передачи вируса между грызунами и от грызунов непрямым путем человеку. 2.2 Пути заражения хантавирусами В изучении эпидемиологии и эпизоотологии хантавирусной инфекции одним из важных аспектов является выявление путей распространения хантавируса в популяции мышевидных грызунов - природных носителей для поддержания функционирования очагов инфекции, а также установления механизма заражения человека.

По последним данным распространение хантавируса среди природных носителей возможно при прямом контакте через поврежденные кожные покровы, через слюну инфицированных грызунов при укусе. Это положение основывается на обнаружении вируса в слюнных железах, а также корреляции между обнаружением РНК или антигена хантавируса в органах животных и наличием у них кожных повреждений, связанных с агрессивным поведением (Кушнарева Т.В., Слонова Р.А., 2008).

В распространении хантавируса не исключается роль эктопаразитов, что подтверждается обнаружением вирусного антигена у гамазовых клещей, собранных с мышевидных грызунов и выделением инфекционного вируса из суспензии клещей Ornithomyssus bacoti, Eulaelaps stabularis и Haemolaelaps casalis (Якименко В.В., 2004.; Houck M. A., Qin H., Roberts H. R., 2001).

Как считает ряд авторов, воздушно-пылевое распространение хантавируса связано с инфицированием пылевых частиц воздуха при попадании на объекты внешней среды вируса от животных-носителей и образовании пылевого аэрозоля (Lee H.W., Amer. J., 1981; Schmaljohn C.S., Hjelle B.,1997). В связи, с чем воздушно-пылевой путь заражения хантавирусом человека и животных, признается как основной при хантавирусной инфекции. Впервые данные о воздушно-пылевом пути заражения человека были высказаны Т.А. Башкирцевым (Башкирев Т.А. 1959) еще до выделения вируса. Сходные заключения были сделаны С.М. Кулагиным и соав. при анализе вспышки ГЛПС среди сотрудников Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, имевших контакт с дикими мышевидными грызунами, отловленными в природных очагах хантавирусной инфекции. При этом для заражения было достаточно 5 минутного пребывания в помещении, где содержались зараженные животные, при отсутствии прямого контакта с ними. (Кулагин С.М., Федорова Н., Кетиладзе Е., 1962).

Позднее о случаях заболевания ГЛПС среди работников вивария и экспериментаторов, работающих с лабораторными животными разных видов, зараженных хантавирусами, сообщалось из ряда стран (Easterbrook J.D., 2008.; Lloyd G., 1984.; Desmyter J., 1983.; Umenai T.,1979.; Lee H.W., Johnson K.M., 1982). При этом отмечалось, что зараженными были не только природные популяции, но и лабораторные колонии мышевидных грызунов от случайно попадавших в виварии диких грызунов, инфицированных хантавирусом. Почти все лабораторные вспышки хантавирусной инфекции, по наблюдениям H.W. Lee и соав. (Lee H.W., Johnson K.M., 1982), происходили осенью или зимой в условиях закрытого помещения с определенными параметрами микроклимата и отсутствием вентиляции, что, по всей вероятности, обеспечивало концентрацию и стабильность пылевого аэрозоля, для аэрогенного заражения людей.

Прямое доказательство возможности передачи хантавируса через воздух было получено Z.Z. Luo и соав. выделением вируса на клетках Vero E6 из проб воздуха, собранных в комнате, где содержались зараженные животные, а среди работников наблюдались случаи заражения хантавирусной инфекцией. (Luo Z.Z., Liu Y.F., 1988).

Воздушно-пылевой путь заражения хантавирусом подтверждается многочисленными эпидемиологическими наблюдениями в очагах хантавирусной инфекции. Так случаи ГЛПС, вызванные вирусом Seoul, в городском очаге, как отмечает Компанец Г.Г., чаще наблюдались у лиц (кочегары, слесаря, сантехники, кладовщики и т.п.), постоянно работающих в пыльных подвальных помещениях, где обитали серые крысы – носители вируса, а так же среди уборщиц и работников, занимающихся уборкой помещений и вывозом мусора. (Компанец Г.Г., 2002).

Заболеванию, обусловленному вирусами Puumala и Dobrava, в европейских странах предшествует посещение леса с целью отдыха, сбора дикоросов и опавших листьев или производственная и сельскохозяйственная деятельность в лесных и полевых очагах, особенно работа, связанная с перевозом сена, фуража, корнеплодов, уходом за домашними животными, обработкой зерна; уборка в подсобных помещениях; работа на дачных участков; а так же пребывание детей в оздоровительных лагерях или на полевых работах (Верховцев В.Н., Спиридонов А.П. 1998; Хунафина Д.Х.2008; Хатько Н.И., 1998; Нафееф А.А.,2006-2007). Случаи ГЛПС среди городского населения могут быть обусловлены посещением лесопарковых зон, где обитают мышевидные грызуны, с целью отдыха и занятия спортом, а также уборкой примыкающих к ним стадионов (Хасанова Г. М., 2007). Изучение вспышки хантавирусной инфекции среди работников леса на юге Бельгии выявило, что причиной заражения стала работа, связанная с рубкой леса, и проживание в непроветриваемых помещениях, где отмечалось наличие грызунов и следов их жизнедеятельности (Van Loock F., 1999). При анализе вспышечной заболеваемости среди контингента военно-служащих, было установлено, что нередко заражению хантавирусом способствовало проживание в палатках, при использовании для настила в них сена или соломы, работа по расчистке от кустарников территории учебных полигонов (Слонова Р.А., Компанец Г.Г., Образцов Ю.Г. 2005.; Clement J. P., 1996). Заражение хантавирусом от человека человеку аэрогенным путем пока описано при ХЛС, обусловленном вирусом Andes, среди медперсонала, заражение которого происходило в процессе ухода за больными, и родственников во время семейных вспышек (Wells R.M.,1997.; Padula P.J.,1998.; Martinez V.P., 2005.). Как аргумент возможного заражения от больного человека приводились данные экспериментальных исследований, при которых вирус Andes оказался менее чувствителен к противовирусному действию слюны человека, чем Puumala и Hantaan (Hardestam J., Lundkvist A., Klingston J., 2009). Ряд авторов ( Navarrete M., 2007; Pettersson L., 2008) приводят данные по обнаружению в слюне больных ХЛС не только антител, но также антигена или РНК хантавируса, что может косвенно подтверждать возможность передачи хантавируса от человека к человеку. Однако такой путь заражения остается спорным, так как из слюны больного не был выделен инфекционный вирус, а за все время изучения заболеваемости ХЛС случаи заражения от человека к человеку воздушно-капельным путем пока единичны и требуют представления более тщательных доказательств. Исследователями из Китая было доказано внутриутробная передача возбудителя. При наблюдении за 84 беременными женщинами – больными ГЛПС, 10 – родили мертвых детей. У 4-х умерших детей были найдены характерные для ГЛПС патоморфологические изменения в органах, выделен возбудитель. У 2-х выживших детей обнаружены антитела к вирусу Hantaan, которые сохранялись до 3-х лет. Таким образом, несмотря на существование нескольких возможных путей распространения хантавируса, описанных в литературе, воздушно-пылевой путь заражения человека остается на данный момент основным, что подтверждается и выделением вируса от грызунов с экскретами во внешнюю среду, нахождении его в пробах воздуха и многочисленными эпидемиологическими наблюдениями. Однако, на наш взгляд, не достаточно учитывается влияние условий заражения хантавирусом человека, длительности пребывания заболевших в очагах инфекции, а также характер выполняемой работы, особенно с повышенным пылеобразованием на тяжесть клинического течения инфекции и ее исход. Глава 3 Методы идентификации хантавирусов 3.1 Вирусологические методы

Для выделения хантавирусов в настоящее время широко используется перевиваемые культуры клеток, такие как эпителий почки зеленой мартышки (Vero E6) и карциномы человека (А-549), диплоидные клетки (полуперевиваемые) легкого эмбриона человека (2Bs), а так же первичные культуры легочной ткани крысы (RLS).

Однако на многих клеточных линиях хантавирусы при размножении накапливались в невысоком титре, и культивирование их было связано с определенными трудностями. В этом плане оптимальной клеточной культурой для работы с хантавирусами пока являются клетки Vero E6.

Для размножения клеток используют среду Игла МЭМ с двойным набором аминокислот и витаминов, в которую добавляли L-глютамин (1мг/мл), 7% сыворотку эмбрионов коров (СЭК), антибиотики для предотвращения бактериального роста. На монослой клеток, сформировавшихся на 2-3 день во флаконе, после удаления среды роста наносят исследуемый материал объемом 0,2 мл и инкубировали в течение часа при температуре 37°С в термостате или CO₂-инкубаторе. После контакта инокулят сливают, монослой дважды промывают поддерживающей средой 199, содержащей антибиотики, а во флакон добавляли поддерживающую среду Игла МЭМ с 2,0% СЭК. Накопление вируса осуществляли в термостате при температуре 37°С в термостате или CO₂-инкубаторе в течеине 10-14 дней, в зависимости от серотипа хантавируса. Через две недели проводят первый пассаж, для чего сливают культуральную жидкость из зараженных флаконов, монослой дважды отмывают средой 199 и для снятия клеток обрабатывают смесью, раствора трипсина и раствора Версена в равных пропорциях. После отслоения клеток от стекла во флаконы добавляли 1,0 мл питательной среды и переносят в новый флакон с монослоем для последующего пассирования.

Подтверждением успешного размножения хантавируса в клеточной культуре служит наличие внутриклеточного специфического антигена, который выявляется в препаратах инфицированных клеток с помощью НМФА. Для обнаружения специфического антигена используется сыворотка реконвалесцента ГЛПС. (Воробьев А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2006). 3.2 Методы, подтверждающие наличие хантавируса в культуре клеток Хантавирусы не обладают цитопатотогенным действием, т.е. не вызывают разрушение инфицированных клеток, поэтому при обычной микроскопии невозможно определить наличие вируса в культуре клеток. 3.2.1 Метод индикации инфекционных фокусов Способность хантавируса после заражения монослоя клеток Vero E6 под средой покрытия, содержащей агарозу, формировать бляшки (участки пораженных хантавирусом клеток, не способных воспринимать краситель нейтральный красный) впервые была показана J.McCormick et al. (1982). Этот феномен был успешно использован A. Takenaka et al. (1985) для определения инфекциозности хантавируса. В связи с тем, что не все штамм хантавируса образуют под агарозным покрытием отчетливые бляшки, а также необходимость использования определенного типа агарозы более широкое распространение получил метод, предложенный P. W. Lee et al. (1985). В основе данного метода лежит выявление фокусов инфицированных клеток при окрашивании комплекса антиген+антитело, меченного пероксидазой хрена, 3,3диаминобензидином (ДАБ) в присутствии перекиси водорода. Вместо агарозного покрытия используется карбоксиметилцеллюлоза. Титр вируса выражаюв lg фокусобразующих единица на 1 мл (ФОЕ/1,0 ml).

Метод флюоресцирующих антител впервые был применен H.W. Lee et al. (1978) при исследовании криостатных срезов органов полевых мышей для обнаружения у них возбудителя ГЛПС. В дальнейшем криостатные срезы органов серопозитивных грызунов авторы использовали как антиген для серологической диагностики ГЛПС.(Диссертация: Вирусо-эпизотологическое обоснование воздушно – пылевого пути заражения хантавирусом/ Иунихина О.В. 2010.)

3.2.2 Непрямой метод флюоресцирующих антител Для установления наличия вируса в культуре клеток также применяется непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА). Впервые он был применен H.W. Lee et al. (1978) при исследовании криостатных срезов органов полевых мышей для обнаружения у них возбудителя ГЛПС. В дальнейшем криостатные срезы органов серопозитивных грызунов авторы использовали как антиген для серологической диагностики ГЛПС.

После выделения хантавируса на культуре клеток Vero E6 из них готовят культуральные «слайды», представляющие собой взвесь в физиологическом растворе инфированных хантавирусом клеток Vero E6 в концентрации 350000 - 400000 в 1 мл, нанесенную каплями в объеме 5 мкл на 24 – луночные предметные стекла. После высушивания в течение 18 часов на воздухе при комнатной температуре, препараты фиксируются 20 минут холодным ацетоном. В качестве специфических антител используется сыворотка серологически подтвержденного больного ГЛПС в высоком титре. После 60 мин. контакта при +37°С, и удалении не связавшихся антител физиологическим раствором. При взаимодействии получившегося комплекса антиген-антитело с антивидовыми антителами человека, меченными ФИТЦ (флюоресцинизотиоционатом) при использовании люминесцентной микроскопии наблюдаются яркосветящиеся структуры в виде изумрудно-зеленных гранул, локализованные в цитоплазме клеток в аппарате Гольджи. (Воробьев А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2006).

3.3 Методы определения антигена или РНК хантавирусов 3.3.1 Иммуноферментный анализ Иммуноферментный анализ (ИФА), в иностранной литературе обозначенный как enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), является одним из эффективных методов в лабораторной диагностике ГЛПС. Впервые группоспецифическая поликлональная система для обнаружения антигена хантавируса в органах грызунов - природных носителей хантавируса в ИФА, основанная на использовании специфического иммуноглобулина IgG в качестве покрытия твердофазных полимеров (96-луночные плоскодонные полиэстироловые планшеты) и для коньюгирования с ферментом пероксидаза хрена, с помощью которой выявляли комплекс антиген-антитело, при ГЛПС была предложена российскими исследователями (Gavrilovskaya I.N., et al., 1981; Tkachenko E.A. et al., 1981). На основании авторских разработок А.П. Иванов и соавт. (1990) ФГУП Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН производит коммерческий препарат “Иммуноферментная тест-система (Хантагност) - для выявления хантавирусного антигена” - для обследования мелких млекопитающих на присутствие хантавирусной инфекции, этой же системой возможно определить наличие антигена и в других образцах при его достаточном количестве. 3.3.2 Молекулярно-генетические методы

ПЦР – диагностика является самым современным, быстрым и точным методом исследования в микробиологии для выявления многих заболеваний. ПЦР - диагностика обнаруживает наличие инфекционных возбудителей в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Большая точность метода достигается за счет высокой специфичности ПЦР - диагностики, так как в исследуемом материале выявляется уникальный фрагмент ДНК или РНК, характерный только для данного возбудителя, что прямо говорит о его присутствии в организме.

ПЦР – диагностика состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, собственно полимеразной цепной реакции и детекции продукта ПЦР.

Выделение нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК) осуществляется несколькими способами:

1.очистка раствора с помощью методов органической экстракции (с помощью фенола, хлороформа) с последующим осаждением ДНК спиртами и растворением в воде и ТЕ-буфере;

2. дифференциальная сорбция ДНК на твердом носителе (чаще всего силикагели с повышенным отрицательным зарядом или модифицированной поверхностью), после нескольких стадий отмывки сорбента с локализованной на его поверхности ДНК органическими растворителями ДНК смывается водой или ТЕ-буфером.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В качестве исходной матрицы для ПЦР может использоваться кДНК, полученную с помощью предварительной обратной транскрипции РНК – ОТ-ПЦР. Эффективность ПЦР в значительной мере определяется источником и способом выделения нуклеиновых кислот, а ее специфичность и воспроизводимость - правильным выбором олигонуклеотидных праймеров.

Преимущества молекулярно-генетических методов в отношении диагностики (детекции, идентификации) хантавирусов приобретают особую значимость в связи с существующими трудностями при размножении этих вирусов в клеточных культурах и отсутствием удачной лабораторной модели инфекции. ПЦР является практически единственным методом, позволяющим дать прямое доказательство наличия хантавирусов в различных биологических материалах, полученных как от человека, так и от животных (Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., 2004). Беспрецедентным в вирусологии является выделение 9-ти самостоятельных видов хантавирусов - Bayou, Laguna Negra, Isla Vista, Rio Mamore и др., циркулирующих на Американском континенте, только на основании данных о нуклеотидных сиквенсах их геномов, без изоляции вирусной культуры (Plyusnin A., 2002).

Правильно выбранные пары праймеров, как считают L.B. Giebbel et al. (1990) и S.Y. Xiao et al. (1992), позволяют не только достаточно точно контролировать наличие хантавирусов, но и типировать их, используя в этих случаях информацию о последовательностях генома разных хантавирусов.

Puthavathana P. et al. (1992) сконструировали родоспецифический конструктивный регион S-сегмента вируса и 4 типоспецифических олигонуклеотидных праймера, созданные из уникальных последовательностей М-сегмента штаммов вирусов Hantaan, Seoul, Puumala, Prospect Hill, а также провели типирование штаммов хантавирусов, полученных из разных стран, и показали, что данные ПЦР-анализа согласуются с данными серологического типирования изолятов хантавируса в других реакциях.

С помощью создания консенсусных праймеров для детекции в ПЦР фрагментов S-сегмента генома хантавирусов С.Б. Гаранина и соавт. (2005) показали эффективность системы для обнаружения РНК вируса в пробах от грызунов – носителей хантавируса и высокий уровень (78%) выявления РНК у больных ГЛПС в ранние сроки заболевания.

В России было зарегистрировано два отечественных диагностических набора для ПЦР-диагностики производства ЗАО «Вектор-Бэст» «Векто-Ханта-РНК-ампли-100» (набор для выделения РНК «Вектор РНК-экстракция», для выявления РНК «ОТ-ПЦР Ханта - РНК-ампли», а также проведения гель-электрофореза с использованием набора реагентов «Векто-ДНК-ЭФ»), а также коммерческий набор «АмплиСенс Hantavirus» производство ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, в котором используются оба метода выделения РНК. К сожалению данные наборы не нашли широкого использования в лабораторной диагностике ГЛПС и выпускаются в ограниченном количестве. (Воробьев А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П., 2006).

Глава 4 Факторы, влияющие на сохранение вирусов в окружающей среде

В процессе возникновения инфекционного заболевания с участием инфекционного агента и восприимчивого организма немаловажную роль играет окружающая среда. Попадая в нее, возбудители инфекционных заболеваний могут сохраняться длительное время, а затем попадать в восприимчивый организм.

Все факторы, воздействующие на микроорганизмы вне организма природного хозяина, можно разделить на две большие группы: абиотические и биотические.

4.1 Абиотические факторы внешней среды

4.1.1Влияние температуры и высушивания на устойчивость вирусов

Температура является одним из наиболее важных факторов определяющим устойчивость и длительности выживание вирусов в окружающей среде. В первые часы температурного воздействия инактивируется подавляющее большинство вирусных частиц, обусловливающих свойства популяции в целом. После этого остаются вирусные частицы, обладающие повышенной резистентностью к температуре. Данное обстоятельство используется с целью селекции терморезистентных вирусных вариантов. Скорость и степень инактивации зависит, прежде всего, от биологических особенностей вирусов, от характера вируссодержащего материала и т. п.

Температура 50-60˚С убивает большинство вирусов в течение 30-60 минут. Наиболее устойчивы к температуре бактериофаги и вирусы растений. Вирус табачной мозаики погибает лишь при температуре 70˚С. устойчивость вирусов к температуре значительно повышается при сохранении в среде, обладающей способностью препятствовать денатурации белка (сахароза, яичный белок, молоко и др.). Низкие температуры не оказывают губительного воздействия на вирусы, поэтому для их хранения в лабораторных условиях применяются холодильники с диапазоном температур от +4˚ до -70-80˚С, а также сосуды Дюара с жидким азотом (-196˚С) Устойчивость вирусов к температурным и другим воздействиям значительно повышается при высушивании. Высушивание вирусов в условиях вакуума при температуре - 76˚С (лиофильная сушка) является наиболее эффективным методом их сохранения. 4.1.2 Влияние рН среды и содержание солей Губительное действие на вирусы оказывают все окисляющие вещества, в том числе атмосферный кислород, а особенно озон. На выживание вируса рН среды может оказывать как прямое, так и косвенное влияние. При прямом воздействии рН влияет на конформацию белков оболочек вириона (капсида суперкапсида), при косвенном - нарушаются адсорбционные и десорбционные механизмы. Наиболее благоприятна для вирусов нейтральная или слабощелочная реакция. При кислых или резко щелочных показателях рН вирусы очень быстро инактивируются. Вирус оспы разрушается при рН 5,0, вирус полиомиелита – при рН 3,0. Содержание солей может оказывать разное воздействие на вирусы. По проведенным экспериментам, исследователями было установлено, что инактивация вирусов увеличивается в солевом растворе. Однако некоторые двухвалентные катионы оказывают стабилизирующее влияние на оболочечные вирусы. Например 2 М буферный раствор MgCl₂ оказывает защитное действие в отношении вируса полиомиелита от инактивации при температуре выше 40˚С. Для риновирусов данный эффект был не слишком выражен. Некоторые исследователи отрицают существенное влияние солености на выживание вирусов. 4.1.3 Ультрафиолетовое и ионизирующее излучение Альфа частицы, так же как и ультрафиолетовый свет, губительно действуют на вирусы. Вместе с тем они оказались очень устойчивыми к действию рентгеновских лучей. Только большие дозы, от 1,5 до 2 млн. рентгенов инактивируют вирусы. Механизм действия лучистой энергии изучен еще недостаточно. Предполагается, что ультрафиолетовый свет (длина волны 2650 А) и альфа лучи действуют непосредственно на нуклеиновую кислоту вируса. При действии ионизирующей радиации на вирусы наблюдается их инактивация, скорость которой зависит от некоторых условий среды. Различные добавления к среде химических веществ либо защищают от инактивации (желатина, пептон и другие вещества), либо способствуют ей (фосфаты). Мелкие вирусы инактивируются при однократном облучении. Крупные могут переносить несколько доз ионизации, как болеесложные системы. Действие ионизирующего излучения на вирусы определяется только дозой и не зависит от температуры или от времени облучения. Некоторые вирусы инактивируются при очень высоких дозах. Вирусы, патогенные для животных, - при облучении 44 000-280 000 р; некоторые фитопатогенные вирусы - при дозах 430 000-940 000 р; бактериофаги - 40 000-99 000 р. (SobseyM. D., Meschke J. S., 2003). 4.1.4 Ассоциации вирусов с субстратами Вирус вне организма хозяина часто встречается в окружающей среде в комплексе с различными субстратами. В этом основную роль играет возможность адсорбции вируса на таких компонентах, как природные минералы, глины, растительные остатки и др. Так в сточных водах вирусы в ассоциации с различными частицами встречаются в 16-100%. Несколько типов сил могут играть определенную роль в вирусной адсорбции, включая ионные, ковалентные реакции с некоторыми химическими веществами, водородные связи, гидрофобные взаимодействия, силы Ван дер Ваальса.В теории адсорбции вируса предполагает, что наиболее важным из этих сил взаимодействия двойного слоя и Ван дер Ваальса сил. Состояние адсорбции в значительной степени влияет на выживание вирусов во внешней среде. Было показано, что адсорбция частиц активного ила увеличение сохранением полиовируса инфекционность в течение 28 дней, а также обеспечить защитный эффект против повышенных температурах. В растворах с частицами почвы Reovirus сохраняется лучше, чем без почвы (Sobsey M.D., 1980) . Агрегация или слипания вирусов между собой также может влиять на скорость инактивации химическими веществами. Показано, что полиовирусы внутри агрегата защищены от воздействия брома (Young J.C.,1980). Содержание органических веществ увеличивает сроки выживания вирусов во внешней среде. Было показано длительное выживание полиовирусов, адсорбированных на частицах активного ила, после 1 часа инкубации при 55 ºC, до 60% связанных вирионов сохранили инфекционность, а и 99,4% несвязанных вирионов при тех же условиях инактивировались.Вирус гепатита А было оказался более стойким в минеральной воде в присутствии белка (Biziagos E., 1988). 4.2 Биотические факторы внешней среды 4.2.1 Тип и состав вирусов Вирусы разнообразны по размерам, формам и по своему внутреннему сстроению. Вирусы состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) окруженной белковой оболочкой, и в зависимости от типа вируса могут иметь липопротеиновый суперкапсид. Для безоболочечных вирусов, капсид является внешним слоем который отвечает за прикрепление вируса к клеткам и находится в контакте с окружающей средой. Для оболочечных вирусов вируспецифические гликопротеины в оболочке ответственны за прикрепление вируса к клетке хозяина. Для тех и других вирусов характерно сложное строение. Поверхность можно рассматривать как мозаику из гидрофильных и гидрофобных областей с отрицательно и положительно заряженными функциональными группами, способными взаимодействовать с растворителями (вода) и другими веществами. По форме вирусы могут быть изометрическими - вирусы, капсид которых построен по кубическому типу симметрии и имеют форму многогранников, чаще икосаэдра. Наименее устойчивыми являются вирусы, имеющие липопротеидный суперкапсид, наиболее устойчивые – изометрические вирусы. Так, например, ортомиксовирусы и парамиксовирусы инактивируются на поверхностях в течение нескольких часов, тогда как вирусы полиомиелита, аденовирусы, реовирусы сохраняют инфекционную активность в течение нескольких дней. Однако из этого общего правила имеются и исключения. Так, вирус оспы устойчив к высыханию и сохраняется в экскретах в течение многих недель и месяцев. Вирус гепатита В устойчив к действию неблагоприятных внешних факторов и сохраняет свою активность в сыворотке даже при кратковременном кипячении. 4.2.2 Микробный антагонизм

Одной из форм взаимоотношений между микроорганизмами в ассоциациях является микробный антагонизм – угнетение роста одного микроба другим. При изучении сохранения вирусов в окружающей среде многие исследователи изучают влияние микробных метаболитов на устойчивость вирусов. Вирусы менее устойчивы в природных условиях и на объектах окружающей среды, где наблюдается скопление различных микроорганизмов, чем в условиях приближенных к стерильным. Считается, что бактерии и другие микроорганизмы (амебы, коловратки, грибы и аэробные бактерии) играют важную роль в вирусной инактивации, либо посредством метаболитов, которые отрицательно влияют на вирусные частицы, или путем прямого использования вириона в качестве источника питательных веществ. (SobseyM. D., Meschke J. S., 2003).

Глава 5 Изучение адсорбции хантавируса на субстратах внешней среды Для хантавирусов, в настоящее время, общепризнан воздушно-пылевой механизм заражения. Данное заключение было основано на экспериментальных и природных наблюдениях за грызунами, выделяющими хантавирус во внешнюю среду с экскретами (фекалиями, мочой и слюной) на фоне хронической персистентной инфекции. Но для обоснования представления о воздушно-пылевом механизме заражения, необходимо обладать сведениями о том как вирус адсорбируется на пылевых частицах и сохраняется во внешней среде. 5.1 Адсорбция хантавируса на частицах цеолита и бентонита в зависимости от их размера и температуры

Наиболее хорошо изученными природными сорбентами, входящими в состав почв, донных отложений и т.д. являются цеолиты и различного рода глины (например, бентониты и каолин). Адсорбционные свойства цеолитов основаны на наличии разного размера окон каналов (от 0,3 до 1 нм), которые определяют внутреннее строение и могут избирательно адсорбировать молекулы в соответствии с их размерами и формой. Сорбционная способность цеолитовых минералов зависит, в том числе и от размера фракций. С уменьшением размера фракций увеличивается общая поверхность активных центров.

Большинство глинистых минералов имеют pH близкую к нейтральной и отрицательный заряд поверхности, следовательно, адсорбируют разного рода биомолекулы, в том числе вирусы, обладающие положительным зарядом.

По данным Иунихиной О.В. 2010 г. при использовании фракций цеолита разных размеров (1,5; 0,1; 0,05 мм) в условиях комнатной температуры +22°С все фракции цеолита адсорбируют хантавирус из культуральной вируссодержащей жидкости. Наиболее эффективная адсорбция наблюдается при использовании частиц цеолита размером 0,05 мм. Через 1 ч контакта в стабильных условиях вируса с цеолитом в надосадочной жидкости вирус не определяется. При использовании фракции цеолита с размером частиц 0,1 мм, вирус полностью адсорбируется в течение 3 часов. При использовании более крупных частиц цеолита (1,5 мм) титр вируса за три часа контакта снижается по сравнению с исходным на 1,3 lg. (рис.3)

Рис. 3 Адсорбция хантавируса на частицах цеолита и бентонита разных размеров частиц при +22°С.

При +4°С, в условиях бытового холодильника, (рис.4) также показана большая адсорбционная эффективность мелкой фракции цеолита. Вирус в надосадочной жидкости при взаимодействии с этой фракцией не выявляется при титровании через сутки, в то время как на частицах размером 1,5 мм его полная адсорбция наблюдается через 72 часа.

Рис. 4 Адсорбция хантавируса на частицах цеолита и бентонита разных размеров частиц при +4°С.

Полная адсорбция хантавируса при +22°С наблюдается через час контакта, а при +4°С – через сутки.

При анализе полученных данных исследователями было доказано, что хантавирус способен адсорбироваться из вируссодержащей культуральной жидкости на минеральных частицах, таких как цеолит и бентонит, обладающих адсорбционными свойствами. Эффективность адсорбции хантавируса в одинаковых условиях эксперимента: температура окружающей среды, масса адсорбента и объем вируссодержащей культуральной жидкости с известным титром зависит от размера частиц адсорбента. Мелкие частицы цеолита и бентонита, используемые в опытах, по размеру приближенные к пылевым (пылевые частицы имеют диаметр от 0,005 мм до 0,1 мм), способны наиболее полно адсорбировать хантавирус за короткий промежуток времени, поскольку активная площадь поверхности мелких частиц намного больше, чем у более крупных частиц сорбента. (Иунихина О.В. 2010).

5.2Адсорбция хантавирусов на почве разных видов и других

органических субстратах

Для выявления способности хантавируса адсорбироваться на почве и других органических субстратах были взяты образцы почв из разных районов Приморского края: лесная из Уссурийского и Красноармейского и садово-огородная из Пограничного. Также были использованы образцы соевой соломы. По литературным данным земля из лесной зоны Приморского края является типичной бурой лесной, содержит 4-6% гумуса, нетоксична, с нейтральной pH в верхних ее слоях.Почва с сельскохозяйственных полей (садово-огородная), где выращивались соевые культуры, характеризуется слабокислой pH 6,5-7,0 и является оптимальной для данного вида растений. (Иунихина О.В., Компанец Г.Г., Слонова Р.А.,2007).

В ходе экспериментов было установлено, что образцы почвы, взятые в лесу, а также соевой соломы полностью адсорбируют вирус из вируссодержащей культуральной жидкости через 24 часа при +4˚С (рис. 5). На образце почвы с сельскохозяйственного поля при тех же условиях адсорбируется не более 20% исходного титра вируса. Не исключено, что разный состав (в том числе обеднение минерального состава, в связи с внесением органических удобрений) и уровень pH лесных почв и почв, используемых для сельскохозяйственных нужд, влияет на их адсорбционные свойства.( Иунихина О.В. 2010).

Рис. 5 Адсорбция хантавируса на почве и органических субстратах при +4°С.

Глава 6 Сохранение хантавируса во внешней среде

6.1 Влияние абиотических факторов на сохранение хантавируса вне организма хозяина

Несмотря на то, что аэрогенный механизм заражения хантавирусами давно является общепризнанным, в литературе сравнительно мало данных по влиянию различных факторов на сохранение их в окружающей среде.

6.1.1 Температура и влажность

Температурные условия и относительная влажность окружающей среды имеет значение для сохранения вирусов вне организма хозяина. Лучше всего вирусы сохраняются при пониженных температурах, а особенно при заморозке в виду отсутствия в их составе молекул воды, что и используется в лабораторных условиях.

Во влажных условиях наблюдается строгая корреляция между температурой и стабильностью: более высокая температура укорачивает выживание вирусов во внешней среде. Так, при +4˚С вирус Hantaanсохраняет свои инфекционные свойства в течении 96 дней (J. Hardestam et al. 2007), по данным Иунихиной О.В. за 7 дней при тех же условиях штамм Aa 60343 геноварианта Far East вируса Hantaan теряет не более 10 % от исходного титра вируса. При изучении стабильности хантавируса в адсорбированном состоянии установлено, что геновариант Far East сохраняется 7 суток при +4˚С, что подтверждалось выделением вируса на культуре клеток Vero E 6 на втором пассаже из элюата после десорбции белковым раствором. Также при исследовании элюатов в ОТ-ПЦР было установлено наличие в них специфической РНК на цеолите (фракция 0,05 мм) и лесной почве до 7 дня при +4°С (Иунихина О.В. 2010).

Повышение температуры до комнатной (20-23˚С) сокращает срок выживания вирусов Hantaan, Puumala и Tula до 9 и 5 дней соответственно (Hardestam J., et al., 2007; Kallio E., et al., 2006). По данным Sauvage et al., 2003, основанном на математическом моделировании вирус Puumala способен сохраняться вне организма природного хозяина в течение 1 недели, что коррелирует с экспериментальными исследованиями других авторов.

В опытах на колонизированных рыжик полевках – природных носителей вируса Puumala установлены сроки сохранения вируса, выделяемого грызунами с экскретами, при 20˚С и 40-60% относительной влажности и 16 часах освещения в сутки. Установлено, что вирус в подстилке сохраняется 12-15 дней, что подтверждалось подсадкой в загрязнённые выделениями инфицированных полевок «чистых» грызунов и обнаружением специфической РНК в легких (Kallio E., et al., 2006). Увеличение сроков сохранения инфекционности вируса Puumala почти в 2 раза по сравнению с опытами in vitro (9 и 15 дней соответственно) скорее всего, говорит о защитном действии органических веществ, входящих в состав экскретов и адсорбции вируса древесными стружками подстилки.

Увеличение температуры окружающей среды до 56˚С инактивировало вирусы Puumala и Tula полностью за 15 минут, однако предварительное высушивание образцов при 20˚С в течение 15 минут увеличивало срок выживания вирусов до 1-2 часов (Kallio E., et al., 2006). При высушивании вирусной суспензии на стерильных алюминиевых дисках при 20°C через 90 минут обнаруживалось 6-14% от исходной концентрации инфекционных частиц вируса Hantaan, через сутки они полностью инактивировались (Hardestam J., et al., 2007).

Изучении неинфекционных вирусных частиц, полученных при длительном инкубировании при 37°C с помощью электронной микроскопии показало наличие агрегатов, состоящих из нескольких десятков вирионов, внутренняя оболочка которых была менее плотной по сравнению с инфекционными вирионами, что по видимому можно объяснить денатурирующим действием температуры на капсид, состоящий из белковых молекул (Hardestam J., et al., 2007).

Некоторое различие в сроках выживания можно объяснить разными серо/генотипами хантавирусов, использованных для эксперимента, их исходными титрами и методикой проведения опытов. (Иунихина О.В. 2010.)

6.2 Обнаружение субвирионных компонентов хантавируса в очагах инфекции на субстратах внешней среды

Впервые субвирионные компоненты хантавируса (специфическая РНК) вне организма природного хозяина – мышевидного грызуна в естественных условиях в природных очагах инфекции были обнаружены Кушнаревой Т.В. и соавт. (2010). Известно, что основным путем заражения ГЛПС является аэрогенный, такой же путь передачи возможен и при тесном контакте между грызунами, например в условиях нор. Материалов для исследования послужили образцы субстратов из внешней среды: 25 проб сена и соломы со скошенных полей и лугов, 24 пробы почвы и 34 пробы почвы с растительной подстилкой из естественных убежищ, прикорневых пустот и прилегающих к ним территорий. Пробы воздуха (34) с пылевыми частицами из сельских надворных построек отбирали в 10 мл культуральной жидкости в течение 10 мин с помощью аспиратора для забора воздуха (модель 822 отечественного производства) со скоростью просасывания воздуха 20 л в мин.

При полимеразной цепной реакции с образцами тотальной РНК, экстрагированной из проб субстратов внешней среды, РНК хантавируса была выявлена в пробах почвы, содержавших мелкие остатки хвойно-лиственной подстилки. РНК-положительные пробы были взяты в октябре и начале июня недалеко от естественных убежищ грызунов в смешанном кедрово-широколиственном лесу с хорошо выраженным подлеском и нижним ярусом на территории Кавалеровского и Ольгинского районов Приморского края. Во время забора образцов почвенная подстилка была влажной, температура воздуха в октябре ночью опускалась до –2–0 °С, а днем не поднималась выше 6–8 °С, в начале июня ночные температуры составляли 2–4 °С, а дневные – 8–10 °С. Необходимо отметить, что РНК-положительные пробы почвенной подстилки были взяты на ловушко-линиях с высокой относительной численностью инфицированных восточноазиатских мышей (5,2 особи на 100 л/н, из которых 66,7±7,8 % имели антиген к РНК хантавируса в органах секрециии экскреции). Высокая относительная численность инфицированных восточноазиатских мышей отмечена в хвойно-широколиственном лесу (5,2 особи на 100 л/н), при этом она была в 3,7 раза выше, чем в дубовошироколиственном лесу (1,4 особи на 100 л/н). В то же время в этих типах природных ландшафтов относительная численность A. peninsulae была примерно одинаковой и составила 14,2 и 13,8 особи на 100 л/н (в хвойно-широколиственном и дубовошироколиственном лесу соответственно). Наиболее низкие показатели относительной численности и инфицированности восточноазиатских мышей были получены в мелколиственно-широколиственном лесу: 4,3 и 1,1 особи на 100 л/н соответственно.

Подтверждением присутствия хантавирусов во внешней среде энзоотичных территорий в период забора проб субстратов могут служить результаты обнаружения хантавирусного антигена и РНК хантавируса в органах выделения у инфицированных восточноазиатских мышей.

Пробы воздуха с пылевыми частицами были отобраны в мае 2006 г. в надворных постройках (коровнике, свинарнике, амбаре, погребе и т.д.) нескольких сел Спасского района. В этих населенных пунктах, расположенных недалеко от культивируемых полей и границы с хвойно-широколиственным лесом, регистрировались случаи заражения людей ГЛПС и отлавливались инфицированные хантавирусом мыши рода Apodemus. При исследовании методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией образцов общей РНК, экстрагированной из проб воздуха с пылевыми частицами, хантавирусная РНК была обнаружена в пробах, взятых в отдельно стоящих строениях-погребах и помещении для содержания домашнего скота

Способность вирусов, носимых грызунами, сохранять инфекционные свойства вне организма хозяина имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение. Выявление субвирионных компонентов хантавируса вне организма мышевидных грызунов – носителей вируса служит доказательством присутствия хантавируса во внешней среде очаговых территорий.

Обнаружение РНК хантавируса в пробах почвы с хвойно-лиственной подстилкой, взятых в кедрово-широколиственном лесу, где в это время была отмечена самая высокая численность инфицированных восточноазиатских мышей, может свидетельствовать о выделении вируса из организма хозяина и его непрямой трансмиссии через субстраты внешней среды в популяции A. peninsulae. Подтверждением эпидемиологических данных о воздушно-пылевом пути заражения людей ГЛПС служат находки РНК хантавируса в пробах воздуха с пылевыми частицами, взятых в надворных постройках сельских населенных пунктов, расположенных на энзоотичных территориях.

Вопрос о длительности сохранения инфекционных свойств хантавирусов, выделенных инфицированными животными во внешнюю среду, пока остается открытым. Учитывая, что в местах отбора РНК-положительных проб отмечены благоприятные условия внешней среды (высокая влажность хвойно-лиственной подстилки, низкая и стабильная температура воздуха и слабая солнечная радиация под нижним растительным ярусом в кедрово-широколиственном лесу), можно сделать предположение о сохранении хантавируса вне организма хозяина в течение определенного периода, продолжительность которого предстоит изучить в дальнейшем. Относительно стабильная влажность и без резких колебаний прохладная температура воздуха, а также слабая освещенность помещений, где в пробах воздуха с пылевыми частицами обнаружена РНК хантавируса, могут являться благоприятными факторами для сохранения возбудителя и заражения людей в надворных постройках.

Полученные данные создают основу для изучения экологии вирусов, а также естественного способа передачи возбудителей нетрансмиссивных зоонозов в популяциях их резервуарных хозяев и к людям. Характеристика биотических и абиотических факторов, ассоциированных с присутствием РНК хантавируса на субстратах внешней среды, может быть использована для оценки потенциальной эпидемической опасности на конкретных энзоотичных территориях. Детекция РНК хантавируса вне организма природного хозяина может внести научно обоснованную корректировкув перечень рекомендованных противоэпидемических мероприятий, и в первую очередь при наличии концентрации инфицированных животных, включая, помимо их отлова, обработку объектов внешней среды в помещениях закрытого типа. (Иунихина О.В. 2010.)

Выводы

1. Хантавирусы являются сравнительно недавно открытой группой вирусов.

2. Хантавирусная инфекция в форме ГЛПС является одной из самых распространенных природно-очаговых заболеваний на территории РФ.

3. Благодаря современным методам исследования, выделяются новые хантавирусы.

4. Естественным резервуаром хантавирусов, имеющим эпидемиологическое значение являются различные мышевидные грызуны;

5. Для выделения хантавирусов в настоящее время широко используется перевиваемая культура клеток Vero E6;

6. В экспериментальных исследованиях получены прямые доказательства способности хантавируса адсорбироваться на почвообразующих компонентах и зависимости активности адсорбции от величины частиц и температурных условий. Эффективная адсорбция хантавируса отмечалась при температуре +4º на почве из леса, мелких частицах (0,05 мм) цеолита и бентонита и соломе.

7. Наиболее важными и сравнительно хорошо изученными абиотическим факторами, влияющими на сохранение хантавирусов в окуружающей среде являются температура и влажность.

8. Выявление субвирионных компонентов хантавируса вне организма мышевидных грызунов – носителей вируса служит доказательством присутствия хантавируса во внешней среде очаговых территорий и возможностью аэрогенного механизма заражения. Однако больший интерес вызывает возможность выделения инфекционного вируса из субстратов окружающей среды и изучение механизмов сохранения стабильности хантавируса вне организма хозяина.

Список литературы

1.Башкирев Т.А. К клико-эпидемиологической характеристике лихорадки с почечным синдромом // Инфекции с природной очаговостью и заболевания вирусной этиологии. Тр. Казанского института эпидемиологии и гигиены. - 1959. – вып. 4. – С. 64-74.

2. Верховцев В.Н., Спиридонов А.П. Заболеваемость геморрагической лихорадкой с почечным синдромом и меры профилактики // Природноочаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика и тактика защиты населения.- Омск. - 1998. – С. 105-106.

3. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом / Хунафина Д.Х. [и др.] //Материалы Межд. евро-азиат. конгресса по инф. болезням. – Витебск, 2008. - Т. 1. - С. 69.

4. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом/ Слонова Р.А., Ткаченко Е.А., Иванис В.А., Компанец Г.Г., Дзагурова Т.К. 2006г.)

5. Иунихина О.В. Вирусо-эпизотологическое обоснование воздушно – пылевого пути заражения хантавирусом: автореф. дис. канд. мед. наук Владивосток - 2010.

6. Компанец Г.Г. Распространение вируса Сеул на юге Дальнего Востока России и его роль в инфекционной патологии: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Владивосток, 2002. - 24 с.

7. Кулагин С.М., Федорова Н., Кетиладзе Е. Лабораторная вспышка геморрагической лихорадки с почечным синдромом (клинико-эпидемиологические характеристики) //Журн. микробиол. эпидемиол. – 1962. - № 10. – С. 121-126.

8. Кушнарева Т.В., Слонова Р.А. Роль прямого пути передачи хантавирусов – возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом среди мышей рода Apodemus // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2008. - № 2. – С. 57-61.

9. К характеристике геморрагической лихорадки с почечным синдромом в Среднем Поволжье и Предуралье / Н.И. Хатько [и др.] // Природноочаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения.- Омск, 1998. – С. 97-98.

10. Медицинская и санитарная микробиология: учебное пособие для студ. высш. мед. учеб. заведений/ А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин, В.П. Широбоков,-2-е изд., стер.- М.: Издательский центр «Академика» 2006. Стр. 259-279.

11. Нафееф А.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом у детей, проживающих в Ульяновской области // Педиатрия. - 2006. - № 4. – С. 107-108.

12. Нафеев А.А. Современные особенности эпидемических проявлений природно-очаговых инфекций (геморрагической лихорадки с почечным синдромом, лептоспирозов, иксодовых клещевых боррелиозов, туляремии) и оптимизация эпидемиологического надзора за ними (на модели Ульяновской области): автореферат дис. … д-ра мед. наук. СПб., 2007. – 38 с.

13. Распространенность хантавирусов в окружающей среде (электронный ресурс) режим доступа http://elibrary.ru/item.asp?id=15242416

14. Слонова Р.А., Компанец Г.Г., Образцов Ю.Г.Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом среди контингента военнослужащих в Приморском крае // Военно-медиц. журнал. – 2005. - № 9. – С. 20-25.

15. Сравнительный анализ эпидемических вспышек геморрагической лихорадки с почечным синдромом, вызванных вирусами Пуумала и Добрава/Белград / Е.А. Ткаченко [и др.] // Эпидемиол. вакцинопрофил. - 2005. - №4 (23) – С. 28-34.

16. Хасанова Г. М. Особенности заболеваемости, течения, осложнений и исходов геморрагической лихорадки с почечным синдромом в крупном промышленном городе // Вестник Башкирского университета. - 2007. - Т.12. - №4. – С. 45-47.

17. Хантавирус - (электронный ресурс) режим доступа: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Hantavirus.

18. хантавирусные инфекции – (электронный ресурс) режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.

19. хантавирус- (электронный ресурс) режим доступа: http://www.eurolab.ua/dictionary.

20. Хунафина Д.Х., Галиева А.Т., Бурганова А.Н., Шамсиева А.М., Кутуев О.И. //Материалы Межд. евро-азиат. конгресса по инф. болезням. Том 1. 2008. С. 69

21. Якименко В.В., Деконенко А.Е., Дзагурова Т.К. и соавт. О распространении хантавирусов в Западной Сибири // Мед. паразитология и паразитарные болезни. – 2000. - № 3.- С.21-28.

22. Якименко В.В. Экологические предпосылки гетерогенности популяций хантавируса и вирусов комплекса клещевого энцефалита в Западной Сибири: автореф. дис. ... д -ра биол. наук. - Москва, 2004. – 42 с.

23. A case–control study after a hantavirus infection outbreak in the South of Belgium: who is at risk? / F. Van Loock [et al] // Clin. Infect. Dis. – 1999. – Vol. 28. – P. 834–839.

24. A survey of rodent-borne pathogens carried by wild-caught Norway rats: a potential threat to laboratory rodent colonies / J.D. Easterbrook [et al] // Lab. Amin. – 2008. – Vol 42. – P. 92-98.

25. A study of nephropathia epidemica among military personnel in Sweden / B. Niklasson [et al] // Res. Virol. 1992. – Vol. 143, issue 3. – P. 211-214.

26. An unusual hantavirus outbreak in southern Argentina: person-to-person transmission? / R.M. Wells [et al] // Emerg. Infect. Dis. – 1997. – Vol. 3. – P. 171–174.

27. Botten J., Mirowsky K., Ye C., Gottlieb K., Saavedra M., Ponce L., et al. Shedding and intracage transmission of Sin Nombre hantavirus in the deer mouse (Peromyscus maniculatus) model // J. Virol. – 2002. – Vol. 76. – P. 7587–7594.

28. Clement J.P. Hantavirus // Antiviral. Res. – 2003. – Vol. 57, № 1-2. – P. 121-127

29. Desmyter J., LeDuc J. W., Johnson K.M., Brasseur F., , Deckers C., van Ypersele de Strihou C.Laboratory rat associated outbreak of haemorrhagic fever with renal syndrome due to Hantaan-like virus in Belgium // Lancet. – 1983. – Vol. 2. – P. 1445-1448.

30. Delfraro A., Tome L., Elia G.D., Glara M., Rego N., Achaval F., Arbiza J. Hantavirus reservoir hosts and genotypies circulating in Uruguay // The 7th International Conference on HFRS, HPS and Hantaviruses, Buenos Aires, Argentina. - June 13-15, 2007. - Abstract book. – P. 118.

31. Fulhorst C.F., Milazzo M.L., Duno G., Salas R.A. Experimental infection of the Sigmodon Alstoni with Cano Delgadito virus, a south American hantavirus // Am. J. Trop. Med. Hyg. – 2002. – Vol. 67, issue 1. – P. 107-111.

32. HFRS after a wild rodent bite in the Haute-Savoieand risk of exposure to Hantaan-like virus in a Paris laboratory / E. Dournon [et al] // Lancet. – 1984. – Vol. 323. – P. 676-677.

33. HFRS after a wild rodent bite in the Haute-Savoieand risk of exposure to Hantaan-like virus in a Paris laboratory / E. Dournon [et al] // Lancet. – 1984. – Vol. 323. – P. 676-677.

34. Houck M. A., Qin H., Roberts H. R. Hantavirus transmission: Potential role of ectoparasites// Vec. Born. Zoo Dis. – 2001. – Vol. 1. – P. 75-79.

35. HFRS outbreak associated with laboratory rats in UK / G. Lloyd [et al] // Lancet. – 1984. – Vol. 1. – P. 1175–1176.

36. Hantavirus infections in The Netherlands: epidemiology and disease / J. Groen [et al] // Epidemiol. Infec. – 1995. – Vol. 114, issue 2. – P. 373-383.

37. Hantavirus infection – hemorrhagic fever in Balkans – potential nephrological hazards in the Kosovo war / J. Bugert [et al] // Nephrol. Dial Transplant. - 1999. – Vol. 14. – P. 1843-1844.

38. Hantavirus outbreak during military maneuvers in Germany / J.P. Clement [et al] // Lancet. - 1996. - P. 346-347.

39. Hantavirus pulmonary syndrome outbreak in Argentina: molecular evidence for person-to-person transmission of Andes virus / P.J. Padula [et al] // Virology. - 1998. – Vol. 241. – P. 323–330.

40. Hantavirus ANDV distribution in human lungs and salivary glands / M. Navarrete [et al] // In: Abstracts of the VII international conference on HFRS, HCPS and hantaviruses; 2007 Jun 13–15. Buenos Aires, Argentina, 2007. – P. 10.

41. Hantavirus RNA in saliva from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome / L. Pettersson [et al] // Emerg. Infect. Dis. – 2008. – Vol. 14, № 3.- P. 406-411.

42. Hardestam J., Lundkvist A., Klingston J. Sensivity of Andes hantavirus to antiviral effect of human saliva // Emerg. Infect. Dis. – 2009. – Vol. 15, № 7. – P. 1140-1142.

43. Intraspecefic transmission of Hantaan virus, etiologic agent of Korean hemorrhagic fever in rodent Apodemus agrarius / H.W. Lee [et al] // Amer. J. Trop. Med., Hyg. - 1981. - Vol. 30. - P. 1106-1112.

44. Korean haemorrhagic fever in staff in an animal laboratory / T. Umenai [et al] // Lancet. – 1979. – Vol. 1. - P. 1314–1316.

45. Lee H.W. Epidemiology and pathogenesis of hemorrhagic fever with renal syndrome. // In: Elliott RM, editor. The Bunyaviridae. New York: Plenum Press, 1996. – P. 253-67.

46. Lee H.W., Johnson K.M. Laboratory-acquired infections with Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever // J. Infect. Dis. – 1982. – Vol. 146. - P. 645–651.

47. Liu R.H., Chen H.X. The risk and prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome transmitted by laboratory rats // Chin. J. Vector. Bio Control. 1991. – Vol. 2. – P. 250–254.

48. Laboratory rat associated outbreak of haemorrhagic fever with renal syndrome due to Hantaan-like virus in Belgium / J. Desmyter [et al] // Lancet. – 1983. – Vol. 2. – P. 1445-1448.

49. Luo Z.Z., Liu Y.F. Isolation of epidemic hemorrhagic fever virus from the air of rearing experimental animal room // Proceedings of International symposium on Hemorrhagic Fever with renal syndrome. - Hubei (China), 1988. - P. 34.

50. Nichol S.T., Spiropoulou C.F., Morzunov S., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Feldmann H., et al. Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness // Science – 1993. – Vol. 262. – P. 914-917.

51. Nephropathia epidemica in metropolitan area, Germany [letter] / S.S. Essbauer [et al] // Emerg. Infect. Dis. - 2007. – Vol. 3, № 8. – P. 1271-1273.

52. Olsson G.E., Dalerum F., Hornfeldt B., Elgh F., Palo T.R., Juto P., Ahlm C. Human Hantavirus Infections, Sweden // Emerg. Infect. Dis. – 2003. - Vol. 9, No. 11. – P. 1395.

53. Prevalence of antibodies specific to Puumala virus among farmers in Sweden / C. Ahlm [et al] // Scand. J. Work Environ. Health. - 1998. - Vol. 24, issue 2. – P. 104-108.

54. Person-to-person transmission of Andes virus / V.P. Martinez [et al] // Emerg. Infect. Dis. – 2005. – Vol. 11. – P. 1848–1853.

55. Risk factors for human hantavirus infection: Franco-Belgian collaborative case-control study during 1995-1996 epidemic / N.S. Crowcroft [et al] // BMJ – 1999. – Vol. 318. – P. 1737-1738.

56. Risk factors for hantavirus infection in Germany, 2005 / Abu Sin M. [et al] // Emerg Infect Dis. - 2007. - Vol. 13. – P. 1364–1366.

57. Schmaljohn C., Hjelle B. Hantaviruses: a global disease problem // Emerging Infection Disease. - 1997. - Vol. 3, № 2. – P. 95-104.

58. Seoul virus and hantavirus disease, Shenyang, People’s Republic of China / Y.Z. Zhang [et al] // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 15, No. 2. - P. 200-2006.

59. Serological evidence of hantavirus infection in laboratory rats and personnel / T.W. Wong [et al] // Int. J. Epidemiol. – 1988. -Vol. 17. – P. 887–890.

60. Shi X., McCaughey C., Elliott R.M. Genetic characterisation of a Hantavirus isolated from a laboratory-acquired infection // J. Med. Virol. – 2003. Vol. 71. – P. 105–109.

61. Virus survival in the environment with special attention to survival al in sewage droplets and other environmental media of fecal or respiratory origin //M. D. Sobseyand J. S. Meschke 2003

62. Wu G. Leptotrombidium scutellare in transmission of epidemic hemorrhagic fever virus //La Chinese. - 1992. – Vol. 72, N 8.- P.481-483.

63. Wu G.H. Progress of epidemiological studies on hemorrhagic fever with renal syndrome in China // Chin. J. Epidemiol. – 2003. – Vol. 24. – P. 413-415.

64. Yashina, L. N., Patrushev, N. A., Ivanov, L. I., Slonova R. A., Mishin,V. P., Kompanez, G. G., Zdanovskaya, N. I., Kuzina, I. I., Safronov, P. F. et al. Genetic diversity of hantaviruses associated with hemorrhagic fever with renal syndrome in the far east of Russia // Virus. Res. – 2000. – Vol. 70. – P. 31–44.

 

Код для цитирования: Скопировать