VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Введение

Жизнь, как считает современная наука, зародилась в мировом океане. Многие морские продукты обладают уникальными целебными свойствами – и этот факт давно известен современному обществу. Самыми, пожалуй, известными, доступными и распространенными продуктами являются морские водоросли. За многие миллионы лет эволюции водоросли обрели уникальные признаки и свойства, которыми не обладает ни одно растение на суше. Современные ученые утверждают и тот факт, что водоросли превосходят все другие виды растений также и по содержанию активных веществ. Морские водоросли содержат огромный комплект биологически активных веществ: полиненасыщенные жирные кислоты, производные хлорофилла, полисахариды и т.д. У многих водорослей обнаружена противоопухолевая активность, антибактериальное и противовирусное действие.

В последние годы в современном обществе растет внимание к проблемам здоровья и долголетия. Это определяет все возрастающий спрос на продукты морского происхождения, в число которых входят морские водоросли, а также лечебно-профилактические препараты на основе водорослей. Бурые водоросли являются богатыми возобновляемым сырьем для получения ценных биологически активных полисахаридов − фукоиданов, ламинаранов и альгиновых кислот. Содержание йода, макро- и микроэлементов, маннита и свободных аминокислот в бурых водорослях выше, чем в наземных растениях. Практически неисчерпаемым источником бурых водорослей являются прибрежные воды морей Дальнего Востока России. К сожалению, в России в настоящее время этот биологический ресурс используется очень ограниченно, а его химический состав изучен недостаточно.

Широкое применение полисахаридов бурых водорослей, как терапевтических агентов, сдерживается проблемами получения продуктов со стандартными характеристиками, поскольку содержание и структура полисахаридов меняются в зависимости от вида, места произрастания, стадии развития водоросли, а методы их выделения и фракционирования недостаточно эффективны.

Несмотря на указанные выше ограничения, постоянно проводится исследование разнообразных характеристик соединений, получаемых из водорослей, оценка их противовоспалительных, противовирусных, противоопухолевых и других свойств.

Целью настоящей работы является изучение противовирусных свойств фукоиданов различного происхождения при моделировании хантавирусной инфекции in vivo.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующую задачу: изучить протективное действие полисахаридов морского происхождения на примере фукоидана на модели лабораторных животных.

1 Литературный обзор 1.1 Общие характеристики полисахаридов морского происхождения

Полисахариды – это высокомолекулярные продукты конденсации более 5 моносахаридов и их производных, связанных друг с другом О-гликозидными связями и образующие линейные или разветвленные цепи.

Разнообразие в строении полисахаридов может быть обусловлено не только характером моносахаридов и способом их соединения, но также тем, что гидроксильные и карбоксильные группы моносахаридов и их производных могут быть метилированы, этерифицированы органическими и неорганическими кислотами (например, серной кислотой – агар-агар); водороды карбоксильных групп замещены на ионы металлов (пектиновые вещества, камеди) [22].

Классификация полисахаридов

Полисахариды делят на два типа: гомополисахариды (гомополимеры) и гетерополисахариды (гетерополимеры), в зависимости от характера входящих в их состав моносахаридов и их производных [22].

Гомополисахариды построены из моносахаридных единиц (мономеров) одного типа (например, крахмал, клетчатка, из животных полисахаридов – гликоген, хитин), а гетерополисахариды – из остатков различных моносахаридов и их производных (например, гемицеллюлозы, инулин, пектиновые вещества, слизи и камеди) [23].

Также полисахариды можно классифицировать:

по кислотности:

· нейтральные;

· кислые

по характеру скелета:

· линейные;

· разветвленные

по происхождению:

· фитополисахариды (крахмал, инулин, камеди, слизи, пектиновые вещества, клетчатка);

· зоополисахариды (гликоген, хитин);

· полисахариды микроорганизмов.

В зависимости от функций полисахариды делятся на:

· каркасные (конструктивные) – клетчатка, хитин;

· энергетические (резервные, запасные) – крахмал, гликоген, инулин, слизи, альгиновые кислоты;

· защитные – слизи, камеди.

Молекулярная масса полисахаридов колеблется от нескольких тысяч до нескольких миллионов единиц. В составе полисахаридов обнаружено свыше 20 различных видов моносахаридов и их производных, наиболее часто встречаются: из гексоз – D-глюкоза, D-галактоза, L-фруктоза, D-манноза; из продуктов окисления моносахаридов – D-глюкуроновая, D-маннуроновая, D-галактуроновая, D-гулуроновая и другие кислоты; из дезоксисахаров – L-рамноза, D-фукоза; из пентоз – D-ксилоза, L-арабиноза и др.; из продуктов восстановления D-маннозы – спирт манит [23].

Физические свойства.

Полисахариды – аморфные вещества, не растворяются в спирте и неполярных растворителях; растворимость в воде варьирует: некоторые растворяются в воде с образованием коллоидных растворов (амилоза, слизи, пектовые кислоты, арабин), могут образовывать гели (пектины, альгиновые кислоты, агар-агар) или вообще не растворяться в воде (клетчатка, хитин) [10].

Химические свойства.

Полисахариды подвергаются ферментативному и кислотному гидролизу с образованием моно- или олигосахаридов, содержащих от 2 до 4 моносахаридных единиц. Каждая из групп полисахаридов обладает своими специфическими свойствами.

Далее рассмотрим наиболее известные и часто используемые полисахариды морского происхождения [10].

Альгиновая кислота и ее соли.

Эта подгруппа представляет собой полисахариды бурых морских водорослей родов Laminaria и Macrocystis (alga в переводе с латинского — водоросль), которые построены из остатков β-D-маннуроновой и α-L-гулуроновой кислот, находящихся в пиранозной форме и связанных в линейные цепи 1,4-гликозидными связями [1].

Применение альгинатов в пищевых продуктах основано на взаимодействии их водорастворимых солевых форм в присутствии ионов кальция, что приводит к модификации реологических свойств (повышению вязкости или образованию гелевой структуры). По своим технологическим функциям альгинаты являются загустителями, гелеобразователями и стабилизаторами. Альгинат кальция проявляет также функцию пеногасителя [12].

Одно из главных преимуществ альгинатов как гелеобразователей — их способность образовывать термостабильные гели, которые могут формироваться уже при комнатной температуре. Пищевые добавки этой подгруппы широко применяют в пищевой промышленности для изготовления мармелада, фруктовых желе, конфет и осветления соков. Пропиленгликольальгинат, не осаждающийся в кислых растворах, используется в качестве стабилизатора при производстве мороженого, концентратов апельсинового сока, приправы к салатам и сырам[4].

Агар-агар. Смесь полисахаридов агарозы и агаропектина. Агароза (содержание 50—80 %) — линейный полисахарид, построенный из строго чередующихся остатков β-D-галактопиранозы и 3,6-ангидро-α-L-галактопиранозы, связанных попеременно (1,4)-β и (1, 3)-α-связями [1].

Агар-агар (агар) получают из морских красных водорослей родов Gracilaria, Gelidium, Ahnfeltia, произрастающих в Белом море и Тихом океане. В зависимости от вида водорослей состав выделенных полисахаридов может изменяться. Агар-агар незначительно растворяется в холодной воде и набухает в ней. В горячей воде образует коллоидный раствор, который при охлаждении дает хороший прочный гель, обладающий стекловидным изломом. У агара-агара этот процесс осуществляется за счет образования двойных спиралей и их ассоциации независимо от содержания катионов, сахара или кислоты. Гелеобразующая способность агара-агара в 10 раз выше, чем у желатина. При нагревании в присутствии кислоты способность к гелеобразованию снижается. Гели стабильны при рН выше 4, 5 и термообратимы. Агар используют в производстве кондитерских изделий (желейный мармелад, пастила, зефир), мясных и рыбных студней, различных желе и пудингов, а также для осветления соков. В составе мороженого агар-агар предотвращает образование кристаллов льда [22].

Агаропектин – смесь кислых полисахаридов сложного строения, аналогичного агарозе, с рядом отличий: заменой части остатков 3,6-ангидро-α, L-галактозы остатками 6-сульфата-α, L-галактозы, наличием остатков серной кислоты, связанных эфирными связями с различными группами ОН, и др [1].

Каррагинаны. Объединяют семейство полисахаридов, содержащихся наряду с агаром и фурцеллераном в красных морских водорослях. По химической природе каррагинаны близки к агароидам и представляют собой неразветвленные сульфатированные гетерогликаны, молекулы которых построены из остатков производных D-галактопиранозы со строгим чередованием α-(1-3) и β-(1-4)-связей между ними, т. е. из повторяющихся дисахаридных звеньев, включающих остатки β-D-галактопиранозы и 3,6-ангидро-α-D-галактопиранозы. В зависимости от особенностей строения дисахаридных повторяющихся звеньев, различают три основных типа каррагинанов, для обозначения которых используют буквы греческого алфавита: -каппа, -йота и -ламбда [23].

Функциональные свойства каррагинанов в пищевых системах включают:

• водосвязываюшую способность;

• стабилизацию эмульсий и суспензий;

• регулирование текучих свойств;

• образование устойчивых гелей при комнатной температуре.

Хотя каррагинаны не являются поверхностно-активными веществами, они способны стабилизировать дисперсные системы типа эмульсий и суспензий благодаря их загущающим и тиксотропным свойствам, препятствующим разделению системы. Изменение текучих свойств жидкой дисперсной системы в присутствии каррагинанов приводит не только к ее стабилизации, но и к формированию определенной консистенции. Растворы гелеобразующих каррагинанов становятся твердыми и образуют гели при температуре ниже 49—55°С. Эти гели устойчивы при комнатной температуре, но могут быть вновь расплавлены при нагревании до температуры, превышающей температуру гелеобразования на 5—10°С. При охлаждении такого расплава вновь образуется гель [4, 10].

В настоящее времени многие исследования показали, что полисахариды из бурых водорослей являются активными регуляторами процессов метаболизма в организме. Они являются иммунокорректорами, действие которых основано на активации природных механизмов защиты от патогенных микроорганизмов, антибиотиками, химио- и радиотерапии [6, 9, 11, 14, 17].

1.2 Противовирусные свойства полисахаридов морского происхождения

Поиск эффективных противовирусных препаратов ведётся среди различных классов веществ. Наряду с синтетическими химиопрепаратами перспективными являются природные вещества различного происхождения. Но при кажущемся многообразии препаратов перечисленных групп для большинства вирусных инфекций, особенно, таких важных, как вирусные гепатиты, инфекции ЦНС, ВИЧ (СПИД), природно-очаговые, энтеровирусные инфекции, практически нет безопасных эффективных специфических препаратов.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению свойств препаратов, выделенных из разнообразных видов водорослей, так как морские водоросли содержат богатый выбор биологически активных веществ (БАВ): полиненасыщенные жирные кислоты омега-3 типа, производные хлорофилла, полисахариды, стерины, витамины, каротиноиды, макро- и микроэлементы, сульфатированные галактаны, фукоиданы, глюканы, пектины, альгиновая кислота, а также лигнины, являющиеся ценным источником пищевых волокон; фенольные соединения; ферменты.

Содержащиеся в морских водорослях БАВ обладают широким спектром антимикробной активности в отношении патогенных для человека вирусов, бактерий, простейших и грибов. В ряде исследований выявлено, что БАВ из морских водорослей (МВ) проявляют противовирусную активность в отношении вируса иммунодефицита человека. Так, активность вируса иммунодефицита in vitro подавляли экстракты из Dygenea simplex [20] и других MB, полисахариды и полифенолы, выделенные из бурой MB Fucus vesiculosus [13], сульфатированные полисахариды из красных MB Schizymenia pacifica [14], Nothogenia fastigiata [21] и морской микроводоросли Cochlodinium polykrikoides [17], кальция спирулан — сульфатированный полисахарид из MB Spirulina platensis [2], сесквитерпеновые гидрохиноны из красной MB вида Peyssonelia, циановорин Н — протеин из сине-зеленой водоросли Nostoc ellipsosporum.

Противовирусную активность в отношении вируса герпеса проявляли сульфатированные полисахариды из Cochlodinium polykrikoides [17], и Nothogenia fastigiata, кальция спирулан из Spirulina platensis [2], полисахариды красных MB: каррагинаны из Gigartina skottsbergii, сульфатированные ксилогалактаны и ксиломаннаны из Nothogenia fastigiata.

Противовирусное действие в отношении вируса гриппа обнаружено у кальция спирулана из Spirulina platensis [2], сульфатированных полисахаридов из Nothogenia fastigiata, полисахаридов из зеленой MB Uiva lactica.

Сульфатированные полисахариды из Nothogenia fastigiata ингибировали также активность цитомегаловируса и респираторного синцитиального вируса, из Cоchlodinium polykrikoides — вирусов парагриппа, кори, эпидемического паротита. Кальция спирулан из Spirulina platensis также проявлял противовирусное действие в отношении возбудителей цитомегалии, кори и эпидемического паротита [2]. Сульфатированные полисахариды из Schizymenia pacifica ингибировали активность вирусов, вызывающих миелолейкоз у птиц.

Субстанция, выделенная из водоросли хлореллы, стимулирует выработку интерферона. Эта субстанция известна под названием хлореллан, который относится к химической группе сильно разветвленных полисахаридов. Хлореллан увеличивает макрофагальную активность, действуя как иммуномодулятор. Известно много публикаций в научных трудах об иммуномодуляторной способности хлореллы. Впервые хлорелла описана в 1967 г. как очень эффективное средство против вирусов с липидной оболочкой. Антивирусное действие заключается в стимуляции выработки организмом Т и В лимфоцитов. Хлорелла обладает специфичным действием против цитамегаловируса и вируса Эпштейн-Бара [16].

Кроме препаратов, полученных из растительного сырья, есть препараты, которые выделены из гидробионтов, в частности из мидий. Мидия привлекательна не только уникальностью ряда соединений, но и возможностью ежегодного получения массового дешевого материала в качестве источника БАВ, поскольку технология ее культивирования освоена весьма успешно.

Среди БАВ, обнаруженных в мидии, наибольший интерес представляют иммуномодуляторы, которые являются соединениями полисахаридно-белковой природы. Эти вещества способствуют повышению иммунитета к различным инфекциям. Наиболее известным препаратом, принадлежащим к этой группе, является митилан, выделенный из мидии [11].

Показано действие митилана при экспериментальной гриппозной инфекции: при дозе 25 мкг/кг выживало 30–60% мышей (при стопроцентной смертности контрольной группы). По мнению ряда авторов митилан индуцирует синтез интерферона, подавляющего размножение вируса [11].

На основе полисахаридов ламинарии разработаны такие БАДы как, Дополан и Мариспан. Эти полисахариды активизируют фагоцитоз — первую ступень в иммунной защите организма. Клетки-фагоциты «захватывают» и «переваривают» различные микроорганизмы, вирусы, опухолевые клетки, кислородные радикалы и другое, являясь основными санитарами в организме. Стимуляция фагоцитоза обеспечивает антимикробную, противовирусную, противогрибковую и противоопухолевую защиту. Помимо стимуляции фагоцитоза, полисахариды:

1. Восстанавливают активность клеточных рецепторов и стимулируют продукцию иммуноглобулинов. Стимуляция секреторных иммуноглобулинов А обеспечивает защиту «входных ворот инфекции», препятствует приживлению возбудителей инфекции на слизистых оболочках;

2. Увеличивают концентрацию в крови количества естественных киллеров, обеспечивая устойчивость клетки к внутриклеточным паразитам;

3. Стимулируют выработку собственного интерферона, который препятствует синтезу в клетке чужеродной нуклеиновой кислоты;

4. Эффективны при дефиците противоопухолевой иммунной защиты и при аутоиммунных заболеваниях.

Мариспан в дополнение к указанным свойствам обладает высокой противовирусной активностью и дает пролонгированный гепариноподобный эффект. Клинические испытания Дополана и Мариспана проведены в течение 1993—1999 гг. С 2000 г. они применяются в качестве биологически активных добавок для иммунокоррекции. Изучено влияние полисахаридов на иммунные показатели в процессе лечения больных со злокачественными новообразованиями. Практически во всех наблюдаемых случаях было выявлено их благоприятное влияние на течение болезни.

Препарат Фуколам.

Фуколам – экспериментально обоснованное сочетание двух индивидуальных веществ – фукоидана и альгината натрия – из бурых водорослей. Это существенно отличает Фуколам от других БАДов, созданных на основе природных экстрактов.

Фуколам производят из бурых водорослей на опытном производстве института под контролем разработчиков биологически активной добавки. Высокоочищенные препараты фукоидана и альгината натрия из дальневосточных бурых водорослей могут также быть предложены в качестве коммерческих биохимических реактивов и как основа для создания новых БАДов.

Фуколам оказывает выраженное противовирусное действие, защищает стенки желудочно-кишечного тракта от повреждения различными агентами (в том числе бактериями), активизирует иммунную систему, снижает уровень холестерина и сахара в крови. Препарат не вызывает аллергических реакций и может быть рекомендован в качестве энтеросорбента. Фуколам может быть использован в качестве основы для лечебных и косметических мазей и гелей.

Полифенольный препарат из морской травы Zostera marinа, «Люромарин» обладает выраженными противовирусными свойствами в отношении вируса клещевого энцефалита [8].

1.3 Фукоиданы

Бурые водоросли - это многоклеточные растения; своим названием они обязаны присутствующему в них бурому пигменту фукоксантину. Из наиболее ценных и распространенных полисахаридов бурых водорослей заслуживает внимания альгиновая кислота, содержащаяся во всех крупных бурых водорослях в количестве до 40% от массы сухого вещества. Другие полисахариды бурых водорослей – фукоиданы, или фукансульфаты.

Присутствие фукоиданов в водорослях определяют обычно по наличию в гидролизатах L-фукозы – основного моносахарида в составе вышеназванных полисахаридов. В последнее время особое внимание исследователей обращено к сульфатированным полисахаридам водорослей в связи с их ярко выраженной антикоагулянтной активностью. Актуальность поиска таких соединений связана в первую очередь с профилактикой и лечением тромбоэмболий, вызванных осложнениями многих заболеваний и хирургическим вмешательством. Из литературы известно, что в результате фракционирования удалось получить препараты фукоидана, которые по антикоагулянтной активности не уступают или даже превосходят гепарин [19]. Это - полисахариды из бурых водорослей Sargassum linifolium, Dictyota dichotoma, Padina pavonia, Eisenia bicyclis и Laminaria religiosa.

Антикоагулянтный эффект фукоидана оценивался in vivo и in vitro. Наименее токсичными оказались полисахариды с низкой метахроматической и антикоагулянтной активностью [6]. Механизм антикоагулянтного действия фукоиданов реализуется посредством ингибирования активности факторов, "внутреннего" пути свертывания крови - XI, XII и VII, а не через антитромбин-III (AT-III), как это происходит в случае гепарина [6]. То есть, фукоиданы могут быть эффективны при антикоагулянтной терапии у больных с врожденным и приобретенным дефицитом AT-III [9].

Фукоиданы как природные полиэлектролиты обладают высокой степенью сродства с двухвалентными катионами тяжелых металлов. Различия в адсорбционных свойствах фукоиданов зависят от конкретного источника их получения. Установлено, что фукоидан, из бурой водоросли Ascophyllum nodosum, связывает двухвалентные катионы в следующей последовательности: Pb>Ba>Cd>Sr>Cu>Fe>Co>Zn>Mg>Mn>Cr>Ni>Hg>Ca [15].

Необходимо отметить очень низкое сродство фукоидана к ионам кальция, которые играют существенную роль в жизнедеятельности организмов. В экспериментах на животных сочетанное введение свинца и исследуемого фукоидана приводило к значительному снижению всасывания свинца и поступления его в организм. Биологическая активность фукоидана из Ascophyllum nodosum зависела от вязкости его растворов, а также от наличия и положения в полимерной молекуле функциональных групп [15].

Известно, что сульфатированные полисахариды морских водорослей угнетающе действуют на РНК- и ДНК-содержащие вирусы. В этом плане фукоиданы не являются исключением. Недавно установлено, что фукоиданы из бурых водорослей Macrocystis pyrifera и Fucus vesiculosus ингибируют цитопатическое действие вируса везикулярного стоматита. Исключительно важными являются результаты работ, указывающие на перспективность поиска сульфатированных полисахаридов, обладающих в условиях in vitro селективным ингибирующим действием на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Как и другие сульфатированные полисахариды, фукоиданы блокируют процесс узнавания и связывания между гликопротеином оболочки gpl20HIV и клеточным рецептором CD4 . Следует добавить, что анти-ВИЧ активность сульфатированных полисахаридов не коррелирует с их антикоагулянтными свойствами и, вероятнее всего, эти два эффекта взаимонезависимы. Обнадеживающие данные получены японскими исследователями, установившими синергизм анти-ВИЧ эффекта in vitro при сочетанном применении фукоидана с азидотимидином. Для клинического применения были рассчитаны дозы, а именно, 0,1 мкг/мл фукоидана и 0,014 мкг/мл азидотимидина. Создание такой концентрации препаратов в сыворотке крови больных ВИЧ вполне достижимо. Считают, что использование фукоидана в комбинации с азидотимидином значительно снизит побочные эффекты, возникающие в ходе лечения больных [18].

Воздействие на раковые клетки фукоиданом привело к самоуничтожению опухолевых клеток, причем окружающие здоровые клетки повреждены не были. Результат, проявившийся через 72 часа воздействия фукоидана, превосходил тот результат, который дала серия сеансов химиотерапии, только без побочных эффектов [14].

Множество клинических исследований показали, что фукоидан не только эффективен при различных формах рака, но и восстанавливает функции организма у пациентов, которые прошли курс интенсивной химио и лучевой терапии. Процесс восстановления у этих пациентов протекает значительно быстрее, при этом улучшается как общее состояние организма, так восстанавливается функция печени. Действие фукоиданауже доказано рядом исследований на человеке. Лечение этим полисахаридом дало впечатляющие результаты. Оно оказалось эффективным при многих, в том числе, онкологических заболеваниях [14].

2 Материалы и методы

Штамм хантавируса.

В работе использовали штамм ПМ-95, серотипа/генотипа Хантаан, выделенный из суспензии легких инфицированной дикой полевой мыши, отловленной в Спасском районе Приморского края. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток VeroE-6, эффективное размножение с высоким титром инфекционного вируса. Видовая принадлежность штамма доказана серологическим и генетическим типированием. Ранее показана высокая вирулентность данного штамма для новорожденных белых мышей [5].

2.1 Культивирование хантавирусов

После выделения из исходного материала и накопления инфекционного вируса до определенного титра (не менее 3,5 lg ФОЕ/мл), супернатант инфицированного монослоя клеток VeroE-6 (перевиваемая линия клеток почек зелённой мартышки CII06-CRL-1586 American Type collection), как и сами инфицированные клетки разливались по аликвотам (1,5 мл) и хранились в условиях глубокого замораживания (от -80°C до -170°С) до использования.

При необходимости ампулу с замороженным вирусом доставали из криохранилища, размораживали при 4°С, и вносили на монослой культуры клеток, выращенный в культуральных флаконах объемом 50 мл, с использованием в качестве среды роста среды Игла МЭМ с двойным набором аминокислот и витаминов, дополненной L-глютамином (1мг/мл), 7% сыворотки эмбрионов коров СЭК, с добавлением для профилактики микробного роста пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (50 мг/мл).

Через 2 недели проводился первый контроль размножения вируса, для чего культуральную жидкость из заражённых флаконов сливали, монослой дважды промывали средой 199 и для снятия клеток обрабатывали смесью, содержащей в равных количествах раствор 0,25% раствор трипсина и раствор версена, подогретой до 37⁰ С. После отделения клеток от стекла, во флаконы добавляли по 1,0 мл питательной среды, в которой клетки ресуспендировали, а затем по 0,2 мл взвеси клеток разводили стерильным физиологическим раствором и центрифугировали при 1000 об/мин в течении 5-7 мин. Осажденные клетки суспендировали, наносили на обезжиренные стёкла, которые подсушивали при комнатной температуре и фиксировали охлаждённым до -20°С ацетоном в течении 40 мин. Оставшиеся зараженные клетки и супернатант замораживали до использования в опыте.

Для выявления вирусного антигена на приготовленные слайды с антигеном наносили референс-сыворотки от людей, переболевших ГЛПС, содержащие в высоком титре антитела к вирусу Хантаан и Пуумала и оставляли на 45 мин для контакта во влажной камере при температуре 37 °С. После контакта препарат трижды в течение 3 мин отмывали фосфатно-солевым буфером рН 7,2, затем двукратно дистиллированной водой и подсушивали при комнатной температуре. На подсушенный препарат наносили в рабочем разведении антивидовые, приготовленные против иммуноглобулинов человека иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (производство Института им. Н. Ф. Гамалеи, Москва). Для контрастирования препарата применяли раствор голубого Эванса на ФСБ рН 7,2, в конечной концентрации 1:100000. После обработки препараты просматривали в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-И2, используя вводно-иммерсионный объектив (с увеличением х 40 или х 60). Результаты выделения вируса оценивали по накоплению вирусного антигена, о чем свидетельствовало ярко зелёное люминесцентное гранулярное свечение цитоплазмы клеток. Интенсивность накопления выражали в процентном содержании светящихся клеток на 100 клеток в поле зрения.

При положительном результате = 100% светящихся клеток определяли титр инфекционного вируса, с помощью методики, основанной на способности хантавируса формировать фокусы из инфекционных клеток под полужидким покрытием. Десятикратные разведения вируссодержащей жидкости и инфицированных клеток (от 10^-1 до 10^-4) параллельно вносили на монослой клеток, выращенный на культуральных 24-луночных планшетах, в дозе 0,2 мл. После контакта в течение часа при 37°С инокулят сливали, монослой однократно отмывали средой МЕМ, и вносили 0,8 мл полужидкого покрытия, состоящего из среды Игла МЭМ содержащей 0,6% карбоксиметилцеллюлозы, 2,0% СЭК, антибиотики. Пластину с инфицированными клетками инкубировали в течение 7-8 дней при 37°С в термостате с 5% содержанием CO₂. Учет реакции проводили через 8-10 дней. Полужидкое покрытие сливали, клетки промывали один раз (для отмывки использовали 0,85% раствор NaCl или ФСБ). После чего клетки фиксировали абсолютным спиртом при комнатной температуре по 400 мкл/лунку (15, 20 минут), после удаления фиксатива клетки отмывали 0,85% раствором NaCl или ФСБ (3х10 минут). Затем вносили специфическую анти-хантавирусную сыворотку (сыворотка реконвалесцента ГЛПС, исходный титр 1:2048) в разведении 16-32 ед. по 200 мкл/лунку. После инкубации монослой отмывали (3х5 минут) раствором ФСБ + 1% Твин-20, и вносили меченный пероксидазой белок «А» 200 мкл/лунку (исходный титр 1:20000, 8-16 ед., разведение на трис-буфере с 0,05% раствором Твин-20 и 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на 60 мин. при 37⁰ С. Затем монослой отмывали 0,85% раствором NaCl или ФСБ (3х5 минут). Для выявления фокусов субстрат по 400 мкл (для получения рабочего раствора субстрата к 8 мл ФСБ прибавляли 1 мл раствора 3,3’диаминобензидина, 1 мл 0,6% раствора NiCl₂ и 4 мкл 30% Н₂О_2. Бляшки проявлялись в течение 5-15 минут, после чего панель промывали проточной водой, подсушивали и подсчитывали количество фокусов. Титр вируса выражали в десятичных логарифмах, по количеству фокусов, образованных при внесении 0,2 мл вируссодержащей жидкости в лунку, и выражали в lg/1,0 мл.

Препараты фукоидана.

В работе использовали препараты фукоиданов, выделенные из бурых водорослей Fucus evanescens, любезно предоставленные сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН.

2.2 Лабораторные животные

Для проведения опытов по противовирусному действию фукоиданов в качестве модели использовали беспородных белых лабораторных мышей в возрасте 24-48 часов после рождения. Выбор такой лабораторной модели обусловлен их высокой чувствительностью к хантавирусу, вызывающему 100% летальность при интрацеребральном заражении.

Эксперимент выполнен на потомстве 16 самок белых мышей, содержащихся в стандартных условиях вивария: содержание в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, по 1 матери с потомством в клетке, стандартный рацион и питьевой режим в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и приказом Минздрава СССР от 10.10.83 № 1179 (пункт 4.1).

Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли в условиях вивария с уровнем безопасности Р-3 (BSL-3).

2) Протокол заражения

Препарат испытывали в трех опытных группах животных – с введением перорально (капельно в рот) в течение 14 дней после заражения, с введением подкожно, трехкратно, с интервалом 2 дня между инъекциями. Отдельную группу составляли животные, которым вводили приготовленную за час до заражения смесь фукоидана и вируса. Кратность и доза введенных вируса и фукоидана представлена в таблице 1. В одну группу входило по 2 клетки, в каждой содержалось потомство одной самки. Каждый опыт повторяли, минимум, 2 раза, каждый раз включая контрольную группу.

Таблица 1 – Кратность, доза и способ введения вируса и фукоидана опытным группам мышей

Группа	Количество животных	Кратность, доза и путь введения вируса	Кратность, доза и способ введения фукоидана
Контроль	27	1 раз х 0,01 мл (5,6 lg ФОЕ/мл), интрацеребрально	-
Опытная № 1	35	1 раз х 0,01 мл (5,6 lg ФОЕ/мл), интрацеребрально	200 (0,01 мл) вместе с вирусом, однократно
Опытная № 2	30	1 раз х 0,01 мл (5,6 lg ФОЕ/мл), интрацеребрально	200 (0,01 мл) peros в течение 14 дней
Опытная № 3	33	1 раз х 0,01 мл (5,6 lg ФОЕ/мл), интрацеребрально	200 (0,01 мл) подкожно, трижды

За зараженными животными наблюдали один раз в день, после появления первых симптомов хантавирусной инфекции (потеря в массе тела, взъерошенная шерсть, снижение двигательной активности) за животными наблюдали дважды в день. При развертывании клинической картины – заторможенность животных, перемежающаяся «всплеском» двигательной активности, судороги в конечностях, потягивание задних лапок, нарушение координации и общее истощение – у животных в агональном состоянии под эфирным наркозом отбирали образцы крови для исследования в НМФА, после эвтаназии отбирали образцы тканей для исследования в ИФА на наличие антигена.

Для выявления специфических антител в сыворотках экспериментально инфицированных животных в НМФА использовали выше описанную методику, с некоторыми модификациями: использовали слайды с клетками VeroE6, содержащими антиген вируса Хантан, в качестве вторичных антител использовали антивидовые, приготовленные против иммуноглобулинов мыши иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (производство Института им. Н. Ф. Гамалеи, Москва).

Иммуноферментный анализ проводили с помощью коммерческих наборов «Хантагност», производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН (Москва), согласно инструкции производителя.

3 Результаты и обсуждения

1. Контрольная группа: все животные (n=27), инфицированные хантавирусом в мозг, погибли, в среднем на 19,52 день (диапазон 17-21 день) с типичной клиникой хантавирусной инфекции, причем примерно половина животных 40,7% умерли на 17-18 день после заражения и 48,1% на 21 день. То есть отмечалась массовая гибель зараженных животных.

2. В группе животных получавших смесь вируса и фукоидана(n=35) отмечена задержка развития симптомов и гибели животных, разность, по сравнению с контролем составила 3,17 дня, статистически достоверная отсрочка (p=0.000) гибели, однако и в этой группе 100% животных умерло в среднем на 22,69 день (с 19 по 26 день после заражения). В отличие от контрольной группы гибель животных с симптомами характерной хантавирусной инфекции не приобрела массовый характер, отдельные особи умирали каждый день в течение более недели.

3. В группе животных получавших фукоидан перорально (n=30) задержка развития симптомов и гибели животных была менее выражена, разность, по сравнению с контролем составила 1,71 день, выживаемость статистически достоверно длилась дольше (p=0.004), чем в контрольной группе, однако и в этой группе 100% животных умерло в среднем на 21,23 день (с 18 по 26 день после заражения). Как и в группе животных, получавших смесь вируса и фукоидана, гибель животных с симптомами характерной хантавирусной инфекции отмечалась в течение 8 дней.

4. В группе животных получавших фукоидан подкожно трижды (n=33) задержка развития симптомов и гибели животных напоминала группу с одновременным введением фукоидана и вируса, разность, по сравнению с контролем составила 3,09 день, выживаемость статистически достоверно длилась дольше (p=0.000), чем в контрольной группе, однако и в этой группе 100% животных умерло в среднем на 22,61 день (с 19 по 25 день после заражения). Как и в группе животных, получавших смесь вируса и фукоидана гибель животных с симптомами характерной хантавирусной инфекции отмечалась в течение 8 дней.

Показатели средней выживаемости экспериментальных групп мышей показаны на рис. 1.

Рис.1 Диаграмма показателей средней выживаемости опытных групп мышей

Выводы

1. Фукоидан обладает определенными протективными противовирусными свойствами, так как при введении разными путями в организм животного, он статистически достоверно увеличивал продолжительность жизни животных при экспериментальной хантавирусной инфекции, в сравнении с контрольной группой.

2. Отсутствие полной защиты от летальной хантавирусной инфекции при использовании фукоидана по лечебной схеме применения препарата свидетельствует о том, что механизм его действия не связан с непосредственным подавлением репликации вируса в зараженной клетке.

3. В то же время, учитывая снижение инфекциозности хантавируса при предварительной обработке фукоиданом, можно предположить, что действие препарата связано со связыванием вирусных рецепторов, и таким образом, препятствует присоединению к клетке-мишени (антиадсорбционное действие).

Список литературы

1. Барашков, Г. Е. Химия водорослей / Г. Е. Барашков. – М. : АН СССР, 1963. – 143 с.

2. Батуро, А. П.Биологическая активность спирулины / А. П. Батуро, Л. П.Блинкова, О. Б. Горобец // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2001. – № 2. – с. 114-118.

3. Запорожец, Т. С. Антибактериальная и иммуномодулирующая активность фукоидана / Т. С. Запорожец, Н. Н. Беседнова, Ю. Н. Лоенко // Антибиотики и химиотерапия. – 1995. – Т. 40, № 2. – с. 9.

4. Кизеветтер, И. В. Промысловые морские водоросли и травы дальневосточных морей / И. В. Кизеветтер, М. В. Суховеева, Л. П. Шмелькова. –М. : Лег. и пищ. пром-сть, 1981. – 113 с.

5. Компанец, Г. Г. 2008, Биологические свойства хантавирусов, циркулирующих в Приморском крае / Г. Г. Компанец // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2008, № 2. – с. 61-64.

6. Кузнецова, Т. А. Иммуностимулирующая и антикоагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли охотского моря fucus evanescens / Т. А. Кузнецова, Т. С. Запорожец, Н. Н. Беседнова // Антибиотики и химиотерапия. – 2002. – Т. 48, № 4. – с. 11.

7. Изучение активности препарата Люромарин in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита / Н. В. Крылова, Г. Н. Леонова, О. С. Майстровская, А. М. Попов, А. А. Артюков, Э. П. Козловская // Антибиотики и химиотерапия. – 2010. – т. 55, № 7–8. с. 17–19.

8. Изучение эффективности препарата Люромарин при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей / Н. В. Крылова, Г. Н. Леонова, А. М. Попов, А. А. Артюков, Э. П. Козловская и др. // Антибиотики и химиотерапия. – 2011. – т. 56, № 7–8. – с. 13–15.

9. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов из бурых водорослей / Т. А. Кузнецова, Н. Н. Беседнова, А. М. Урванцева, И. Ю. Бакунина, Т. Н. Звягинцева, Н. Н. Дрозд, В. А. Макаров // Вестник ДВО РАН. – 2006. – №6. – с. 105-110.

10. Усов, А. И. Химические исследования водорослей / А. И. Усов, О.С.Чижов. – М. : Наука, 1988. – 44 с.

11. Цыбульский, А. В. Повышение противовирусной резистентности в эксперименте под влиянием иммуностимулятора митилана: автореф. дисс. … канд. мед. наук / Цыбульский А. В. – Ленинград, 1989.

12. Чэпмен, В. Морские водоросли и их использование / В. Чэпмен. – М. : Иностр. лит-ра, 1953. – 246 с.

13. A new procedure for the isolation of anti-HIV compounds (polysaccharides and polyphenols) from the marine alga Fucus vesiculosus / A. Béress, O. Wassermann, S. Tahhan, T. Bruhn, L. Béress, E. N. Kraiselburd, L. V. Gonzalez, G. E. de Motta, P. I. Chavez // J. Nat. Prod. – 1993. – Vol. 56, № 4. – p. 478-488.

14. Antiretroviral activity in a marine red alga: reverse transcriptase inhibition by an aqueous extract of Schizymenia pacifica / H. Nakashima, Y. Kido, N. Kobayashi, Y. Motoki, M. Neushul, N. Yamamoto // J. Cancer. Res. Clin. Oncol. – 1987. – Vol. 113, № 5. – p. 413-416.

15. Antitumor activity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllum nodosum / M. Ellouali, C. Boisson-Vidal, P. Durand, J. Jozefonvicz // Anticancer Res. –1993. – № 13. – p. 2011—2019.

16. Ibusuki, K. Effect of Chlorellavulgaris extracts on murine cytomegalovirus infections / K. Ibusuki, Y. Minamishima // Nat. Immun. Cell Growth Regul. – 1990. – Vol. 9, № 2. – p. 121-128.

17. In vitro antiviral activities of sulfated polysaccharides from a marine microalga (Cochlodinium polykrikoides) against human immunodeficiency virus and other enveloped viruses / M. Hasui, M. Matsuda, K. Okutani, S. Shigeta // Int. J. Biol. Macromol. – 1995. – Vol. 17, № 5. – p. 293-297.

18. Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV infection in vitro / M. O. McClure, J. P. Moore, D. F. Blanc, P. Scotting // AIDS Res. Hum. Retroviruses. – 1992. – № 8. – p. 19-26.

19. Nagumo, T. Fucan sulfates and their anticoagulant activities / T. Nagumo, T. Nishino // Polysaccharides in Medicinal Applications. – 1996. – c. 545–574.

20. The inhibitory effect of the crude extract from a seaweed of Dygenea simplex C. Agardh on the in vitro cytopathic activity of HIV-1 and it's antigen production / H. Sekine , N. Ohonuki, K. Sadamasu, K. Monma, Y. Kudoh, H. Nakamura, Y. Okada, T. Okuyama // Chem. Pharm. Bull. – 1995. – Vol. 43, № 9. – p. 1580-1584.

21. Tziveleka, L. A. Natural products with anti-HIV activity from marine organisms / L. A. Tziveleka, C. Vagias, V. Roussis // Curr. Top. Med. Chem. – 2003. – Vol. 3, № 13. – p. 1512-1535.

22. http://puteshestvvenik.narod.ru/index/0-5.

23. http://searchreferats.ru/view/21319.php.

Код для цитирования: Скопировать