VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

ВВЕДЕНИЕ

В литературе существует определенный термин – аутофлора или нормальная микрофлора, под которым понимается открытый биоценоз микроорганизмов, встречающийся у здоровых людей и животных (Петровская, Марко, 1976). Нормальная микрофлора животных выполняет целый ряд жизненно важных функций. Она имеет определенный качественный и количественный состав для каждого вида и является мощным барьером перед патогенными микроорганизмами. Изменения в составе, к примеру, морфологическое (в микробиоценозе начинают доминировать палочковидные бактерии), видовое (одни виды сменяют других), выступают одним из первых сигналов не вполне благополучного состояния макроорганизма. Поэтому так важно знать качественный и количественный состав, основные свойства и характеристики представителей нормальной микрофлоры (Интизаров, 1994; Воробьев, 1999).

В развитии кишечной микрофлоры рыб наблюдается 3 стадии: 1) тразиторная флора – малочисленная и непродолжительно присутствующая, встречающаяся также в пище, воде и на поверхности икры; 2) перманентная индигенная микрофлора, встречающаяся на всех стадиях развития; 3) «взрослая» форма, впервые определяемая примерно через 2 месяца после выклева из икры (Паршуков, 2011).

Формирование первичной кишечной микрофлоры у рыб осуществляется в несколько стадий после первого питания. С возрастом, по мере морфологического и физиологического усложнения кишечника, первичная транзитная микрофлора становится многочисленней, разнообразней и приобретает специфичность. До начала внешнего питания состав и количество бактерий в кишечнике рыб зависят от микрофлоры окружающей воды, в то время как с началом поглощения пищи главную роль играет питание.

Состав кишечной микрофлоры рыб изменяется под действием различных эндогенных и экзогенных факторов. К эндогенным относятся структура пищеварительного тракта, рН кишечного содержимого, анаэробиоз, ферменты, продуцируемые в кишечнике, осмотическое давление, иммунитет хозяина и другие. Окружающая среда вместе с нутриентами рассматриваются как экзогенный фактор. Стрессорные влияния, такие как низкое качество воды, температурные изменения, дефицит питания, повреждения, инфекции или высокая плотность популяции животных могут нарушать баланс уже установившейся микрофлоры (Шивокене 1989; Syvokiene et al., 1995, 2003). В настоящее время считается, что рыбы обладают специфической кишечной микрофлорой, состоящей из анаэробов, факультативных и облигатных анаэробов. Кишечная микрофлора рыб проще, чем у теплокровных. Преобладающие роды – аэробы или факультативные анаэробы. Некоторые авторы считают, что состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта сходен с таковым покровов, жабр и пищевого комка (Cahill, 1990). Но имеются сведения о присутствии в кишечнике рыб, особенно растительноядных, и облигатно анаэробных бактерий (Clements, 1997).

Качество состава микробиоценоза рыб имеет большое значение, поскольку доминирование условно-патогенной и патогенной микрофлоры на фоне ослабления защитных сил макроорганизма, может привести к началу эпизоотии (Паршуков, 2011).

Целью данной работы являлосьизучение и сравнение свойств бактерий, выделенных из кишечника и здоровых и больных осетровых рыб (амурский осетр Acipenser schrenckii и калуга Huso dauricus), а также бактерий выделенных из асцитной жидкости больных особей.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести обзор литературы по данной теме;

2. Произвести отбор проб в виде фрагментов кишечника от здоровых и больных особей Acipenser schrenckii и Huso dauricus, и асцитной жидкости от больных особей.

3. Сделать отпечатки фрагментов кишечника рыб на плотную питательную среду;

4. Выделить чистые культуры полученных микроорганизмов;

5. Определить характер роста на МПА, продукцию каталазы и оксидазы выделенных штаммов, окрасить методом Грама;

6. Выявить антибиотикорезистентных представителей кишечной микрофлоры и асцитной жидкости.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Микрофлора воды

Вода является естественной средой обитания разнообразных организмов. В воде рек, открытых водоемов, морей, океанов обнаруживаются представители всех таксономических групп: скотобактерии, фотобактерии, архебактерии, бактерии, а также простейшие, грибы, водоросли. Совокупность всех микроорганизмов, населяющих водоемы, обозначается термином «микробиальный планктон» (Кочемасова и др., 1987).

Все разнообразие микрофлоры водоемов можно условно разделить на отдельные группы по физиологическим и экологическим признакам. В основу экологической классификации микрофлоры водоемов положена, способность микроорганизмов воды ассимилировать различные вещества, главным образом, соединения азота и углерода, в аэробных и анаэробных условиях (протеолиты, аммонификаторы, нитрификаторы, денитрификаторы, фиксирующие бактерии, бактерии, участвующие в круговороте углерода) (Крис, Новожилова др., 1970).

С экологической точки зрения всю микрофлору водоемов можно разделить на две группы: аутохтонную (или водную) и аллохтонную, попадающую извне, при загрязнении различных источников (Кочемасова и др., 1987). Аутохтонная микрофлора – это микроорганизмы, живущие и размножающиеся в воде. Микробное население воды, как правило, отражает состав микрофлоры, с которой вода непосредственно соприкасается, и поэтому большинство микробных видов являются наиболее распространенными обитателями почв. В воде и донных отложениях водоемов распределение психро-, мезо-, и термофильных бактерий зависит от сезона. Состав аутохтонной микрофлоры незагрязняемых водоемов относительно стабилен и характерен для каждого отдельного водоема. Так, для всех морских водоемов и соленых озер типична галофильность микрофлоры. В водоемах с постоянной низкой температурой преобладают психрофильные микроорганизмы. Напротив, в горячих источниках обитают термофильные микроорганизмы. Подавляющее большинство представителей аутохтонной микрофлоры способно расти и размножаться при 18-20^С (мезофильные бактерии), аутохтонная микрофлора, как правило, играет положительную роль в круговороте веществ в природе, то есть в процессах самоочищения водоема и поддержания их биологического равновесия. Аллохтонная группа состоит из микроорганизмов, привносимых с различными загрязнениями (сточные, ливневые и талые воды, выделения людей и животных). Среди аллохтонных микроорганизмов могут встречаться патогенные, что несет в себе потенциальную эпидемиологическую и эпизоотологическую угрозу. Среди них могут встречаться как возбудители высококонтагиозных особо опасных инфекций, так и представители условно-патогенных и сапрофитных микроорганизмов, которые являются нормальными обитателями тела человека и животных. Для олиготрофных водоемов общее количество бактерий выражается в десятках, иногда сотнях тысяч ( Larrin, 1970). Например, в Байкале от 50 до 200 тыс. микробов в 1 мл. (Кузнецов, 1970). Численность микроорганизмов невелика, минимальное количество (50-100 тыс. кл.) обычно наблюдалось зимой, а максимум (700-1200 тыс. клмл) – в августе (Гоман, 1976), в чистых участках Ладожского озера от 100 до 300 тысяч. (Родина, Кузьмицкая, 1963). В загрязненных водоемах общее количество бактерий увеличивается до сотен тысяч и миллионов. Так, в Волгоградском водохранилище находилось от 170 тысяч до 1300 тысяч микробов в 1 мл (Мосевич, 1969), на отдельных участках Куйбышевского водохранилища – до 13 миллионов (Варламов, 1969), в Цимлянском водохранилище – от 2,2 млн. до 4,7 млн. бактерий в 1 мл. воды (Кузнецов, Романенко, 1967).

В озерах встречаются представители тех же основных родов бактерий, что и в соленых морских водах. Шире всего распространены грамотрицательные палочковидные организмы, относящиеся к родам Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium, Acinetobacter, Moraxella, а также различные миксобактерии, иногда попадаются типичные грамположительные почвенные организмы (Klen, 1962; Lones, 1971).

В открытых водоемах обнаруживают гнилостные, нитрифицирующие, азотфиксирующие, серо- и микобактерии, нефтеокисляющие бактерии: Pseodomonasfluorescens, Bacteroidesaquatiliscommunis, Micrococcuscandicans, Micr. rosens, Sarcinalutea, Torularogea, Bacilluscereus, Bac. mycoides, Clostridiumbotulinum, Cl. perfringens, Chrobacteriumviolaceum возбудителе сибирской язвы, туберкулеза, туляремии, бруцеллеза, рожи, листериоза, лептоспироза, пастереллеза, холеры, дизентерии, брюшного тифа, инфекционного гепатита, энтеровирусных инфекций и других (Микитюк и др., 1989).

Имеется много сообщений о распространении бактерий в морских водах и осадках, особенно там, где встречаются животные, растения и детриты (Lannasch, Lones, 1969).

Принято считать, что численность бактерии в столбе воды значительно уменьшается с глубиной. Активность микроорганизмов на большой глубине в океане незначительна. Снижение микробной активности здесь может быть обусловлено, прежде всего, наличием малочисленной популяции микроорганизмов (Hobbie et al., 1972), либо совместным действием температуры и высокого давления (Lannasch, et al., 1971).

Д. Д. Куб и Ж. Л. Лейстер (Koob, Leister, 1972) в озере Бонни обнаружили четкое распределение бактериальных популяции по вертикали с наибольшей плотностью. Температура воды на этих глубинах колебалась от -2⁰С до 7⁰С.

Большинство организмов, выделенных на глубине от 10 до 15 м, представляет собой дрожжи родов Candida и Cryptococcus. В отличие от озера Бонни в озере Ванда, методом счета на чашках зарегистрировано свыше 300 бактери в 1 мл. (Benoit, et al., 1971).

Флора любого поверхностного водоема периодически изменяется и обновляется, это связано с постоянным попаданием бактерий из почвы берега, с дождевой водой и поверхностными стоками. Микроорганизмы воды играют значительную роль в круговороте веществ и природе. Они выполняют «роль мусорщиков», расщепляя органические отходы, клетчатку, обеспечивая питательными веществами другие микроорганизмы, живущие в воде. Биологическая активность водоема максимальна в летне-осенний период. Развитие водной микрофлоры зависит от температуры воды, инсоляции, количества питательных веществ, физико-химических особенностей водоема, поверхности водного зеркала, скорости и направления ветра, прибрежных течений приливно-отливных колебаний. Сезонные и метеорологические факторы тоже влияют на качество и количество микрофлоры водоемов. Однако из этих общих закономерностей могут быть исключения. Так, в период ливней, дождей и паводков может увеличиваться количество микроорганизмов в водоеме, за счет смываемой почвенной микрофлоры и увеличения стока с поверхности водосбора (Корш, 1970). При смешении пресной и морской воды в районах впадения крупных рек микробные загрязнения скапливаются вблизи устьев и по линии гидрофронта распространения и диффузии речной воды. (Крисс и др., 1970). На Аляске в воде, заключенной в воздушных пузырях льда, найдены пурпурные, розовые зеленые бактерии (Barsdate et al., 1970).

Микроорганизмы, обитающие в озере Байкал, являются наименее исследованной в систематическом отношении группой живых его обитателей. Видовая принадлежность микроорганизмов определялась в различные периоды по соответствующим времени определителям и представлена 17 родами и достаточно широким спектром видов (Петров, Егоров, 1998). Микрофлора озера Байкал представлена разнообразными формами: кокками, палочками, дрожжеподобными и нитчатыми микроорганизмами. В воде 30 видов гетеротрофных бактерий. Наиболее часто встречались представители видов Pseudomonas и Micrococcus. В береговой зоне доминировали кокковые, на глубоководных станциях – палочки и появились спорообразующие (Жданов, 1980). На основе анализа первичной структуры участка гена РНК малой субъединицы рибосомы была установлена таксономическая принадлежность семи штаммов из коллекции водных байкальских бактерий. Три штамма отнесены к Proteobacteria, один – Protcobacteria, еще три – к роду Bacillus (Беликов др., 1996).

Влияние гидробионтов на состав микрофлоры может быть двояким. С одной стороны, в организме моллюсков и других водных животных в результате фильтрации могут наблюдаться значительное накопление и концентрация бактерий и вирусов, в том числе и патогенных. Все это способствует накоплению патогенной микрофлоры в водоемах. С другой стороны, освобождение от микрофлоры воды, фильтрующейся через организм животных, является фактором очищения (Hoff, Becrer, 1969).

Изучение количественного и качественного состава отдельных групп микрофлоры имеет значение для оценки санитарного режима водохранилищ, рек, каналов, а также прибрежных зон морей (Григорьева , 1975). Основным условием эффективного производства объектов аквакультуры в рыбохозяйственных водоемах является соблюдение ветеринарно-санитарных правил. Санитарно-бактериологическую оценку водоема проводят по следующим показателям: мезофильно-аэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы (общее микробное число (ОМЧ)); коли-титр (определение титра бактерий группы кишечных палочек) – показатель фекального загрязнения; наличие аэромонад и псевдомонад (МУ от 27.09.99 г.). Количество аэромонад зависит от сезонного и климатического факторов, наличия легкоусвояемых органических веществ и связано с фекальным загрязнением лишь опосредственно (Артемова, 1971). В зависимости от полученных результатов водоем относят к одной из трех категорий по бактериальной обсемененности (Табл. 1).

Табл. 1 Категории водоемов по степени бактериальной обсемененности.

категория	Допустимый предел бактериальной обсемененности				оценка
	Микробное число в 1 мл	Коли-индекс	аэромонады	псевдомонады
первая	106	10 П+	10 П+	10 П+	грязные
Примечание: П-  недопустимо наличие патогенных для рыб микроорганизмов П+  возможно наличие патогенных микроорганизмов.

Недопустимо использовать для рыбоводства водоемы третьей категории (грязные), не приведенные в соответствие с санитарными требованиями. Это как правило, стационарно неблагополучные по инфекцонным заболеваниям рыб водоемы (Мун, Луллу, 1983).

Микроорганизмы воды можно разделить на две группы. В первую входят облигатные возбудители, вызывающие заболевание, независимо от состояния рыбы и условий среды, и требующие контроля за их распространением. К этой группе относятся: Aeromonasicida, A.sobria, Edwardsiellaictaruri, Vibrioanguillarum, Renibacteriuminarum (Цыбикжапов, 2002). Отмечается, что доля аэромонад занимает более трети всего микробного пейзажа Волги (Соколова, Иренков, Борисова, Ларцева, 2000). Ко второй группе относятся условно-патогенные микроорганизмы, которые проявляют свою вирулентность только в условиях неблагоприятных для хозяев. Такие микроорганизмы могут быть факторами экологической обстановки в водоеме (Цыбикжапов, 2002).

1.  

   1. Численность бактерий в кишечнике рыб

Общая плотность популяции бактерий представляет собой своеобразную экологическую систему, подверженную влиянию различных факторов (возраст и тип питания рыбы, голодание или ограничение рациона, отдел пищеварительного тракта, сезон года, соленость и другие параметры окружающей среды) (Шивокене 1980; Campbell, Buswell, 1983).

В разных отделах кишечника прудовых рыб выявлена неодинаковая численность бактерий. Так, максимальная их численность установлена в переднем и среднем отделах, что позволяет предполагать участие бактерий в расщеплении питательных веществ. Присутствие большого числа бактерий в некоторых случаях в заднем отделе кишечника связывают с участием этих бактерий в расщеплении балластных веществ и с обеспечением рыб, как и млекопитающих, вторичными нутриентами (Шивокене, 1989).

Установлено, что плотность микробной популяции содержимого кишечника рыб зависит от плотности микробной популяции в воде. Различают флору содержимого кишечника и флору, плотно связанную со стенкой кишечного тракта (Cahill, 1990). Найдена прямая зависимость между интенсивностью питания и общим количеством бактерий в кишечнике (Syvokiene et al., 2003).

Во время зимовки и голодания пищеварительный тракт рыб не освобождается от бактериального населения. Однако в этот период в 10 раз и более уменьшается число бактерий по сравнению с их количеством при интенсивном питании (Шивокене, Тряпшене, 1985).

Качественный и количественный состав кишечной микрофлоры рыб изменяется под действием различных эндогенных и экзогенных факторов. К эндогенным факторам относятся структура пищеварительного тракта, рН кишечного содержимого, анаэробиоз, ферменты, продуцируемые в кишечнике, осмотическое давление, иммунитет хозяина и другие. Окружающая среда живого организма вместе с нутриентами рассматривается как экзогенный фактор. Стрессорные влияния, такие как низкое качество воды, температурные изменения, дефицит питания, повреждения, инфекции или высокая плотность популяции животных могут нарушать баланс уже установившейся микрофлоры (Olsen et al., 2002).

Под действием стресса бактерии слабее закрепляются в кишечнике рыб, что сопровождается значительным увеличением количества бактерий в фекалиях. Предполагается, что это происходит из-за сползания слизи, вместе с которой удаляется существующая микрофлора, позволяя оставшимся в кишечном содержимом бактериям (в том числе и патогенным) колонизировать поверхность энтероцитов (Olsen et al., 2002). Комплексное взаимодействие между хозяином и кишечной микрофлорой позволяет одним штаммам бактерий колонизировать кишечник, в то время как другие перевариваются или вызывают инфекцию (Hansen, Olafsen, 1999).

Отмечается значительный разброс в величинах численности бактерий в кишечниках разных рыб одного вида и рыб одного вида из разных мест обитания (Spanggaard, 2000).

Активно питающиеся костистые рыбы обладают бактериальной флорой в пищеварительном тракте, сходной с флорой кожи и жабр, часто это 10³  10⁸ организмов на грамм влажного веса ткани (Horsley, 1977).

В кишечном тракте рыб существует популяция бактерий, характеризующаяся высокой плотностью – до 10⁸ аэробных гетеротрофных бактерий и приблизительно 10⁵ анаэробных бактерий на грамм содержимого (Austin, 2002).

Удалось показать, что в кишечниках рыб присутствует непатогенная анаэробная резидентная микрофлора, численность которой колеблется от 610⁴ до 410⁸ на 1 г в зависимости от используемой среды и отдела пищеварительного тракта (Trust et al., 1979).

Наибольшее количество бактерий установлено в пищеварительном тракте трехлеток белого амура Ctenopharyngodonidella (9.710¹² кл/г) и карпа Cyprinuscarpio (8.810¹² кл/г), причем с возрастом рыб количество бактерий в пищеварительном тракте увеличивалось, а при голодании – уменьшалось (Лубянскене и др., 1980).

Общее количество бактерий в кишечнике золотой рыбки (Carassiusauratus) колеблется от 2,210⁶ до 2,110⁸ кл./г влажного веса (Sugita et al., 1998).

Подсчет доминантной микрофлоры кишечника радужной форели (Oncorhinchusmykiss) показал, что в слизистой кишечника бактерий на 2-3 log единицы меньше, чем в его содержимом. Общее количество бактерий в содержимом кишечника колеблется от 310² до 710⁸ кл./г (Spanggaard et al., 2000).

Типичная популяция бактерий в кишечнике рыб представлена 10⁸ на 1 г аэробных гетеротрофных бактерий и приблизительно 10⁵ на 1 г анаэробных бактерий. Эти уровни существенно ниже, чем для теплокровных животных (Ringo et al., 1995).

Численность гетеротрофных организмов в кишечнике леща (Amramisbrama) в зимние месяцы почти в миллион раз ниже, чем летом, в период активного питания (610² и 610⁷ - 710⁷ кл./мл соответственно) (Кузьмина, Скворцова, 2002 б).

Данные, касающиеся микрофлоры, тесно связанной с пищеварительно-транспортной поверхностью кишечника, крайне противоречивы. С использованием сканирующего электронного микроскопа показана крайне редкая (до 0,001% общей площади поверхности) колонизация бактериями стенок кишечника радужной форели (Austin, Al-Zahrani, 1988). Однако исследования с помощью трансмиссионного электронного микроскопа показали существенное количество бактериальных клеток между микровиллями кишечного тракта арктического гольца Salvelinusalpinus (Lodamel et al., 2001). Обнаружена прочная ассоциация кокков и палочковидных бактерий между микровиллями энтероцитов. Некоторые энтероциты интенсивно колонизированы, в то время как другие не имеют ассоциированных бактерий (Ringo et al., 2001; Fidopiastis et al., 2006).

По мнению ряда авторов, для количественного и качественного исследования кишечной микрофлоры наиболее важны два фактора – питательная среда и температура культивирования (Horstey, 1977; Cahill, 1990). Методы для изучения прикрепленной кишечной микрофлоры рыб в основном основаны на гомогенизации отделов кишечника и последующих посевах гомогенатов на различные селективные среды, что, как известно, позволяет обнаружить только микроорганизмы, способные расти на специфических средах. В кишечнике также присутствуют анаэробные бактерии, многие из которых не поддаются культивированию в лабораторных условиях (Tannok, 2002). Происходит существенная недооценка численности популяции бактерий. В связи с этим были выполнены расчеты. Согласно результатам последних работ, с задним отделом кишечника рыб связано приблизительно 3,310⁵ бактерий. Принимая во внимание, что только 25% (110⁵) энтероцитов задней кишки колонизированы, а каждый энтероцит несет на себе 100 бактерий, получается примерно 110⁷ бактерий. Это означает, что культивируется только 3% общей бактериальной популяции, связанной с задним отделом кишечника (Ringo et al., 2001).

Таким образом, по данным приведенных выше авторов, общее количество бактерий у разных видов рыб колеблется в пределах от 10² до 10¹² кл. на 1 грамм влажного веса. Однако большинство авторов указывают на величины порядка 10⁵ – 10⁸ кл/г. По-видимому, такой разброс связан не только с видовым разнообразием изученных рыб, условиями их обитания и особенностями физиологии, но и с методами подсчета бактерий, используемыми разными исследователями (Паршуков, 2011).

1.  

   1. Видовое разнообразие бактерий кишечного тракта рыб

В настоящее время считается, что рыбы обладают специфической кишечной микрофлорой, состоящей из аэробов, факультативных и облигатных анаэробов, причем состав бактерий изменяется в зависимости от возраста, пищевого статуса и окружающих условий (Hansen, Olafsen, 1999). На прикрепление и колонизацию микробиотой пищеварительного тракта влияют кислотность, желчные кислоты, перистальтика, пищеварительные ферменты, иммунный ответ и индигенные бактерии и антибактериальные компоненты, которые они продуцируют. Отмечается, что при недостатке в желудочно-кишечном тракте тех или иных нутриентов, состав микробиоты может изменяться вследствие конкуренции за питательные вещества (Ringo, Gatesoupe, 1998). Кишечная микрофлора рыб проще, чем у теплокровных. В то время как пищеварительный тракт теплокровных колонизирован в основном облигатными анаэробами, преобладающие роды, изолированные из большинства кишечников рыб, - аэробы или факультативные анаэробы (Ringo et al., 1995).

Определенные резидентные бактерии кишечника ответственны за бактериальный антагонизм и колонизационную устойчивость, поскольку эти бактерии тесно связаны с кишечным эпителием и формируют барьер, служащий первой защитой, ограничивающей прямое прикрепление или взаимодействие патогенных бактерий с мукозой. Прикрепление – первый шаг для микроорганизмов в процессе колонизации. Предполагается, что прикрепление – результат взаимодействия лектинов либо с гликопротеинами, либо с гликолипидами, источником которых могут быть сами бактерии, клетки эпителия кишечника или пищевые вещества. Обнаружены Carnobacteriumsp., прилипающие к кишечной слизи радужной форели без специфического сцепления (Ringo, Gatesoupe, 1998).

Виды рода Lactobacillus – основные доминирующие представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта теплокровных животных. В кишечнике рыб молочнокислые бактерии представляют часть нормальной микрофлоры, не являясь при этом доминантными видами (Ringo et al., 1995). Зимовка не оказывает заметного влияния на видовой состав лактофлоры стенки кишечника, однако в этот период увеличивается встречаемость основного, доминирующего вида – Lactobacilluscasei, что свидетельствует о повышенной роли кишечной микрофлоры в экстремальных условиях, обеспечивая выживание (Jankauskiene, 2000 a). Количество лактобацилл и их видовой состав в кишечном тракте карпа представлен 7 видами, численность представителей каждого вида варьирует в зависимости от возраста рыб (Jankauskiene, 2000 b).

В пищеварительном тракте пресноводных рыб преобладают виды родов Enterobacter, Aeromonas и Acinetobacter (Cahill, 1990). Также встречаются Escherihia, Klebsiella, Proteus, Serratia, Alcaligines, Eikenella, Bacteroides, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Cytophaga/Flexibacter, Bacillus, Listeria, Propionobacterium, Staphilococcus, Moraxella, Pseudomonas (Austin, 2002).

1. Материалы и методы

Объектами исследования послужили микроорганизмы, обитающие в кишечнике здоровых и больных амурского осетра (Acipenser schrenckii) и калуги (Huso dauricus), а также микроорганизмы асцитной жидкости особи (Huso dauricus) с признаками патологических процессов.

По отношению к температурному фактору – это мезофильная группа микроорганизмов, культивируемая на питательных средах при температурах 21 и 37С.

По отношению к кислороду – это аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы.

По типу питания – гетеротрофные сапрофитные организмы.

Питательная среда для первичного выделения – мясопептонный агар.

Исследуемые рыбы в систематическом отношении занимают следующее положение: семейство Acipenseridae, род Acipenser, вид Acipenser schrenckii и род Huso, вид Huso dauricus (http://fish.dvo.ru).

2.1 Пробоотбор

Пробозабор производился в пгт. Лучегорск Приморского края на Научно-исследовательской рыборазводной станции Тихоокеанского научно-исследвательского рыбохозяйственного центра (ТИНРО-Центр). Работа проводилась в г. Владивосток Приморского края в Дальневосточном федеральном университете, лаборатории микробиологии согласно нижеприведенным методикам.

Перед началом отбора фрагментов кишечника тело рыбы было обработано спиртом. Вскрытие производилось стерильными инструментами. Образцы помещались в заранее подготовленные стерильные пенициллиновые флаконы. Забор асцитной жидкости производился с помощью одноразового медицинского шприца.

2.2 Посев проб.

Посев с фрагментов кишечника производился путем отпечатывания образца на поверхности мясопептонного агара. При этом чашка была разделена на четыре сектора.

Для посева проб асцитной жидкости использовался метод последовательных разведений. Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний. Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и учет выросших колоний.

Разведения готовят в водопроводной воде или 0,85% -ном растворе NaC1, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный 10. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии (проба морской воды) стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды, перемешивают новой стерильной пипеткой. Это первое разведение 1:10. Полученную в первом разведении пробу с помощью новой стерильной пи­петки тщательно перемешивают, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3—5 раз, что обеспечивает перемешивание пробы и уменьшает адсорб­цию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения из первой пробирки и переносят его во вторую пробирку — это второе разведение, 1 : 100. Таким же образом готовят и последующие разведения.

На поверхность плотной питательной среды стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем 0,1 мл соответствующего разведения и распределяют его стерильным шпателем по поверхности среды (Бузолева, 2012) (рис. 1). Посев на плотную среду осуществлялся с разведениями 10^-3, 10⁵ и цельной пробой на мясопептонный агар. Инкубация проходила при комнатной температуре в течение 3-х суток.

Рис. 1 Схема посева методом последовательных разведений.

2.3. Получение изолированных колоний

По окончании инкубирования был произведен рассев полученных газонов с целью получения изолированных колоний и последующего описания культуральных свойств. Для этого был применен метод штриха (рис.2). Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Б. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано ниже на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3. Д. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того, чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

Рис. 2 Метод посева штрихом в чашки для получения отдельных

колоний

Полученные изолированные колонии были описаны в соответствии с правилами, приведенными в Методах общей бактериологии (Васильев и др., 2003). Для получения чистых культур, выделенных микроорганизмов, часть изолированной колонии каждого морфотипа была отколота и перенесена на столбик косого агара. Полученные чистые культуры использовались для всех последующих опытов.

2.4. Определение фермента каталазы

Некоторые виды микроорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в процессе дыхания образуют перекись водорода, являющуюся клеточным ядом. Количество перекиси водорода в культуре никогда не достигает высоких концентраций, так как по мере образования перекись расщепляется на воду и молекулярный кислород при участии фермента каталазы (Бузолева, 2012). На чистое предметное стекло стерильной петлей помещается небольшое количество биомассы исследуемого штамма, затем наносят 1—2 мл 1% раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кислорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы. Подобный результат в протоколе опыта отмечается знаком + как положительный результат реакции на каталазу (Васильев и др., 2003).

2.5 Определение продукции оксидазы

Оксидазоположительные бактерии содержат цитохромоксидазу или индофенол оксидазы (железосодержащий гемопротеин) (Isenberg, 2004). Эти ферменты катализируют перенос электронов от донора (NADH) к акцептору электронов (обычно кислород). При проведении теста N, N, N ', N'-тетраметил-п-фенилендиамин высттупает в качестве искусственного донора электронов для фермента оксидазы. Окисленный реагент образует соединение вустеровский синий (индофенол). Цитохром система, как правило, присутствует только в аэробных организмах, которые способны использовать кислород в качестве конечного рецептора водорода. Конечный продукт этого метаболизма вода или перекиси водорода (MacFaddin, 2000). На чистое предметное стекло стерильной петлей переносится небольшое количество биомассы исследуемого микроорганизма, при добавлении 1% раствора тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорида оксидазоположительные штаммы дают с этим реактивом синее окрашивание (Васильев и др., 2003).

2.6 Окраска по Граму

Разница между грамположительными и грамотрицательными бактериями зависит от различия их изоэлектрических точек, а способность грамположительных бактерий удерживать окраску связана с присутствием в них магниевой соли рибонуклеиновой кислоты, которой грамотрицательные бактерии не содержат. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, или другой какой-либо фиолетовой трифенилметановой краски (напримep метилвиолета) на 1—2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1—2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30—60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2—3 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой. Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера). Иногда в культуре грамположительных бактерий могут наблюдаться грамотрицательные особи, которых тем больше, чем старше популяция. Это ничто иное, как бактериальные трупы, претерпевшие внутриклеточный автолиз, в результате которого клетка лишилась рибонуклеинатов магния (Васильев и др. 2003).

2.7. Определение чувствительности к антибиотикам

Явление антагонизма в мире микробов распространено очень широко. Антагонистические взаимоотношения проявляются в невозможности совместного существования некоторых микробных видов вследствие того, что одни из них препятствуют размножению других, вызывая из гибель. Так, например, установлено, что представители нормальной микрофлоры человеческого тела проявляют антагонизм в отношении многих патогенных и гнилостных бактерий.

Изучение явлений микробного антагонизма привело к открытию специфических антибактериальных веществ, продуцируемых бактериями и грибами в окружающую среду. Они получили название антибиотиков. (Лабинская, 1978)

Классификация антибиотиков по химической структуре, которую широко используют в медицинской среде, состоит из следующих групп:

1. Бета-лактамные антибиотики, делящиеся на две подгруппы: а) Пенициллины — вырабатываются колониями плесневого грибка Penicillinum; б) Цефалоспорины — обладают схожей структурой с пенициллинами. Используются по отношению к пенициллинустойчивым бактериям.

2. Макролиды — антибиотики со сложной циклической структурой. Действие — бактериостатическое.

3. Тетрациклины — используются для лечения инфекций дыхательных и мочевыводящих путей, лечения тяжелых инфекций типа сибирской язвы, туляремии, бруцеллёза. Действие — бактериостатическое.

4. Аминогликозиды — обладают высокой токсичностью. Используются для лечения тяжелых инфекций типа заражения крови или перитонитов. Действие — бактерицидное.

5. Левомицетины — Использование ограничено по причине повышенной опасности серьезных осложнений — поражении костного мозга, вырабатывающего клетки крови. Действие — бактериостатическое.

6. Гликопептидные антибиотики нарушают синтез клеточной стенки бактерий. Оказывают бактерицидное действие, однако в отношении энтерококков, некоторых стрептококков и стафилококков действуют бактериостатически.

7. Линкозамиды оказывают бактериостатическое действие, которое обусловлено ингибированием синтеза белка рибосомами. В высоких концентрациях в отношении высокочувствительных микроорганизмов могут проявлять бактерицидный эффект.

8. Противотуберкулёзные препараты — Изониазид, Фтивазид, Салюзид, Метазид, Этионамид, Протионамид.

9. Антибиотики разных групп — Рифамицин, Ристомицина сульфат, Фузидин-натрий, Полимиксина M сульфат, Полимиксина B сульфат, Грамицидин, Гелиомицин.

10. Противогрибковые препараты — разрушают мембрану клеток грибков и вызывают их гибель. Действие — литическое. Противолепрозные препараты — Диафенилсульфон, Солюсульфон, Диуцифон (http://ru.wikipedia.org) В работе тестировалась устойчивость исследуемых штаммов к наиболее распространенным антибиотическим препаратам, по возможности из каждой группы: азитромицин, бензилпенициллин, ванкомицин, амоксициллин, левомицетин, гентамицин, цефотаксим.

По степени чувствительности к антибиотикам микроорганизмы подразделяются на 4 группы:

1. чувствительные – обычные терапевтические дозы антибиотив оказываются достаточными для подавления роста;

2. среднечувствительные – для подавления роста необходимы повышенные дозы дозы антибиотиков;

3. устойчивые – антибиотик не действует.

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определялась методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков (Лабинская, 1978).

Стандартные диски представляют собой кружки диаметром 5 мм, приготовленные из определенных сортов фильтровальной бумаги и пропитанные антибиотиками такой концентрации, которая обуславливает одинаковый диаметр зон задержки роста (28-32 мм) чувствительных тест-микробов.

Стерильные чашки Петри, установленные на горизонтальной поверхности заливались питательным агаром, толщина слоя составляла 4-5 мм. На поверхность наносилась суспензия исследуемой культуры и растиралась стерильным шпателем для создания микробного газона. На поверхность засеянной среды с помощью стерильного остроконечного помещались диски, пропитанные различными антибиотиками. Каждый диск слегка прижимался браншами пинцета, чтобы он плотно прилегал к поверхности агара. каждая чашка служила для одновременно испытания штамма к действию 7 антибиотиков. Засеянные чашки с нанесенными на них дисками помещались в термостат при 37С вверх дном на 30 часов.

Антибиотическое вещество, находящееся в диске, диффундирует в агар, формируя вокруг диска зону угнетения роста чувствительных к нему микроорганизмов. Наибольшая концентрация антибиотика отмечается в месте расположения диска; по направлению к периферии содержание его снижается.

Бактерии, чувствительные к антибиотикам, образовали вокруг соответствующих дисков зоны угнетения роста, четко выделяющиеся на фоне сплошного микробного роста. Измерение зоны угнетения проводилось с помощью миллимитровой линейки. Измеряемый диаметр зоны проходил через центр диска. Интерпретация полученных данных проводилась в соответствии с ниже приведенной таблицей (табл. 3):

Табл. 3 Интерпритация значений диаметров зон задержки роста микроорганизмов при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Противомикробные препараты в диске	Диаметр зон для культур (в мм)
	устойчивых	промежуточных	чувствительных
азитромицин	≤13	14-17	≥18
бензилпенициллин	≤10	11-16	≥17
ванкомицин	≤14	15-16	≥17
амоксициллин	≤9	10-13	≥14
левомицетин	≤15	16-18	≥19
гентамицин	≤15	-	≥16
цефотаксим	≤14	15-20	≥21

1. Результаты и Обсуждения

Микрофлора – непременный симбионт макроорганизма. Благодаря симбионтным бактериям возможность проникновения и размножения патогенных микроорганизмов уменьшается. Также эти бактерии обладают набором специфичных ферментов, позволяющих гидролизовать субстраты, которые могут быть недоступны ферментам макроорганизма. Изучение культуральных и некоторых физиолого-биохимических свойств представителей микрофлоры макроорганизма проводилось классическими методами микробиологии на примере штаммов, выделенных из осетровых рыб, а именно амурского осетра (Acipenser schrenckii) и калуги (Huso dauricus).

3.1 Получение чистых культур кишечных бактерий исследованных рыб

По окончании инкубирования чашек с отпечатками фрагментов кишечника рыб и с посевами асцитной жидкости в общем было выделено в чистую культуру 15 различных морфотипов колоний, из них один штамм выделен из асцитной жидкости, 2 штамма – из кишечника больной калуги и 13 штаммов из кишечника здоровых рыб (Табл. 4).

Табл. 4 Описание полученных колоний микроорганизмов.

№	Место выделения	форма	цвет	край	поверхность	центр	скульптура	консистенция
1	Асц. ж.	круглая	белый	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается
2	Б. о.	круглая	белая	Зубч.	глянцевая	-	гладкая	Легко снимается
3	Б. о.	круглая	розовая	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается
4	З.о.	круглая	желтоватая	ровный	глянцевая	+	гладкая	кожистая
5	З. о.	круглая	белая	Зубч.	глянцевая	-	гладкая	Легко снимается
6	З. о.	круглая	Желтов-я	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается
7	З. о.	неправильная	Бежев-я	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается
8	З. о.	круглая	белая	Зубч.	глянцевая	+	Шерох-я	Легко снимается
9	З. о.	круглая	Белая, центр желт.	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается
10	З. о.	неправильная	белая	Зубч.	глянцевая	+	Шерох-я	Легко снимается
11	З. о.	круглая	желтая	Зубч.	глянцевая	-	гладкая	Легко снимается
12	З. о.	круглая	Розоват-я	Зубч.	глянцевая	-	гладкая	Легко снимается
13	З. о.	круглая	Белая, центр серый	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается
14	З. о.	круглая	Желто-оранж.	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается
15	З. о.	круглая	белая	Зубч.	глянцевая	+	гладкая	Легко снимается

Асц. ж.  асцитная жидкость; Б. о.  больная особь; З. о.  здоровая особь; З. о.  здоровая особь.

К сожалению, при последующем пересеве штаммы 12-15 прекратили свой рост и, следовательно, в дальнейших опытах не фигурировал. Вероятно, данные микроорганизмы высокочувствительны к изменениям окружающей среды и лабораторные условия не соответствуют их требованиям.

В целом выделено достаточно мало морфотипов для кишечной микрофлоры макроорганизма. По расчетам Ринго с соавторами (Ringo et al., 2001) культивируется только 3% общей бактериальной популяции кишечника рыб. Также отмечается, что только небольшое количество бактерий, наблюдаемых непосредственно в микроскоп, способно расти на обычных средах. Поэтому неизвестно насколько полно разнообразие реально существующей в кишечнике микрофлоры отражается традиционными методами культивирования (Spangaard et al., 2000). Например, на 15 различных питательных средах удалось культивировать не больше 4,8% общего количества выделенных из кишечников морских растительноядных рыб бактерий (Fidopiastis, 1996).

3.2 Определение каталазы и оксидазы

При проведении теста по определению наличию каталазы выявлено 2 каталазоотрицательных, 8 каталазоположительных штаммов и 2 штамма показавших неоднозначный результат. В ходе опыта по определению продукции оксидазы выявилено 2 оксидазоположительных, 6 оксидазоотрицательных штаммов и 3 культуры с сомнительным результатом (Табл. 5).

Табл. 5 Тесты на каталазу и оксидазу

№ штамма	каталаза	оксидаза
1	+	±
2	+	+
3	+	-
4	+	-
5	+	±
6	±	-
7	-	-
8	+	±
9	+	-
10	-	+
11	+	-

«+» - реакция положительная, «-» - реакция отрицательная, «±» - сомнительный результат

Преобладание каталазоположительных форм связано с выбором методик работы. Все культуры выращивались в аэробных условиях, следовательно, все выделенные штаммы должны быть аэробами или факультативными анаэробами. Оксидазоположительные штаммы содержат цитохром с оксидазу и, следовательно, могут использовать кислород в качестве конечного акцептора водорода в процессе производства энергии. Оксидазоположительные бактерии не содержат цитохром с оксидазу и либо не могут использовать кислород, либо используют другие цитохромы для передачи водорода на кислород.

3.3 Окраска по Граму

При окрашивании методом Грама выявлено 4 грамположительных и 7 грамотрицательных штаммов. В морфологическом отношении преобладают кокковые формы (Табл. 6).

Табл. 6 Результаты окраски по Граму

№ штамма	окраска по Граму	морфология клеток
1	грамотрицательный	кокки
2	грамотрицательный	палочки
3	грамотрицательный	кокки
4	грамотрицательный	кокки
5	грамположительный	крупные палочки
6	грамположительный	крупные палочки
7	грамотрицательный	короткие палочки
8	грамположительный	кокки
9	грамотрицательный	кокки
10	грамотрицательный	кокки
11	грамположительный	кокки

Преобладание грамотрицательной флоры подтверждается данными Казимирченко (Казимирченко, 2008.), при этом во все сезоны отмечались патологические изменения у рыб. Такое соотношение грамположительных и грамотрицательных бактерий может свидетельствовать о неблагополучии исследованной популяции рыб.

3.4 Определение антибиотикочувствительности

Полученные результаты постановки теста на чувствительность полученных бактерий приведены ниже в таблицах (Табл. 7.1-7.11).

Табл. 7.1 Антибиотикочувствительность штамма № 1

№ штамма	противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
1	азитромицин	22	чувствительный
	бензилпенициллин	25	чувствительный
	ванкомицин	18	чувствительный
	амоксициллин	30	чувствительный
	левомицетин	15	устойчивый
	гентамицин	32	чувствительный
	цефотаксим	13	устойчивый

Штамм чувствителен к азитромицину, бензилпенициллину, ванкомицину, амоксициллину, гентамицину; устойчив к левомицетину, цефотаксиму.

Табл. 7.2 Антибиотикочувствительность штамма № 2

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	22	чувствительный
бензилпенициллин	-	устойчивый
ванкомицин	19	чувствительный
амоксициллин	-	устойчивый
левомицетин	23	чувствительный
гентамицин	9	устойчивый
цефотаксим	26	чувствительный

Штамм чувствителен к азитромицину, ванкомицину, левомицетину, цефотаксиму; устойчив к бензилпенициллину, амоксициллину, гентамицину.

Табл. 7.3 Антибиотикочувствительность штамма № 3

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	14	промежуточный
бензилпенициллин	8	устойчивый
ванкомицин	8	устойчивый
амоксициллин	28	чувствительный
левомицетин	31	чувствительный
гентамицин	29	чувствительный
цефотаксим	25	чувствительный

Штамм чувствителен к амоксициллину, левомицетину, гентамицину, цефотаксиму; умеренно устойчив к азатромицину; устойчив к бензилпенициллину, ванкомицины.

Табл. 7.4 Антибиотикочувствительность штамма № 4

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	9	устойчивый
бензилпенициллин	-	устойчивый
ванкомицин	29	чувствительный
амоксициллин	26	чувствительный
левомицетин	22	чувствительный
гентамицин	24	чувствительный
цефотаксим	32	чувствительный

Штамм чувствителен к ванкомицину, амоксициллину, левомицетину, гентамицину, цефотаксиму; устойчив к азитромицину, бензилпенициллину.

Табл. 7.5 Антибиотикочувствительность штамма № 5

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	-	устойчивый
бензилпенициллин	-	устойчивый
ванкомицин	-	устойчивый
амоксициллин	21	чувствительный
левомицетин	12	устойчивый
гентамицин	11	устойчивый
цефотаксим	29	чувствительный

Штамм чувствителен к амоксициллину, цефотаксиму; устойчив к азитромицину, бензилпенициллину, ванкомицину, левомицетину, гентамицину.

Табл. 7.6 Антибиотикочувствительность штамма № 6

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	17	промежуточный
бензилпенициллин	-	устойчивый
ванкомицин	17	чувствительный
амоксициллин	18	чувствительный
левомицетин	14	устойчивый
гентамицин	8	устойчивый
цефотаксим	20	промежуточный

Штамм чувствителен к ванкомицину, амоксициллину; умеренно устойчив к азитромицину, цефотаксиму; устойчив к бензилпенициллину, левомицетину, гентамицину.

Табл. 7.7 Антибиотикочувствительность штамма № 7

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	18	чувствительный
бензилпенициллин	-	устойчивый
ванкомицин	-	устойчивый
амоксициллин	-	устойчивый
левомицетин	12	устойчивый
гентамицин	10	устойчивый
цефотаксим	26	чувствительный

Штамм чувствителен к азитромицину, цефотаксиму; устойчив к бензилпенициллину, ванкомицину, амоксициллину, левомицетину, гентамицину.

Табл. 7.8 Антибиотикочувствительность штамма № 8

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	21	чувствительный
бензилпенициллин	-	устойчивый
ванкомицин	11	устойчивый
амоксициллин	12	промежуточный
левомицетин	22	чувствительный
гентамицин	23	чувствительный
цефотаксим	13	устойчивый

Штамм чувствителен к азитромицину, гентамицину; умеренно устойчив к амоксициллину; устойчив к бензилпенициллину, ванкомицину, цефотаксиму.

Табл. 7.9 Антибиотикочувствительность штамма № 9

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	12	устойчивый
бензилпенициллин	12	промежуточный
ванкомицин	-	устойчивый
амоксициллин	15	чувствительный
левомицетин	10	устойчивый
гентамицин	9	устойчивый
цефотаксим	23	чувствительный

Штамм чувствителен к амоксициллину, цефотаксиму; умеренно устойчив к бензилпенициллину; устойчив к азитромицину, ванкомицину, левомицетину, гентамицину.

Табл. 7.10 Антибиотикочувствительность штамма № 10

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	8	устойчивый
бензилпенициллин	12	промежуточный
ванкомицин	22	чувствительный
амоксициллин	21	чувствительный
левомицетин	8	устойчивый
гентамицин	12	устойчивый
цефотаксим	21	чувствительный

Штамм чувствителен к ванкомицину, амоксициллину, цефотаксиму; умеренно устойчив к бензилпенициллину; устойчив к азитромицину, левомицетину, гентамицину.

Табл. 7.11 Антибиотикочувствительность штамма № 11.

противомикробный препарат в диске	диаметр зон угнетения роста (в мм)	степень устойчивости штамма
азитромицин	29	чувствительный
бензилпенициллин	15	промежуточный
ванкомицин	14	устойчивый
амоксициллин	22	чувствительный
левомицетин	23	чувствительный
гентамицин	30	чувствительный
цефотаксим	22	чувствительный

Штамм чувствителен к азитромицину, амоксициллину, левомицетину, гентамицину, цефотаксиму; умеренно устойчив к бензилпенициллину; устойчив к ванкомицину.

Выводы

1. Все выделенные штаммы являются аэробами либо факультативными анаэробами, что обусловлено аэробными условиями культивирования. Некоторые из них содержат цитохром с оксидазу и, следовательно, способны использовать кислород в качестве конечного акцептора протонов при производстве энергии.

2. В бактериофлоре кишечника пресноводных рыб преобладают грамотрицательные виды.

3. Видовое разнообразие бактерий, обитающих в кишечнике больных рыб, сильно обеднено по сравнению с микрофлорой здоровых особей. Вероятно, такой признак можно использовать для оценки состояния здоровья рыб, еще до начала внешних патологических процессов.

4. Наибольшей устойчивостью к исследованным антибиотикам обладают штаммы № 5, 7, 9; которые были выделены из кишечника здоровых рыб.

5. Бактерии, выделенные из асцитной жидкости, обладают широким спектром чувствительности, в связи, с чем рекомендуется при обнаружении рыб с симптомами сходными с таковыми у исследованной особи рассмотреть вариант антибиотикотерапии с применением амоксициллина или гентамицина.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Артемова Т. З. К вопросу о санитарно-бактериологической оценке качества воды открытых водоемов / Артемова Т. З. // Гигиена и санитария, 1971. - №7. - С. 23-27.

Беликов С. И. и др. Определение таксономического положения бактерий из озера Байкал методом анализа последовательностей фрагментов 16S рРНК / Беликов С. И., Грачев М. А., Земская Т. И., Манакова Е. Н., Парфенова В. В. //Микробиология, 1996.-Т.65, № 6. С.855-864.

Бузолева Л. С. Микробиологическая оценка прибрежных вод. Учебно-полевая практика: учебное пособие / Бузолева Л. С.// Владивосток: Изд. ТИНРО-Центр, 2012. – 72 с.

Васильев Д. А. и др. Методы общей бактериологии: учебно-методическое пособие / Васильев Д. А., Щербаков А. А., Карпунина Л. В., Золотухин С. Н. – Ульяновск, 2003. – 129 с.

Воробьев А. А. и др. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойстваи защитные функции / Воробьев А. А., Лыкова Е. А //Микробиология, 1999. - №6. - С. 102-105.

Гоман Г. Н. Микрофлора воды и грунтов Южной части Байкала / Гоман Г. Н. // Микрофлора почв и водных бассейнов Сибири и Дальнего Востока. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1976. - С. 228-229.

Григорьева Л. В. Санитарная бактериология и вирусология водоемов / Григорьева Л. В.//М.: Медицина, 1975. - С. 5-31.

Жданов В. М. Заразные болезни человека / Жданов В. М. // М.: Медгиз.,1955. – 42 с.

Казимирченко О. В. Экологический анализ грамотрицательной микрофлоры грунтов, воды и европейского угря (Anguilla anguilla L.) Вислинского залива (Балтийское море): дисс. канд. биол. наук / Казимирченко О. В. – Калининград, 2008. - 171 с.

Корш Л. Е. Развитие методов санитарно-микробиологической оценки качества воды и применение их при изучении водоемов: Автореферат дисс. док. вет. наук / Корш Л. Е. - М., 1970. -21 с.

Кочемасова З. Н. и др. Санитарная микробиология и вирусология / Кочемасова З. Н., Ефремова С. А., Рыбакова A. M. - М.: Медицина, 1987. - С. 64.

Крисе А. Е. и др. Количественное распределение гетеротрофных бактерий в юго-восточной части Атлантического океана / Крисе А. Е., Новожилова М. И. // Микробиология, 1970. -Т. 39. - № 5. - С. 892-897.

Кузнецов С. И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность / Кузнецов С. И. - М.:Наука, 1970.

Кузнецов С. И. и др. Микробиологическая характеристика Цимлянского водохранилища / Кузнецов С. И., Романенко В. И. // Микрофлора, фитопланктон и высшая растительность внутренних водоемов. - Л.: Наука, 1967. - С. 10-15.

Кузьмина В. В. и др. Бактерии желудочно-кишечного тракта и их роль в процессах пищеварения у рыб / Кузьмина В. В, Скворцова Е. Г // Успехи совр. биол, 2002 б. - Т. 122. №6. С. 569-579.

Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / Лабинская А. С. – Изд. 4-е, перераб. и доп. – М.: Медицина, 1978. - 394 с.

Лубянскене В. и др. Микрофлора пищеварительного тракта рыб / Лубянскене В., Шивокене Я., Тряпшене О., Лясаускене Л., Грибаускене В. // Acta hydrobiologica Lituanica. 1980. - V. l. - P. 87-94.

Микитюк П. В. и др. Ветеринарно-санитарная экспертиза пресноводной рыбы: Справочник Под ред. П. В. Микитюка / Микитюк П. В., Житенко П. В., Осетров В. С. - М.: Агропромиздат, 1989. - 207 с.

Мосевич М. В. Микроорганизмы, характеризующие загрязнения р. Волги в районе г. Куйбышева / Мосевич М. В. // Тр. Проблем, и тематических совещаний зоол. Ин-та АН СССР, 1969. Т. 7

Методические указания: по санитарно-бактереологической оценке рыбохозяйственных водоемов: ГОСТ 13-4-2/1742. – Введ. 27.09.99г. – М.: Минсельхозпрод России, 1999. - 16 с.

Мун А. И. и др. Диагностика и лечение вибриоза рыб / Мун А. И., Луллу А. В. // Ветеринария, 1983.-№ 7. - С. 43-44.

Паршуков А. Н. Микробиоценоз радужной форели в садковых хозяйствах Карелии: дисс. канд. биол. наук / Паршуков А. Н. – Петрозаводск, 2011.- 182 с.

Петров Е. А. и др. Современное состояние популяции байкальской нерпы (Pusa sibirica, Pinnipedia, Phocidae): питание и упитанность / Петров Е. А., Егоров Л. И. //Зоол. журн. 1998. - 77, №5. - С. 593-600.

Петровская В. Г. и др. Микрофлора человека в норме и патологии / Петровская В. Г., Марко О. П. - М.: Медицина, 1976. - 221 с.

Родина А. Г. и др. Численность и распределение бактериопланктона в Ладожском озере / Родина А. Г., Кузьмицкая Н. К. // Микробиология. - 1963. - Т. 32. - Вып. 2.

Соколова Н. Л. К вопросу Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре (Сб. тез. докл. науч.-практ. конф., Москва, 21-22 ноября 2000 г.) / Соколова Н. Л., Иренков И. П., Борисова М. Н. // М., 2000. - С. 118.

Цыбикжапов А. Д. Микробиологический мониторинг байкальской нерпы и среды ее обитания: дисс. канд. вет. наук / Цыбикжапов А. Д.// Улан-Удэ, 2002. – 154 с.

Шивокене Я. С. Роль микроорганизмов пищеварительного тракта в питании прудовых рыб. 23. Изменчивость физиологических групп микроорганизмов в зависимости от характера питания рыб / Шивокене Я. С. // Труды Академии наук Литовской ССР,1980. Т. 2(90). - С. 77-83.

Шивокене Я. Симбионтное пищеварение у гидробионтов и насекомых / Шивокене Я.// Вильнюс: Мокслас, 1989. - 223 с.

Шивокене Я. С. и др. Численность и биомасса бактерий пищеварительного тракта прудовых рыб в зависимости от особенностей их питания / Шивокене Я. С., Трепшене О. П. // Вопросы ихтиол, 1985. 25. 5. - С. 821-827.

Austin B. Fish need doctoring too! / Austin B. // Microbiology today, 2002. - Vol. 27. - P. 171-173.

Austin В. et al.The effect of antimicrobial compounds on the gastrointestinal microflora of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson7 / Austin В., Al-Zahrani A. Mi J. // Journal Fish Biology, 1998. - Vol. 33. № 1. - P. 1-14.

Barsdate R. J.et al. Photosynthetic organisms in subarctik like ice / Barsdate R. J. Alexander V. // Arctic, 1970. - vol.23. - №3. - P. 201.

Benoit R. et al. Bacteriological profiles and some chemical characteristics of two permanently frozen Antarctic laces / Benoit R., Hatcher R., Green W. //The structure and function of Freshwater Microbial Communities / Ed.J. Cairnes, Jr., 1971.- P. 281-293.

Cahill M. M. Bacterial flora of fishes: a review / Cahill M. M. // Microbiol. Ecology. - Vol: 19. - №1. - 1990. - P. 21-41.

Campbell A. C. et al. The intestinal microflora of farmed Dover sole (Solea solea) at different stages of fish development / Campbell A. C., Buswell J. A. // J. of Applied Bacteriology, 1983. - V. 55. - P. 215-223.

Clements K. D. Fermentation and gastrointestinal microorganisms in fishes / Clements K. D. // Gastrointestinal microbiology. - London and New York: New York, 1997. - V. l. - P. 156-198.

Fidopiastis P. M. Microbial activity in the gut of an herbivorous marine fish / Fidopiastis P. M. // Masters Abstracts International, 1996. - V. 34. - № 3. - P. 1102.

Hansen G. H. et al. Bacterial interactions in early life stages of marine cold water fish / Hansen G. H., Olafsen J. A // Microbiol. Ecology, 1999. - V. 38. - P. 1-26.

Henry D. Isenberg . Clinical Microbiology Procedures Handbook / Henry D. Isenberg . //American Society for Microbiology, 2004. – 332 p.

Hobbie J. E. et al. A study on the distribution and activity of microorganisms in ocean Water / Hobbie J. E., Holm-Hansen W. J. // Limnol. Oceanogr., 1972.- №17. P. 544-555.

Hoff J. C. et al. The accumulation and elimination of crude and claritied poliovirus suspensions bu shelltish / Hoff J. C., Berer R. C. // Am. J. Epid, 1969. -Vol.90. - №1.- P. 53-61.

Horsley R.W. A review of the bacterial flora of teleosts and elasmobranches, including methods for its analysis / Horsley R.W. // J. Fish Biology, 1977. - V. 10. - P. 529-553.

Jankauskiene R. Defence mechanisms in fish: Lactobacillus genus bacteria of intestinal wall in feeding and hibernating carps / Jankauskiene R. // Ekologija (Vilnius), 2000 a. - № l. - P. 3-6.

Jankauskiene R. The dependence of the species composition of lactoflora in the intestinal tract of carps upon their age / Jankauskiene R. // Acta Zoologica Lituanica, 2000 b. - V. 10. - №3. - P. 78-83.

Klen L. River Polution /Klen L. // London: Butterworths, 1962. – 145 p.

KooD D. D. et al. Primary Prodyctivity and associated physsical, chemical and biological characteristics of Lake Bonney: A perennially ice-covered lake in Antarctica / KooD D. D., Leister G. L. // Ln: Antarctic terrestrial Biology,1972. - V. 20. - P.51-68.

Lannasch H. W. et al. Tarmanfarmaion / Lannasch H. W., Eimhjellen K., Wirsep C.O. A-1971.- P. 78.

Lannasch H. W. et al. Bacterial population in sea water as determined by different methods of enumeration / Lannasch H. W., Lones C. E.// Limnol. Oceanogr., 1969. - №4.- P. 128-139.

Larrrin J. M. Seasonal incidence of bacterial temperature types in Louisiana soil and water / Larrrin J. M. // Appl. Microbiol.,1970. - Vol. 20. - №2. - P. 269-289.

Lones J. G. Studies on freshwater bacteria: Facters which influense the population and its activity / Lones J. G. // J.E col., 1971. - V. 59. - P.593-613.

MacFaddin J. F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria / MacFaddin J. F.// 3rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2000. – 367 p.

Olsen R. E. et al. Acute stress alters the intestinal lining of Atlantic salmon, Salmo salarL.: An electron microscopical study / Olsen R. E., Sundell K., Hansen T., Hemre G. I., Myklebust R., Mayhew T. M., Ringo E. // Fish Physiology and Biochemistry, 2002. - V. 26. - P. 211-221.

Ringo E. et al. Lactic acid bacteria in fish: a review / Ringo E., Gatesoupe F.J. // Aquaculture, 1998. - V. 160. - P. 177-203.

Ringo E. et al. Epithelium-associated bacteria in the gastrointestinal tract of Arctic charr (Salvelinus alpinus L.) An electron microscopical study / Ringo E., Lodemel J. B, Myklebust R., Kaino T., Mayhew T. M, Olsen R. E. // J. of Appl. Microbiol., 2001. - V. 90. - P. 294-300.

Ringo E.et al. Intestinal microflora of salmonids: a review / Ringo E., Strem E., Tabachek J.A. // Aquaculture Research. 1995. V. 26. P. 773-789.

Spanggaard В. et al. Antibiotic resistance in bacteria isolated from three freshwater fish farms and an unpolluted stream in Denmark / Spanggaard B., Jørgensen F., Gram L., Huss H. H. // Aquaculture, 1993. - Vol. 115, Issues 3-4. - P. 195-207.

Sugita. H. et al. The establishment of an intestinal microflora in developing goldfish (Carassius auratus) of culture ponds / Sugita H., Tsunohara M., Ohkoshi T., Deguchi Y.// Microbial Ecology, 1988. - Vol. 15. - P. 333-344.

Syvokiene J. et al. Effect of heavy metals on microflora in the digestive tract of the rainbow trout (Salmo gairdneri Rich.) / Syvokiene J, Mickeniene L, Petrauskiene L, Stasitinaite P.// Ekologija (Vilnius), 1995. - № 1. - P. 75-79.

Syvokiene J. et al. The impact of municipal wastewater and heavy metal mixture on larvae of rainbow trout (iOncorhynchus mykiss) / Syvokiene J, Stasitinaite P, Mickeniene L.// Acta Zoologica Lituanica, 2003. - V. 13. - № 3. - P. 372-378.

Tannock G.W. Analysis of the intestinal microflora using molecular methods / Tannock G.W. // European J. of Clinical Nutrition, 2002. - V. 56 Suppl. 4. - P. 44-49.

Trust T.J. Bacteria associated with the gills of salmonid fishes in freshwater / Trust T.J. // J. Appl. Bacteriol., 1979. - Vol. 38. - P. 225-233.

 

Код для цитирования: Скопировать