VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОРСКИХ ПСЕВДОМОНАД, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЙОНОВ С РАЗНОЙ СТЕПЕНЬЮ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКИ
КомментарииПолная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
ВВЕДЕНИЕ
Род Pseudomonas чрезвычайно распространен в природе. Представителей этого вида можно смело назвать вездесущими. Их можно встретить в почве, морских и пресноводных водоемах, воздухе, а также в телах теплокровных животных и на растениях, в их ризосфере. Такое распространение основано на способности бактерий этого рода усваивать самые разнообразные по природе соединения, и расти в различных экологических условиях. Псевдомонады являются убиквистами - организмами, способными занимать различные экологические ниши. Бактерии рода Pseudomonas отличаются необычайной изменчивостью и способностью быстрой адаптации к меняющимся условиям среды обитания. Они обладают высокими темпами размножения, значительной скоростью роста и обширным спектром активности, обуславливающими их возможность трансформировать и утилизировать практически все существующие в природе органические вещества. Эти микроорганизмы приспосабливаются и к новым химическим соединениям, загрязняющим морскую среду. Приспособления эти могут выражаться в изменении, как морфологии, так и генотипа бактерий (Смирнов и др., 1990).
Известна их широкая приспособляемость к условиям среды и жизнестойкость. Они обладают широким спектром ферментов и плазмид способствующих в приспособлении их к изменяющимся условиям существования. Известно, что псевдомонады способны продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов, в том числе антибиотиков.
Бактерии этого рода способны выдерживать мощный антропогенный пресс. Загрязнение водоемов химическими токсическими соединениями, в том числе с мутагенным и генотоксическим действием, влияет не только на состав микробных ценозов, но и приводит к изменениям в генетическом аппарате и соответственно эколого-физиологических свойств собственно микроорганизмов (Цыбань, 2000).
Экологические и эпидемиологические последствия этих изменений еще не определены, но можно предположить, что генетические перестройки способствуют адаптации к химическим элементам и определяют искусственную микроэволюцию микроорганизмов. Подобные приспособления могут сопровождаться приобретением микроорганизмами признаков, представляющих опасность для гидробионтов, наземных организмов и человека.
Поэтому цельюданной работы является: изучение патогенных свойств бактерий рода Pseudomonas, выделенных из морской среды с разной степенью загрязнения.
Для достижения этой цели необходимо выполнить следующие задачи:
-
Выделить штаммы микроорганизмов рода Pseudomonas из районов с разной степенью антропогенного пресса.
-
Исследовать патогенные свойства выделенных штаммов псевдомонад.
-
Дать сравнительную характеристику факторов патогенности псевдомонад, выделенных из районов с разной степенью антропогенного загрязнения.
1.1 Классификация и краткая характеристика отдельных видов бактерий рода Pseudomonas
1.1.1 Классификация
Классификация семейства Pseudomonadaceae в последние годы претерпела значительные изменения. Современная классификация псевдомонад основана на методах молекулярной гибридизации и куль-туральных особенностях микроорганизмов. Некоторые бактерии рода Pseudomonasсравнительно недавно получили новое наименование — Burkholderia.
Современная и предшествующая классификация представителей семейства Pseudomonadaceae в сокращенном варианте представлены в табл.1. (Сидоренко и др., 1999).
Таблица 1 - Классификация семейства Pseudomonadaceae
|
Современная классификация (по гомологии рРНK [2, 3]) |
Предшествующая классификация |
|
Род Pseudomonas (I группа) |
|
|
Pseudomonas aeruginosa |
Pseudomonas aeruginosa |
|
Pseudomonas fluorescens |
Pseudomonas fluorescens |
|
Pseudomonas putida |
Pseudomonas putida |
|
Pseudomonas stutzeri |
Pseudomonas stutzeri |
|
Pseudomonas mendocina |
Pseudomonas mendocina |
|
Pseudomonas alcaligenes |
Pseudomonas alcaligenes |
|
Pseudomonas pseudoalcaligenes и др. |
Pseudomonas pseudoalcaligenes и др. |
|
Род Burkholderia (II группа) |
|
|
Burkholderia mallei |
Pseudomonas mallei |
|
Burkholderia pseudomallei |
Pseudomonas pseudomallei |
|
Burkholderia cepacia и др. |
Pseudomonas cepacia и др. |
|
Род Comamonas (III группа) |
|
|
Comamonas acidovorans |
Pseudomonas acidovorans |
|
Comamonas terrigena и др. |
Pseudomonas terrigena и др. |
|
Род Brevundimonas (IV группа) |
нет |
|
Brevundimonas diminuta |
|
|
Brevundimonas vesicularis |
|
|
Род Stenotrophomonas (V группа) |
|
|
Stenotrophomonas maltophilia |
Pseudomonas maltophilia |
|
Роды с неясной рРНK гомологией |
|
|
Chryseomonas luteola |
Pseudomonas luteola |
|
Flavimonas oryzohabitans |
Pseudomonas oryzohabitans |
|
Shewanella putrifaciens |
Pseudomonas putrifaciens |
|
Sphingomonas paucimobilus |
Pseudomonas paucimobilus |
В составе семейства Pseudomonadaceae по гомологии рРНК и нескольких групп, имеющих гомологичную ДНК, выделяют 5 групп. Pseudomonasaeruginosa относится к роду Pseudomonas (I группа рРНК гомологии) и входит в подгруппу флуоресцирующих, наряду с Ps. fluorescens и Ps. putida. Ранее к роду Pseudomonas относили и других представителей семейства Pseudomonadaceae, однако в настоящее время они выделены в самостоятельные роды, такие как Burkholderia, Stenotrophomonas и др .
Таблица 2 - Неприхотливые и неферментирующие грамотрицательные бактерии рода Pseudomonas (Покровский и др., 1999)
|
Флуорисцирующая группа |
|
Ps. aeruginosa |
|
Ps. fluorescens |
|
Ps. chlororaphis |
|
Ps. putida |
|
недифференцированные виды |
|
Группа штуцери |
|
Ps. stutzeri |
|
Ps. mendocina |
|
Группа алкалигенес |
|
Ps. alcaligenes |
|
Ps. pseudoalcaligenes |
|
недифференцированные виды |
|
Группа псевдомаллеи |
|
Ps. mallie |
|
Ps. pseudomallie |
|
Ps. cepacia |
|
Ps. gladioli |
|
Ps. pickettii |
|
Группа диминута |
|
Ps. diminuta |
|
Ps. vesicularis |
|
Псевдомонады неизвестной гомологии |
|
Ps. paucimobilis |
|
Ps. pertucinogena |
|
Псевдомонадоподобные бактерии |
В последнее десятилетие появились фундаментальные исследования, касающиеся таксономической характеристики отдельных групп и видов бактерий рода Pseudomonas. В этих работах подробно описываются различные морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки некоторых групп, видов или отдельных представителей бактерий этого рода. Представлена таксономическая характеристика 202 штаммов, относящихся к 28 видам псевдомонад. Эти бактерии были разделены на три группы на основании характеристики образуемых ими пигментов.
Флуоресцирующие бактерии. Эта группа объединяет представителей 12 видов бактерий. Все они синтезируют водорастворимые флуоресцирующие пигменты от желто-зеленого, до оранжевого оттенка. Некоторые из них образуют синий пигмент, нерастворимый в воде. Бактерии этой группы активно разлагают углеводы. При росте на средах с гексозами образуют кислоты; на средах с лактозой и крахмалом не развиваются. Потребляют органические кислоты, растут на средах с ароматическими соединениями; аэробы. Восстанавливают нитраты до нитритов. Сероводород и индол не образуют. Распространены в воде, почве, сточных водах.
Ахромогенные бактерии. В эту группу входят бактерии, которые не синтезируют пигментов. Используют сахара, органические кислоты. Восстанавливают нитраты до нитритов. Сероводород и индол не образуют. Выделены из пищевых продуктов (пива, мяса).
Хромогенные бактерии. Эта группа объединяет бактерии 6 видов, выделенных из почвы. Фитопатогенных форм среди них нет. Все бактерии образуют желтый пигмент, нерастворимый в воде; аэробы, восстанавливают и потребляют нитраты, гидролизуют крахмал, образуют сероводород и индол.
Результаты, полученные при сравнении способности использовать различные углеродные соединения, подтверждают правильность разделения бактерий рода Pseudomonas на три группы по признакам пигментации. Все штаммы, отнесенные к флуоресцирующей группе, имеют общие свойства: подкисляют среду при использовании глюкозы, потребляют глюконат, разлагают ароматические соединения, обладают высокой активностью фермента цитохромоксидазы. Всех этих свойств у бактерий, отнесенных к ахромогенной и хромогенной группам, обнаружено не было. Следовательно, существует явная корреляция между характером углеводного обмена бактерий рода Pseudomonas и их пигментацией.
Существует так же таксономическое разделение на группы бактерий рода Pseudomonas на основе их физиолого-биохимических свойств. Изучено 267 штаммов, принадлежащих к 10 видам. Значительная часть таксономических данных была получена путем применения метода, предложенного Дюреном де Йонгом (1926), который заключался в детальном изучении пищевых потребностей у большого количества бактерий. У каждого штамма изучали способность использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 146 органических соединений. Были изучены углеводы, жирные кислоты, органические кислоты, спирты, ароматические соединения, не содержащие азота в кольце, а также углеводороды.
Кроме того, исследовались: потребность бактерий в источниках азота, ростовых факторах, способность к денитрификации и другие физиолого-биохимические признаки.
Цитологические наблюдения включали исследования размера клеток, характера жгутикования, окраску по Граму, образование включений и т. п.
Полученные данные позволили разделить бактерии рода Pseudomonas на три группы: флуоресцирующую, кислотоиспользующую и щелочеобразующую.
В группу флуоресцирующих бактерий включены бактерии, относящиеся в основном к трем видам (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida), и несколько представителей других видов. Все они синтезируют водорастворимый желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, используют нитраты или соли аммония как источники азота, не образуют поли-β-масляную кислоту в качестве резервного материала в клетках.
Эта группа бактерий делится на семь различных биотипов в зависимости от некоторых специфических признаков: способности синтезировать пигменты феназинового типа, образовывать леван из сахарозы, а также по наличию сильных денитрифицирующих свойств.
Кислотоиспользующие бактерии не синтезируют пигментов; они аэробы, лофотрихи. Все образуют в клетках поли-β-оксимасляную кислоту в качестве резервного материала. Кроме этих признаков, описаны некоторые другие свойства, характерные для определенных штаммов, а не для групп бактерий (Колесникова, 1974).
1.1.2 Характеристика представителей различных видов псевдомонад
-
Ps.aeruginosa
Классический представитель рода Pseudomonas. Выраженный хемоорганотроф, строгий аэроб. Основной возбудитель инфекционных поражений человека.
Распространена повсеместно, ее выделяют из почвы, воды, с растений и от животных (водных или обитающих в ареалах с повышенной влажностью). Вода имеет значение в циркуляции бактерии, в ней она может выживать до года (при 37оС), в том числе во многих растворах, применяемых в практической медицине. Иногда входит в состав нормальной микрофлоры человека.
По сравнению с другими видами псевдомонад эти формы наиболее интенсивно исследуются бактериологами, изучающими патогенную группу, и фитопатологами.
Бактерии Ps. aeruginosa обладают особым разнообразием свойств, но, в то же время, у них отмечаются характерные общевидовые морфологические и физиологические признаки. Клетки бактерий представляют собой мелкие палочки (1,0-1,5 × 0,5 мкм), одиночные или соединенные в пары; имеют один-два, редко три полярно расположенных жгутика, грамотрицательные. Растет в широком диапазоне температур (4-42оС). Хорошо растет на простых питательных средах в аэробных условиях при температуре 30-37С. Характерная особенность – образование слизи. Среди этих бактерий встречаются подвижные и неподвижные формы.
Сильно выражена протеолитическая активность. Разжижают желатин, свертывают сыворотку крови, гидролизуют казеин; утилизируют гомоглобин. Синтезируют гиалуронидазу; нитраты восстанавливают до нитритов и далее до молекулярного азота.
Низкая сахаролитическая активность; окисляют только глюкозу с образованием глюконовой кислоты.
Культуры образуют синий флуоресцирующий пигмент, в состав которого входят пиоцианин; зеленый пигмент – флюоресцеин. Некоторые штаммы могут синтезировать и другие пигменты – пиорубин (красный), пиомеланин (черно-коричневый), L-оксифеназин (желтый). Качественный состав пигментов и их количественный набор зависят от условий культивирования, немалое значение имеет и экологический фактор.
Патогенное воздействие Ps. аeruginosa обусловлено образованием веществ, проявляющих свойства экзотоксинов, и высвобождением эндотоксинов при гибели и распаде бактериальных клеток. Экзотоксины представлены продуктами жизнедеятельности с широким спектром активности: экзотоксин А – нарушает организацию матрицы белкового синтеза; экзокоэнзим S – вызывает глубокие патологические процессы в легких; цитотоксин – повышает проницаемость клеточных мембран, что приводит к структурному изменению клеток, также градиентов K+, Na+, Ca+ и глюкозы; гемолизины – приводят к развитию некротический поражений (особенно в печени и легких). Патогенетическое значение эндотоксина оценить трудно. Другой продукт жизнедеятельности - нейраминидаза, который нарушает процессы метаболизма веществ, содержащих нейраминовые кислоты, например, в соединительнотканных элементах.
Бактерии плохо поддаются антибиотикотерапии, что обусловлено множественной резистентностью, в том числе передаваемой R - плазмидами. Возбудитель также устойчив к действию антисептиков и дезинфектантов (Покровский и др., 1999).
-
Ps.(Burkholderia)cepacia
Повсеместно распространенный организм, экология и эпидемиология которого имеет много общего с таковыми у Pseudomonasaeruginosa, но проявляющий меньшую вирулентность.
Подвижная полиморфная палочка, снабженная 3-8 полярно расположенными жгутиками (лофотрихи).
Окисляет глюкозу, лактозу, мальтозу и маннит. По Граму часто окрашивается биполярно. Выделение требует рпименение селективных сред; температурный оптимум 30о С; на кровяном агаре с полимиксином В образует выпуклые мутные маслянистые беловато-серые колонии. Некоторые штаммы синтезируют метиламин, придающий культурам сладковатый запах. Возможно образование желтого или зеленоватого нефлюорисцирующего феназинового пигмента, растворимого в воде и хлороформе (Покровский и др., 1999).
-
Ps. (Burkholderia)mallei
Возбудитель сапа – инфекционного заболевания человека и животных.
Бактерии не устойчивы к действию факторов внешней среды; прямой солнечный свет убивает его за 24 часа. Термолабилен.
Тонкие, слегка изогнутые палочки с закругленными концами размером от 0,5-1 до 2-3 мкм. Склонны к полиморфизму (образование более мелких форм либо цепочек). Неподвижны. Не образуют спор. Строгий аэроб.
Растет на простых средах, температурный оптимум 37оС, pH 6,5-7,2. Хорошо переносит низкие температуры. Образует плоские полупрозрачные колонии. Пигментообразование возможно только на картофельной среде.
Некоторые штаммы разлагают глюкозу, манит, левулезу, глицерин с синтезированием кислоты без газа; не восстанавливают нитраты. Молоко свертывают медленно, не пептонизируют его. Синтезируют H2S и аммиак на жидких средах; каталаза-положительны. Продуцирует эндотоксин.
Сравнительно не стойкие: погибают после кипячения, после высушивания. Не стойки к применению дезинфицирующих средств (Вольпе и др., 1967).
-
Ps.(Burkholderia)pseudomallei
Возбудитель зоонозов, у человека вызывает мелиоидоз. Представляет собой грамотрицательную палочку размером от 0,5-1 до 2-6 мкм с закругленными концами и парным расположением в мазках. Иногда образует нитевидные формы. Обладает подвижностью, которая исчезает в старых культурах. 1-4 жгутика на одном или обоих концах палочки (Вольпе и др., 1967).
Характерным признаком является образование, которое напоминает капсулу; спор не образует.
Хорошо растет на обычных питательных средах. Факультативный аэроб. Температурный оптимум роста – 37оС.
Утилизируют углеводы, аминокислоты, сложные спирты и ароматические соединения в качестве источников углерода и энергии, не образуют кислоты при сбраживании глюкозы (Вольпе и др., 1967).
Большинство штаммов разлагает глюкозу, лактозу, сахарозу, манит, мальтозу и дульцит, свертывает лакмусовое молоко, пептонизирует его, разжижает желатин, растворяет яичный белок. Протеолитические свойства выражены сильнее, чем у mallei. Продуцирует каталазу, не образует сероводорада и индола. Ферментативная активность отдельных штаммов резко варьирует.
В фильтрате старых бульонных культур содержится токсическое вещество, сходное с эндотоксином. В составе токсина различают факторы: летальный, некротический, а также фактор, вызывающий отек и покраснение кожи. Экзотоксин не обнаружен. Вирулентные свойства палочки мелиоидоза являются довольно стойкими и сохраняются годами при пересевах на искусственных питательных средах (Покровский и др., 1999).
-
Ps. Alcaligenes
Грамотрицательные подвижные палочки размером 2-3·0,6-0,8 мкм, спор не образует. На агаризованной питательной среде из кислотного гидролизата рыбной муки на вторые сутки образуются плоские, матовые колонии диаметром 2-3 мм. В бульоне из кислотного гидролизата рыбной муки растет в виде пленки и равномерного помутнения.
Является аэробом, обладает оксидазной и каталазной активностью, растет в температурном диапазоне от 8 до 41°С, оптимум от 26 до 28°С. В качестве источника углерода потребляет ацетат, цитрат, сукцинат, аланин, аргинин. Обладает аргининдигидролазной активностью, восстанавливает нитраты, денитрификационная активность отсутствует. Прототроф, в дополнительных факторах роста не нуждается. Гидролизует желатин, обладает лецитиназной и уреазной активностью. Не гидролизует крахмал и поли- -оксибутират.
Трансформирует ТНТ кометаболически в присутствии цитрата, сукцината.
Не патогенен (не вирулентен, не токсичен, токсигенностью не обладает).
Генетические особенности. Культура устойчива к антибиотикам ампициллину. Устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Fe, Cr, Co - 50 мг/дм 3.
Продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфак-танты). Хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона и ферментативного гидролизата рыбной муки, на синтетических питательных средах, где в качестве источника углерода используются сахароза, пируват, меласса.
-
Другие виды псевдомонад
К виду Ps. aeruginosa близко примыкают бактерии Ps. schuilkilliensis, которые синтезируют сине-зеленый флуоресцирующий пигмент, диффундирующий в субстрат; температурный оптимум развития около 37 °С. Желатин разжижают медленно.
Культуры Ps. syncyanea образуют сине-зеленый флуоресцирующий пигмент. Желатин неразжижают, нитраты не восстанавливают; аэробы. Температурный оптимум развития около 25°С.
Ps. scissa. Клетки мелкие (1,0×0,3мкм, подвижные. Бактерии образуют желто-зеленый флуоресцирующий пигмент. Желатин не разжижают, молоко не изменяют, нитраты восстанавливают до нитритов; аэробы. Оптимум температуры роста около 27 °С. Эти псевдомонады были выделены из воды и почвы. К виду относятся 6 различных штаммов бактерий, обладающих сходными свойствами.
Ps. atlantica. Клетки мелкие, подвижные, с полярным жгутиком; колонии гладкие, блестящие. Культура энергично разжижает агар-агар и желатин, молоко пептонизирует, крахмал разлагает, нитраты не восстанавливает. Бактерии относятся к аэробам. Оптимальная температура роста около 25 °С. Эти псевдомонады были выделены из морской воды (Атлантический океан).
Ps. fluorescens. Мелкие палочки (1-2 × 6 мкм); подвижные; имеют 2-4 полярных жгутика. Бактерии грамотрицательные. Культуры бактерий образуют зеленовато-желтый флуоресцирующий пигмент, который проникает в субстрат. Представители этого вида не синтезируют пиоцианин; хорошо развиваются на органических и синтетических средах. Колонии бесцветные или белые, выпуклые, гладкие, блестящие. Характерной особенностью этого вида является внешняя микроструктура колоний: при малом увеличении микроскопа поверхность колоний имеет характерное сетчатое или ячеистое строение. В бульоне бактерии образуют муть и пленку. Желатин разжижают, молоко не свертывают, нитраты восстанавливают до нитритов, образуют кислоту на глюкозе и сахарозе; аэробы. Оптимальная температура роста около 25 °С. Бактерии часто встречаются в воде, почве, на разных растительных и животных субстратах; не патогенны для животных.
Особое место занимает вид Ps. aurantiaca. Описание морфологических, культуральных и некоторых физиологических свойств бактерий этого вида встречается в основном в работах советских исследователей. Клетки бактерий этого вида палочковидные, 2-3 × 0,6 мкм, подвижные, имеют на конце 2-5 жгутиков. Колонии на питательных средах окрашены в оранжевый или красно-желтый цвет, гладкие, блестящие, плоские или выпуклые. Пигмент диффундирует в субстрат. Культуры хорошо растут на обычных питательных средах; желатин разжижают, молоко пептонизируют. Кислоту образуют при росте на глюкозе, сахарозе, манните, глицерине. Нитраты не восстанавливают, крахмал не разлагают, аэробы. Оптимальная температура роста около 25 °С. В состав оранжевого пигмента входит несколько веществ различной химической природы.
Ps. stutzeri. Грамотрицательные бактерии. Распространены в почве, воде и больничной среде. Растут в анаэробных условиях на средах, содержащих нитраты (образуют свободный азот), на средах с аммонием в качестве источника азота и ацетатом в качестве источника углерода, подвижны (монотрихи).
Ps. alcaligenes. Не образуют пигменты, не утилизируют глюкозу, оксидаза - положительны, подвижны.
Ps. (Commamonas)acidovorans. Не выделяют кислоты при сбраживании глюкозы, подвижны (лофотрихи).
Ps. diminuta. Проявляют слабую биохимическую активность, способны ферментировать первичные спирты с образованием кислоты, подвижны (монотрихи) (Красильников,1949).
1.2 Распространение и морфологические признаки бактерий рода Pseudomonas
1.2.1 Распространение псевдомонад
Бактерии рода Pseudomonas широко распространены в природе. Их можно встретить в воздухе, почве, морских и пресноводных водоемах, сточных водах и иле, нефти и на газовых месторождениях. Псевдомонады были обнаружены на пищевых продуктах, телах животных, растениях, а также в гнойных ранах и эксперементах больных млекопитающих. Такое распространение основано на способности усваивать самые разнообразные по природе соединения и расти в различных экологических условиях. Известна их широкая приспособляемость.
Сравнительное изучение псевдомонад, выделенных из почв и морской воды, показало, что морские виды отличаются большой галотолерантностью, баротолерантностью и строением клеточной стенки, в которой меньше гексазомина, чем у пресноводных штаммов (Мишустина, 1985).
Однако исследования различных ученых показали, что псевдомонады одного вида, выделенные из географически разделенных водоемов, отличаются по своим свойствам. Большое значение в минерализации органического вещества в почве имеют широко представленные в ней псевдомонады. Почвы различных типов и различных географических зон, в том числе и почвы Антарктиды содержат представителей этого рода (Рубан, 1986).
Псевдомонады являются обычным компонентом ризосферы растений. Многие виды псевдомонад развиваются на поверхности высших растений, часто они являются фитопатогенными (Рубан, 1986).
В пластовых водах нефтяных месторождений, а так же в почвах, загрязненных нефтью, найдены псевдомонады.
Рудные месторождения пригодны для развития псевдомонад, которые принимают участие в превращении минералов. Используя низкие концентрации органических веществ, присутствующих в месторождении, они выделяют органические и аминокислоты и другие вещества и тем способствуют растворению и выносу минералов и их компонентов (Каравайко и др., 1979). Горячие источники тоже могут служить местом обитания псевдомонад.
Широкая распространенность псевдомонад обеспечивает их способность развиваться в самых различных условиях в природе, используя самые разные соединения углерода и азота в энергетическом и конструктивном обмене. Различия в физиологии отдельных видов псевдомонад позволяют отдельным представителям этого рода расти или сохранять жизнеспособность и в экстремальных условиях.
1.2.2 Морфология и строение
По Красильникову, бактерии рода Pseudomonas монолитны по морфологическим и очень разнообразны по культуральным и физиологическим признакам.
Клетки псевдомонад представляют собой мелкие одиночные грамотрицательные палочки прямой или изогнутой формы. Средние размеры клеток от 0,5 до 1 мкм в диаметре и до 1,5 - 4,0 мкм в длину.
Клетки многих видов подвижны, особенно в молодых культурах. Органами движения являются жгутики. У большинства видов этого рода жгутики полярные, одиночные, лишенные чехла. Некоторые виды обладают полярно расположенным пучком жгутиков (Ps. viridiflava). У многих видов жгутики одеты в чехлы. Иногда жгутики располагаются латерально, и тогда они короче, чем полярные. У старых культур латеральный жгутик иногда заменяется полярным. Ps. mallei не имеет жгутиков и относится к роду Pseudomonas на основании других признаков. Жгутики псевдомонад обычно превышают длину клетки в несколько раз и различаются по диаметру (Рубан, 1986).
Кроме жгутиков у морских псевдомонад на поверхности имеются трубчатые отростки – шипы (спины) длиной 1 – 3 мкм и диаметром 65 нм.
У многих псевдомонад на поверхности клеток имеются тонкие прямые реснички – фимбрии или пили. Иногда они располагаются по всей поверхности клеток, но у многих видов они расположены полярно.
Оболочка клеток псевдомонад состоит из девяти слоев, в которые входит внешняя мембрана толщиной 7 нм, мукопептидный слой, толщиной до 9 нм, периплазма и цитоплазматическая мембрана, толщиной 7 нм.
Толщина клеточной оболочки у псевдомонад может меняться под влиянием внешних факторов и быть различной у разных штаммов. Состав липополисахаридов не влияет на строение клеточной стенки.
Химический состав клеточной стенки бактерий постоянен и, как правило, не изменяется на различных стадиях развития культуры или при возникновении мутаций. Поэтому он является признаком для таксономической характеристики рода. Например у псевдомонад процент Г + Ц (гуанин + цитозин) в ДНК колеблется в пределах 58-69%.
Цитоплазма – содержимое клетки, не является гомогенным белковым раствором, а пронизана мембранными и тубулярными структурами. В ней находятся рибосомы и нуклеоид.
Лизосомы относятся к спиральному типу и локализованы в области клеточного деления или у полюсов клетки.
В цитоплазме находятся включения запасных веществ в виде капель и гранул (Рубан, 1986).
Колонии бактерий очень разнообразны: слизистые и пастообразные, выпуклые и плоские, крупные и мелкие. У многих видов отмечается внутренняя структура колоний. Если их рассматривать в микроскопе при малом увеличении, то в одних случаях можно обнаружить мелкозернистую колонию; в других — ячеистую, напоминающую соты; в третьих — колонии в виде мелких комочков или зерен.
Большинство видов имеет колонии без внутренней структуры — под микроскопом они выглядят как однородная гомогенная масса. Цвет колоний желтый, оранжевый, белый, иногда они опалесцируют.
Культуры различаются между собой способностью разлагать белки, использовать углевод, расщеплять крахмал, клетчатку, углеводороды, соединения ароматического ряда и другие сложные по составу вещества.
Большинство бактерий рода Pseudomonas обладает гетеротрофным типом обмена веществ, т. е. для построения тела им требуется готовое органическое вещество. Биосинтетические процессы при этом осуществляются за счет обмена окислительного типа, где кислород является конечным акцептором электронов, перенос которых связан с системой цитохромов. Некоторые представители этого рода могут существовать за счет анаэробного нитратного дыхания, другие используют энергию окисления водорода. Многие виды псевдомонад образуют пигменты, различные по окраске и химической природе; некоторые синтезируют витамины, антибиотики, токсины.
Среди представителей бактерий рода Pseudomonas есть формы, токсичные для животных организмов (патогенные бактерии). Имеется также немало фитопатогенных видов, поражающих растения (Смирнов и др., 1990).
1.3 Влияние различных факторов среды на размножение бактерий
Важнейшей физиологической особенностью микроорганизмов является их способность адаптироваться к различным условиям окружающей среды – низкой температуре и высокому давлению, повышенной концентрации солей и различным токсическим веществам неприродного происхождения и т.д.
Большинство факторов внешней среды оказывают решающее влияние на характер метаболизма клетки, в первую очередь, действуя на скорость различных ферментативных реакций или целостность клеточной организации. Изменение этих факторов неизбежно приводит к перестройке клетки, как единой функционирующей системы, и время, требуемое для такой перестройки, является периодом адаптации.
Основными из этих факторов среды являются:
1) температура;
2) концентрация водородных ионов;
3) окислительно-восстановительный потенциал;
4) состав газовой фазы;
5) осмотическое и гидростатическое давление;
6) ионная сила жидкой фазы;
7) уровень радиации
Микроорганизмы обладают способностью нормально функционировать в относительно широком диапазоне изменений этих факторов окружающей среды. Однако для любого из этих факторов имеются экстремальные точки, приближение к которым приводит к угнетению жизнедеятельности, а достижение вызывает гибель данного микроорганизма.
1.3.1 Влияние температуры на рост псевдомонад
Температурные границы для развития большинства видов псевдомонад довольно широки (4 – 430 С). Многие виды этого рода являются мезофилами и развиваются при 27-300 С. Но встречаются темофильные и психрофильные штаммы (некоторые развиваются даже при отрицательных температурах). Последние обладают большой устойчивостью процесса синтеза белка к низким температурам и высокой активностью гидролитических ферментов (Рубан, 1986).
Не обладая способностью образовывать покоящиеся формы типа спор, цист, псевдомонады выдерживают длительное обезвоживание без потери жизнеспособности.
1.3.2 Влияние гидростатического давления на рост псевдомонад
При изучении действия гидростатического давления в 686,8*105 Па на бактерии было установлено, что синтез белка осуществляется или задерживается в этих условиях у разных микроорганизмов независимо от их места обитания, физиологической или таксономической группы. На способность синтезировать белок в большей или меньшей степени при высоком гидростатическом давлении влияет количество 30 S рибосом (Рубан, 1986).
При культивировании в условиях высокого гидростатического давления баротолерантный штамм Ps. аeruginosa, выделенный из Курило-Камчатской впадины, образует внеклеточные кето- и аминокислоты. Скорость роста и синтеза белка падают по мере повышения давления. При нормальном 1,01*105 Па давлении в культуральной жидкости накапливается аланин, при 202*105 Па в среду выделяется валин, при 505*105 Па аминокислоты не накапливались. При всех испытанных давлениях в среду выделялись пировиноградная, 2-кетоглютаровая и щавелевоуксусная кислоты.
1.3.3 Влияние кислорода на развитие псевдомонад
Псевдомонады строго аэробны, за исключением видов, способных осуществлять процесс денитрификации, при котором нитраты являются для них конечным акцептором электронов.
Облигатная аэрофильность многих представителей псевдомонад обуславливает их развитие в поверхностных слоях воды естественных водоемов.
Рост и дыхание клеток псевдомонад имеют собственные пороговые значения концентраций растворенного кислорода. Замедление роста культур многих видов псевдомонад замедляется при снижении концентрации растворенного кислорода на 30-50% от насыщения, а критическая концентрация в среде для дыхания составляет 11-17% от насыщения. Следовательно, критическая концентрация кислорода для роста выше, чем для дыхания, в 2 – 3 раза.
В некоторых случаях можно заменить кислород воздуха такими «концентраторами кислорода», как перекись водорода.
Многие микроорганизмы при переходе в стационарную фазу роста обнаруживают цианидрезистентное дыхание. Так как обычное дыхание и потребление кислорода резко подавляется цианидом, для объяснения этого явления были предприняты исследования, показавшие, что цианид не подавляет специфическую оксидазу, локализованную в цитоплазматической мембране клеток. Этот фермент акцептирует электроны на участке убихинон-цитохром в основной дыхательной цепи. Цианидрезистентное дыхание не сопровождается образованием перекиси водорода
1.3.4 Влияние двуокиси углерода на рост псевдомонад.
Подавляющее действие двуокиси углерода при повышенном ее содержании в среде показано для многих микроорганизмов, в том числе и для нескольких видов псевдомонад.
Но подавление их роста бактерий неполное и достигается при относительно низких парциальных давлениях этого соединения. С понижением температуры степень ингибирования роста возрастает у всех видов, кроме нефлюорисцирующего штамма. Эндогенное дыхание не подавляется углекислым газом, а низкие концентрации его даже стимулируют этот процесс.
Влияние двуокиси азота на рост псевдомонад зависит от особенностей обмена штамма, состава среды и температуры культивирования.
При культивировании микроорганизмов в жидких средах происходит растворение двуокиси углерода в культуральной жидкости и частичное выделение в газообразной форме.
Транспорт углекислого газа через среду изменяется во времени. Уровень его десорбции зависит от концентрации газа в среде, а она, в свою очередь, находится в равновесии с парциальным давлением выделенного газа.
Итак, отношения гетеротрофных видов псевдомонад к двуокиси углерода сложны и определяются спецификой обмена отдельных видов, составом среды, температурой культивирования и соотношением растворенной и газообразной углекислоты. Хемоавтотрофные виды псевдомонад используют двуокись углерода для синтеза веществ клетки (Кондратьева, 1983).
1.3.5 Адаптация микроорганизмов к антропогенному загрязнению
В последние годы большое внимание уделяется изучению механизмов адаптации микроорганизмов к новым физико-химическим условиям, складывающимся в природных средах под влиянием антропогенных факторов. Воздействие загрязняющих веществ в условиях современного состояния Мирового океана превратилось в мощный эволюционный фактор. Присутствие в морской среде разных минеральных и органических веществ, в том числе ксенобиотиков, создает предпосылки для возникновения изменчивости морских микроорганизмов и приводит за счет направляющего отбора к активному развитию популяций, которые, адаптировавшись к новым химическим условиям, вытесняют из экосистемы другие, не приспособившиеся к воздействию чужеродных веществ, организмы (Цыбань, 2000).
Вся литература о биологических процессах в океане свидетельствует о появлении в хронически загрязненных районах морской среды доминирующих микроорганизмов, которые получили название индикаторных. И есть основания полагать, что распространение и массовое развитие этих индикаторных форм относится к числу важнейших биологических откликов на химическое загрязнение Мирового океана. Биологическая целесообразность появления индикаторных видов определяется их особым назначением: они заполняют «бреши» в биоценозах, образовавшиеся в результате негативного антропогенного воздействия и помогают их восстановлению, участвуя, таким образом, в сохранении устойчивости морских экосистем.
Микроорганизмы способны утилизировать все имеющиеся в природе органические вещества, причем необходимые для этого ферменты синтезируются в их клетках по мере необходимости. Благодаря этому микроорганизмы быстро реагируют на появление в морской среде новых химических соединений природного или антропогенного происхождения. Так, например, в настоящее время широко известен феномен резкого увеличения численности (на 3-5 порядков величин) углеводородокисляющих бактерий в морских акваториях, загрязненных в результате аварийных разливов нефти и нефтепродуктов.
Гетеротрофные микроорганизмы, которые за счет изменений генотипа адаптировались к повышенным концентрациям органических загрязняющих веществ, в том числе токсичных, приобрели и способность их разрушать. Ориентируясь на современный уровень развития энзимологии и генетики, можно полагать, что в основе адаптации морских микроорганизмов к новым химическим условиям лежит либо индукция новых функционально активных ферментов, либо приобретение бактериями способности к катаболизму новых органических соединений в результате мутаций в структурных или регуляторных хромосомных генах. Механизм использования внехромосомного (плазмидного) резерва генетической информации представляется наиболее вероятным при реализации микробной клеткой адаптационных возможностей.
В настоящее время полагают, что плазмиды биодеградации представляют собой хорошую модель, иллюстрирующую эволюционный потенциал микроорганизмов. При этом существенно, что перенос плазмид между штаммами микроорганизмов играет большую роль в реакции природных популяций микрофлоры на присутствие пестицидов, т.е. определяют активность их микробной трансформации в природной среде (Цыбань, 2000).
Влияние различных химических веществ
Псевдомонады способны приспосабливаться к различным химическим соединениям, могут аккумулировать, либо разлагать их.
Имеется много сведений о культурах бактерий, способных вести расщепление СПАВ, но признанным является утверждение о том, что в наибольшей степени эта способность присуща гетеротрофным грамотрицательным палочковидным бактериям, в первую очередь представителям рода Pseudomonas.
Некоторые штаммы псевдомонад используют для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от тринитротолуола. Штамм PseudomonasalcaligenesBS300 продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию тринитротолуола в водной среде и почве. Известны штаммы микроорганизмов: Pseudomonasfluorescens I-C, Pseudomonassavastanoi, Pseudomonasputida, которые могут разлагать ТНТ в почве и воде(Воробьев и др., 2004).
При незначительной концентрации в воде нитритов (от 0,2 до 2 г/л) сроки выживания в воде бактерий рода Pseudomonas увеличиваются. Концентрации нитритов 20 г/л. наоборот, ингибируют развитие бактерий. Фосфаты увеличивали сроки сохранения бактерий.
Влияние тяжелых металлов
Особое положение тяжелых металлов среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью (Reddy et al., 1990). Микроорганизмы могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных металлов, поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к тяжелым металлам отличаются микроорганизмы, выделенные в местах, содержащих промышленные загрязнения, либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др., 1977).
Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами привело к распространению в почве и воде индустриальных районов микроорганизмов, устойчивых к металлам. Во многих случаях резистентность к тяжелым металлам детерминируется плазмидами (Silver et al.,1988).
Известно, что одним из факторов токсичности катионов тяжелых металлов для бактериальных клеток является нарушение барьерных свойств их цитоплазматическое мембраны (ЦПМ). Изменение барьерных характеристик ЦПМ бактерий, сопровождающееся утечкой внутриклеточного калия и уменьшением электропроводности цитоплазмы, выявляется методом электроориентационной спектроскопии клеток (Иванов, 1996).
Влияние катионов тяжелых металлов и анионного детергента додецилсульфат натрия на барьерные свойства цитоплазматической мембраны Cо-чувствительного штамма PseudomonasputidaBS394 и Со-резистентных, дикого Pseudomonassp. BS501 и трансформанта PseudomonasputidaBS394 (pBS501),содержащих плазмиду pBS501 было исследовано с помощью высокочастотной электроориентационной спектроскопии.
Установлено, что по степени повреждения ЦПМ клеток этих штаммов ионы металлов имели ряд: медь > кобальт > никель. Устойчивость ЦПМ клеток изучаемых штаммов бактерий к повреждающему действию ионов меди и кобальта возрастала в следующей последовательности: P. putidaBS394 < P. putidaBS394(pBS501) < Pseudomonassp. BS501, а для детергента имела обратной порядок. Изучение природы клеточной поверхности интактных и обработанных трипсином бактерий микроэлектрофорезом показало присутствие повышенного содержания белка в поверхностных слоях оболочек клеток дикого штамма и трансформанта. Анализ поверхностных белков клеточных оболочек выявил у Со-резистентных штаммов общие белки с молекулярными массами 49, 40 и 32 кДа. Обработка трипсином резистентных клеток значительно снижала устойчивость их ЦПМ к ионами кобальта. Предполагается, что устойчивость ЦПМ к повреждающему действию ионов тяжелых металлов у клеток дикого штамма и трансформанта детерминируется плазмидой pBS501 и связана, в том числе, с синтезом защитных белков поверхностного слоя клеточной оболочки (Анисимова и др., 1994).
Известно, что бактерии рода Pseudomonas так же являются наиболее активными биоаккумуляторами ванадия (Rehder, 1991).
Адаптации микроорганизмов к ядам По характеру действия на клетку все яды можно разделить на две группы: а) неспецифического, или общего действия; б) специфического или локального действия. Яды общего действия вызывают гибель любого организма, обратимо или необратимо денатурируя белки и другие жизненно важные биополимеры клетки. В связи с отсутствием специфического действия таких ядов на элементы метаболизма, адаптация к ним микроорганизмов сходна с адаптацией ко многим другим факторам среды, так же не имеющим избирательного воздействия на бактерии (Кондратьева, 1984).Яды специфического действия названы так потому, что их ингибирующий или летальный эффект обусловлен наличием в клетке участков обмена, на которые эти яды действуют, выключая их тем или иным образом из активного состояния и нарушая этим целостность метаболизма клетки. Другими словами, задержка роста микроорганизма или его гибель вызваны действием яда на какие-то системы, уже имеющиеся в клетке (Карасевич, 1975).
К большинству ядов специфического действия микроорганизмы адаптируются сравнительно легко.
1. Устойчивые формы микроорганизмов могут возникнуть в результате изменения проницаемости клеточной мембраны для данного яда. Он более не проникает в клетку или же, если и проникает, то не накапливается в заметных количествах. В ряде случаев снижение проницаемости обусловлено утратой специфических пермеаз или изменением их сродства к данному яду (Tristram et al., 1968). Если яд переносится в клетку пермеазой, специфичной для определенного метаболита, возможна конкуренция между естественным субстратом пермеазы и ядом. Известны случаи физиологической адаптации к ядам специфического действия в результате инактивации систем активного переноса. У Pseudomonasaeruginosa аналоги некоторых аминокислот репрессируют синтез специфических пермеаз, тогда как натуральные аминокислоты являются индукторами этих же систем (Kay et al., 1969). Репрессия биосинтеза пермеаз приводит к возрастанию устойчивости. Экспериментально доказано, что при прекращении действия яда на клетки, устойчивость быстро утрачивается, так как возобновляется синтез пермеаз (Карасевич, 1975).
Антибиотики так же являются для микроорганизмов ядами специфического действия. Устойчивость к ним у многих патогенных бактерий обеспечивается снижением скорости поступления этих веществ внутрь клетки (Franklin, 1967) или повышением выхода их из организма (Лопатик и др., 1973).
2. Устойчивость у микроорганизмов развивается в результате появления способности либо разрушать данный яд, либо инактивировать его. Наиболее известными примерами этого случая адаптации являются синтез фермента в-лактамазы, разрушающего пенициллин (Citri et al., 1966).
Развитие ферментных систем, инактивирующих яд, следует рассматривать как пример физиологической адаптации. В этом случае адекватность реакции микроорганизма на воздействие фактором адаптации определяется состоянием генотипа и, как правило, не сопровождается его изменением. Наиболее интересная разновидность такой адаптации к ядам – это использование их в качестве единственного источника углерода, азота и энергии. Это может лежать и в основе адаптации к ядам общего действия (Карасевич, 1975).
3. Появление устойчивых форм микроорганизмов возможно в результате индукции ферментов, нечувствительных к данному яду (Яковлев,2007).
4. В основе адаптации к ядам может лежать утрата (генетическая или функциональная) чувствительного к яду звена обмена. При этом иногда у микроорганизмов развивается альтернативный путь обмена (Avers et al., 1965).
Микроорганизм легко переносит такие изменения, если среда позволяет ему нормально расти и размножаться.
Адаптация может возникнуть и при включении такого регуляторного механизма, как репрессия. В результате этого нарушения микроорганизм может образовывать и выделять в среду избыточное количество соответствующее количество метаболита, который вступает в конкурентные взаимоотношения с соответствующим антиметаболитом (Мишустина, 1985).
Частным случаем непосредственной причины адаптации подобного типа является развитие устойчивости в результате заметного снижения скорости синтеза фермента, переводящего определенный яд в активную форму. Как правило, сродство аналога к активному центру фермента ниже, чем естественного субстрата. При снижении концентрации такого фермента в клетке скорость синтеза активной формы яда резко снижается. Такие микроорганизмы, хотя и медленно, но растут в присутствии соединения, тормозящего рост исходной культуры (Brockman et al., 1961).
5. Одной из наиболее интересных непосредственных причин адаптации к ядам специфического действия является такое изменение чувствительного звена обмена, при котором токсический эффект более не проявляется или заметно ослаблен. Это может происходить как следствие изменения белков рибосом, или под действием мутагенов.
Таким образом, причины адаптации микроорганизмов к действию различных ядов могут быть связаны как со стойким изменением генотипа, так и с реализацией потенциальных генетических возможностей. Бесспорно, что в основе различной реакции на яды лежит специфичность генетического аппарата микроорганизмов.
Известно, что микроорганизмы одного вида, но разных штаммов ведут себя в процессе адаптации к одному и тому же яду по-разному. Такую специфичность определяет состояние генотипа микроорганизма (Карасевич, 1975).
1.3.6 Ингибиторы роста псевдомонад
Вещества, подавляющие рост псевдомонад, в большинстве своем являются обычными ингибиторами и для других микроорганизмов, но этот род имеет некоторые особенности.
Так, необычно отношение некоторых видов псевдомонад к присутствию метионина в среде. Добавление метионина в количестве 1-10 мМ к культуре Ps. fluorescens ИК-1, находящейся в стадии экспоненциального роста, полностью прекращает рост клеток на 30-60 минут после внесения метионина, затем рост возобновляется и сопровождается выходом в среду тиометильных групп. Синтез белка сокращается на 60%, скорость синтеза РНК остается постоянной.
Ингибирование размножения клеток происходит из-за разобщения координирования процессов синтеза белка и РНК после добавления метионина.
Некоторые фторсодержащие аналоги органических кислот являются ингибиторами роста псевдомонад и могут влиять на катоболизм основного источника углерода.
Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) влияет на некоторые свойства синегнойной палочки. Клетки после обработки ЭДТА в присутствии ионов кальция и магния теряют вирулентность по отношению к опытным животным, замедляют размножение и снижают чувствительность к фагоцитозу. Культивирование на среде с ЭДТА, кальцием и магнием приводит в дальнейшем к восстановлению вирулентности, скорости размножения и чувствительности к фагоцитозу.
Сорбат ингибирует рост Ps. fluorescens за счет подавления дыхания и в меньшей степени снижает синтез белка, РНК и ДНК.
Изменяя кислотность среды, алифатические спирты являются косвенными ингибиторами роста, и возможно, что выравнивание рН может снять их вредное действие.
Ингибирующие действие различных соединений на рост псевдомонад проявляется опосредовано в зависимости от присутствия в среде веществ, не обладающих ингибирующим действием, а для заключения об отсутствии или наличии ингибирующего действия следует использовать многие источники углерода. Таким источниками являются одноуглеродные соединения, органические кислоты, смесь ацетата и формиата, глюкозы, смесь ацетата и оксалата, фиалата и др. (Рубан, 1986).
1.3.7 Антибиотикочувствительность псевдомонад
Наиболее активные антибактериальные препараты - карбапенемы (имипенем и меропенем). Было детально изучено разнообразие фенотипов антибиотикорезистентности штаммов P. aeruginosa, выделенных от больных с госпитальной инфекцией. Результатами этого стало выявление у синегнойной палочки 53 различных фенотипов антибиотикорезистентности, среди которых значительно доминировал панрезистентный (т.е. устойчивый ко всем включенным в исследование антимикробным препаратам). На его долю приходилось 22,2% от общего количества изолятов. В рамках многоцентрового исследования распространения антибиотикорезистентности среди внутрибольничных штаммов P. aeruginosa был проведен фенотипический скрининг потенциальных продуцентов металло-бета-лактамаз (Иванов и др., 2007).
Установлено, что P. aeruginosa обычно характеризуются устойчивостью ко многим потенциально эффективным антибиотикам, в частности антипсевдомонадным пенициллинам и цефалоспоринам, в том числе ингибиторозащищенным, карбапенемам, аминогликозидам, фторхинолонам (Яковлев, 2007).
Последние годы характеризовались увеличением устойчивости P. aeruginosa практически ко всем антибактериальным препаратам, за исключением полимиксина. Множественная устойчивость P. aeruginosa к антибиотикам объясняется тем, что микроорганизм способен формировать резистентность с помощью разных механизмов, часто сочетающихся. Например, устойчивость к β-лактамным антибиотикам может быть опосредована нарушением проницаемости микробной клетки для антибиотика (Яковлев, 2007).
1.3.8 Генетические механизмы адаптации Генотип организма определяет его норму реакции при жизни в определенных условиях окружающей среды и при изменении этих условий. От генотипа зависит возможность и характер адаптации (Ivanov et al.,1996).В основе адаптивной изменчивости, если при этом имеют мест стойкие изменения, передающиеся по наследству, лежат неадекватные изменения генотипа. В этом смысле любое изменение генотипа можно назвать мутацией (Nagase et al., 1994).
Если обозначить весь генотип организма общей генетической информацией, которая делится на полезную ("работающую") и скрытую генетическую информацию, то можно выделить следующие случаи механизмов генетической адаптации (Карасевич, 1975).
-
Клеточная организация может измениться без изменения количества общей и полезной информации, за счет изменения качества полезной информации.
-
Изменение клеточной организации может произойти за счет уменьшения количества полезной информации без изменения количества общей информации, в результате перехода части полезной информации в скрытую.
-
Изменение клеточной организации может произойти за счет возрастания количества полезной информации, без изменения количества общей информации, в результате перехода части скрытой информации в полезную.
-
Изменение клеточной организации может произойти за счет увеличения количества общей и полезной генетической информации в результате включения в генотип клетки дополнительного количества генетической информации.
-
Изменение клеточной организации может произойти за счет уменьшения количества общей и полезной генетической информации в результате утраты клеткой части генотипа.
-
Увеличение или уменьшение количества скрытой информации в результате увеличения или уменьшения количества общей генетической информации, что может иметь решающее значение при поведении микроорганизма в процессе адаптации и оказать большое влияние на его способность к приспособлению (Карасевич, 1975).
Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы относятся к основным компонентам биологического загрязнения и их соотношение отражает уровень этого загрязнения. Учитывая, что гены, ответственные за патогенные свойства, часто локализуются в плазмидах, можно предположить, что они могут мигрировать в клетки сапрофитных бактерий. Одним из таких потенциальных патогенных свойств микроорганизмов является цитопатическое действие (ЦПД) (Reddy et al.,1990).
Патогенность.Представители разных форм жизни в ходе эволюции приобрели способность при попадании в организм хозяина не только выживать, но и наносить ему вред.
Инфекцию обычно рассматривают как форму паразитизма, эволюцию которого можно представить следующими этапами:
-
случайный
-
факультативный
-
облигатный (внеклеточный, факультативно-внутриклеточный или облигатно-внутриклеточный).
Для случайных паразитов пребывание в организме хозяина является кратким эпизодом по сравнению с периодом обитания в других средах. Факультативные паразиты сохраняют способность к самостоятельному существованию во внешней среде. Облигатные паразиты являются зависимыми от своего хозяина и неспособны к самостоятельному существованию во внешней среде (Rehder, 1991).
Ввиду сложившихся закономерностей возникновение и развитие инфекционного процесса зависит от ряда условий: патогенный и достаточно вирулентный возбудитель должен попасть в инфицирующей дозе через ворота инфекции в восприимчивый неиммунный или ослабленный макроорганизм. Главным из этих условий является наличие у микроорганизма патогенного потенциала - патогенности.
Патогенностью называют выработанную в ходе эволюции способность микроорганизмов определенного вида при попадании в восприимчивый организм (среду хозяина) вызывать развитие инфекции. Патогенность является качественным наследуемым признаком всех представителей данного биологического вида. Этот признак надо рассматривать применительно к конкретному хозяину: патогенный для человека вид может быть непатогенным для животных и наоборот. В соответствии с наличием и величиной патогенного потенциала микробные виды принято делить на 3 группы: безусловно-патогенные (патогенные), потенциально-патогенные (условно-патогенные, оппортунистические) и непатогенные (Silver, 1988).
Микроорганизмы безусловно-патогенных видов, как правило, не встречаются в составе нормальной микрофлоры здорового организма хозяина и при попадании в него всегда вызывают развитие инфекции. Их нозологическая специфичность заключается в своеобразии закономерно развивающегося инфекционного процесса (Corynebacterium diphtheriae вызывают только дифтерию, Salmonella typhi - брюшной тиф и т.д.). В свою очередь специфику инфекционного процесса (клинические проявления, динамику, исход заболевания) определяют входные ворота инфекции, пути распространения в организме хозяина, поражаемые ткани и характер поражений, что зависит от конкретных патогенных свойств того или иного возбудителя. Инфекции, вызываемые такими возбудителями, называют классическими (Silver, 1988).
Микроорганизмы потенциально-патогенных видов довольно часто обнаруживаются в составе микрофлоры здоровых людей и вызывают развитие инфекции лишь при особых условиях (дефекты или общее снижение антиинфекционной резистентности организма, массивность заражения, попадание в организм варианта возбудителя с повышенным патогенным потенциалом). Развивающийся при этом инфекционный процесс, как правило, не имеет выраженной специфики: для возбудителей этой группы характерен широкий диапазон поражаемых тканей, вариабельность по тяжести и динамике заболевания (Rehder, 1991).
Врачебная тактика существенно отличается при классических и оппортунистических инфекциях. Так, обнаружение в клиническом материале безусловно-патогенного микроорганизма (в любом количестве) однозначно подтверждает диагноз, в случае условно-патогенного для этого потребуются дополнительные обоснования.
Микроорганизмы непатогенных видов (например, Saccharomyces cerevisiae - пекарские дрожжи, Lactococcus lactis - молочнокислый стрептококк и многие другие) не обладают патогенным потенциалом и, как правило, не способны вызвать инфекции.
Вирулентность.Каждый штамм или клон микроорганизмов патогенного или условно-патогенного вида имеет свою (индивидуальную) степень выраженности патогенного потенциала - вирулентность. В отличие от патогенности, эта характеристика имеет количественное выражение, которое может меняться (под влиянием различных причин) у одного и того же штамма (Красильников, 1949)
Вирулентность складывается из ряда патогенных свойств микроорганизма: адгезивности (способности микроорганизма распознавать и прочно связываться с поверхностью клеток хозяина), инвазивности (способности к внутриклеточному и внеклеточному проникновению и распространению возбудителя в тканях хозяина), персистентных свойств (антифагоцитарные, антикомплементарные, антигенная мимикрия и др.) - способности уклоняться от защитных реакций макроорганизма или преодолевать их; цитотоксичности (способность повреждать клетки хозяина); токсичности и токсигенности (способность к синтезу токсинов, нарушающих функции органов и систем хозяина) (Вольпе и др., 1967).
Штаммы могут быть сгруппированы по выраженности отдельных патогенных свойств, например, высокоинвазивные, умеренно- или низкоинвазивные, неинвазивные. В соответствии с наибольшей выраженностью того или иного патогенного свойства микроорганизмы могут получать специальные названия и обозначения, например, энтеротоксигенная кишечная палочка, выделяющая экзотоксин с преимущественным действием на кишечный эпителий.
Выраженность патогенного свойства зависит от наличия у микроорганизма соответствующих генов патогенности и контролируемых ими факторов патогенности - структур и веществ, обеспечивающих взаимодействие с макроорганизмом в ходе инфекции. К факторам патогенности, в частности, относят многие поверхностные структуры микроорганизмов (ворсинки, капсулу), компоненты наружной мембраны и клеточной стенки (липополисахарид, белки адгезины и инвазины, тейхоевые кислоты), выделяемые возбудителем ферменты и токсины. Изменение вирулентности штамма может быть результатом приобретения или утраты тех или иных факторов патогенности, а также следствием изменения выраженности патогенных свойств. В основе этих процессов лежат закономерности функционирования генов патогенности, мутации, а также перенос генов между микроорганизмами одного или разных видов (Вольпе и др., 1967).
ГЛАВА 2. МЕСТО ОТБОРА ПРОБ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Место отбора проб
Для проведения микробиологический иcследований были выбраны прибрежные акватории Японского моря, отличающиеся природными особенностями, характером и степенью антропогенный нагрузки. Район работ включал акватории бухты Золотой Рог, испытывающие значительное влияние промышленных, бытовых и речных стоков, бухты Круглая, а также бухты Киевка, не обремененные значительными нагрузками антропогенного характера.
Бухта Золотой Рогвпадает в северный берег пролива Босфор Восточный, между мысом Тигровым и мысом Голдобина. С северо-запада бухта ограничена полуостровом Шкота. Берега бухты почти на всем протяжении укреплены стенками, оборудованными причалами.
Глуби на входе в бухту – 20-27 м, к кутовой части они постепенно уменьшаются. Грунт в бухте – ил. Летом преобладают южные и юго-восточные ветры, осенью – северные и северо-западные. Зимние и осенние ветры более продолжительные и сильные, чем весенние и летние. Приливы в бухте не правильные полусуточные.
Бухта используется для судоходства круглый год. Здесь расположена основная часть причальных сооружений порта Владивосток, грузооборот которого составляет 4,5-7,5 млн. тонн в год (Вахненко,1998).
Объем годового стока в бухту от разнообразных источников в 4,6 раза превышает объем воды ее акватории. Основными источниками загрязнения являются сточные системы городской канализации, судоремонтные предприятия, крупные городские порты, река Объяснения, которая принимает сточные воды большого количества объектов, и воды которой используются в системе оборотного снабжения ТЭЦ (Гаврилевский, 1998). Многие исследователи характеризуют кутовую часть бухты как экологически “мертвую зону” (Ващенко, 2000). Река Объяснения во многом обуславливает особенности гидрологического и экологического режима бухты. С одной стороны, она вносит дополнительное загрязнение, в том числе и тепловое, ас другой – устанавливает режим более интенсивной циркуляции, благоприятствующей выносу загрязняющих веществ и самоочистке. Часть акватории практически постоянно покрыта нефтяной пленкой, толщина которой у берегов может достигать 100 мкм, в донных осадках толщина отложений нефтесодержащих отходов составляет от 1 до 3 метров. В воде и грунтах высоко содержание техногенных металлов, фенолов, хлоорганических и поверхностно-активных соединений (Ващенко, 2000). Суммарный объем стоков, ежегодно поступающих в бухту, равен в среднем 263550,6 тыс. м3 , что составляет 53,6 % общего объема сточных вод, попадающих во внутренние акватории залива Петра Великого.
Бухта Киевка вдается в берег между мысом Суткового и мысом Островной. Северозападный и восточный берега бухты высокие, а берег вершины отмел и окаймлен песчаным пляжем. К берегу вершины бухты выходит низменная долина, по которой протекает река Киевка. Берега бухты поросли лесом и кустарником. Река впадает в бухту двумя рукавами, из которых западный является главным. Долина реки в нижнем течении имеет значительную ширину и поросла в основном травой и кустарником.
Вдоль берегов бухты в прибрежной полосе разбросаны островки, скалы, банки и осыхающие рифы.
Глубины на линии входных мысов бухты 14—24 м. Грунт в бухте Киевка преимущественно песок или песок с илом.
Бухта используется для судоходства. Суда становятся на якорь в северо-восточной части.
Бухта Круглая, защищенная от юго-восточных ветров, незначительно вдается в северо-западный берег полуострова Брюса в 1,4 мили к WSW от мыса Брюса. Входные мысы бухты скалистые и обрывистые, к вершине бухты берег понижается и переходит в широкий галечный пляж.
На берегу вершины бухты Круглая расположено селение База Круглая. Постройки селения приметны при подходе к бухте.
Глубины в средней части бухты Круглая 24м, грунт — ил, песок и галька.
На берегу располагается санаторно-оздоровительный комплекс.
Рисунок 1 – Карта-схема районов работ: бухта Золотой Рог, бухта Круглая (1), бухта Киевка (2).
2.2 Материалы
Для исследований были использованы штаммы бактерий рода Pseudomonas разных видов (Ps. cepacia – 133k, 160k; Ps. fluorescence – 1,8, 3,5, 3,6; Ps. malthophyla – 51; Ps. putida – 136k, 145k, 4, 130k, 140k, 577,6), выделенные из морских сред, отличающихся по степени антропогенной нагрузки – бухта Киевка, б. Круглая и б. Золотой Рог.
Микробиологические среды, используемые в работе
Среда для морских гетеротрофных микроорганизмов – СММ (г/л)
(Youchimizu, Kimura, 1976)
CaCO3 -------------------------------------5
Mn SO4 ------------------------------------5
K2HPO4 -----------------------------------0,2
Пептон ------------------------------------5
Дрожжевой экстракт -------------------5
Глюкоза -----------------------------------1
Агар ---------------------------------------15
H2O дист----------------------------------500
Искусственная морская вода --------500
pH 7,8-8,1
Искусственная морская вода (г/л)
Na Cl ------------27,5
K Cl --------------1
Mg Cl2 -----------5
Mg SO4 ----------2
Ca Cl2 ----------- 0,5
Fe SO4 ---------- 0,001
H2Oдист ------- 1000
Мясо – пептонный агар – МПА (г/л)
(Герхард и др., 1984)
Экстракт из говяжего мяса ------ 3
Пептон ------------------------------ 5
Агар ---------------------------------- 15
H2Oдист ----------------------------- 1000
pH 6,8
Желточно – солевый агар (Чистовича)
(Лабинская, 1978)
К стерильному расплавленному и охлажденному до 45-500С МПА добавляем 20% (по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куринного яйца на 150-200 мл изотонического раствора Nacl), хорошо перемешиваем.
Кровянной агар
(Герхард и др., 1984)
К стерильному расплавленному и охлажденному до 45-500С МПА добавляем 5% (по объему) стерильной дефибринированной крови, хорошо перемешать.
2.3 Методы
Методика для определения факторов патогенности микроорганизмов
Определение липолитической активности
Суточную культуру бактерий высевали штрихом на чашки с агаровой средой, содержащей 0,01% CaCl2 ∙ H2 O и 0,25% твина-60. Инкубировали первые сутки при температуре 37 градусов и в течение 6 суток в условиях комнатной температуры. Положительный результат учитывали по появлению мутного ореола вокруг колоний за счет образования кристаллов кальциевого мыла.
Оксидаза
Пробу ставили с 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида. На 18-24 часовую культуру на чашке наливали несколько капель реактива и, наклонив чашку, давали ему стечь. Через 20-30 секунд колонии микроорганизмов, обладающие оксидазой, приобретали пурпурную окраску.
Гемолитическая активность
На чашки Петри с кровяным агаром осуществляли посев 18-часовой культуры. Чашки инкубировали при температуре 36±1 градус в течении 24-48 часов. После чего проводили учет результатов. При положительной реакции отмечали появление зеленовато – коричневого ореола вокруг колоний или образование прозрачной зоны гемолиза.
Лецитиназа
Определение проводили на среде Чистовича, содержащей яичный желток (источник лецитина), на которую штрихом до получения изолированных колоний вносили 18-часовую культуру. При положительной реакции вокруг лецитинферментирующих колоний после инкубации при температуре 36±1 градусов через 24-48 часов возникала зона опалесценции.
Определение протеолитической активности
Высев производили штрихом на чашки Петри со средой Y-K, содержащей молоко. Инкубировали в течение суток при температуре 370 С. Положительный результат учитывали по появлению вокруг колоний зон лизиса.
Определение липолитической активности
Осуществляли посев культуры на чашки Петри со средой Y-K с 0,2% крахмала, в состав которой не входила глюкоза. Инкубировали сутки при температуре 370 С. Результат учитывали при образовании зон вокруг отдельных колоний.
Адгезия
Для постановки данного опыта была использована методика В.И. Бриллис. В качестве экспериментальной модели были взяты эритроциты, так как данные клетки содержат на своей поверхности гликоферин – вещество, идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов. В работе использовались эритроциты человека О(I) группы Rh (+) крови. Для этого брали кровь из верхней трети локтевой вены в пробирки с гепарином: 1 капля гепарином на 5 мл крови. Далее клетки крови дважды отмывали буферным раствором при помощи ценрифугирувания (300 об/мин). В качестве буфера использовали 0,1 М раствор фосфата натрия, приготовленный на изотоническом растворе хлорида натрия (pH=7,2-7,3). На указанном буфере готовили взвесь эритроцитов с концентрацией 100млн/мл.
Микроорганизмы выращивали в течение 1-2 суток. Взвесь бактерий готовили в концентрации 109 клеток/мл, бактерии инкубировали при 370 С.
Для постановки опыта в пробирку вносили по 0,5 мл взвесей микробов и эритроцитов. Смеси инкубируют при температуре 370 С в камере в течение 5 мин, 10 мин, 15 мин, 25 мин, 45 мин. Затем на тщательно обезжиренном предметном стекле готовили мазок, который затем высушивали при комнатной температуре.
Мазки фиксировали в метаноле 10 мин, затем окрашивали по Романовскому – Гимза на протяжении 15 мин.
Адгезию изучали под световым микроскопом.
Методика определения антибиотикочувствительности микробов
Посев производили газоном на среду Мюллера – Хинтона. На каждую чашку Петри укладывалось по 7 дисков, смоченных в растворах разных антибиотиков. В работе использовали карбеницилин, тетрациклин, ампициллин, цефотаксим, ципрофлоксацин, цефтозидим, цефоперазон. Учитывалась чувствительность микробов по образованию зон лизиса вокруг дисков с антибиотиками, которую измеряли в мм.
Методика для определения цитопатических свойствмикроорганизмов
При культивировании использовали среду MEM. Монослой клеток Hella (клетки зеленой мартышки) выращивали на культуральных 96-луночных пластинах. Культивирование проводили на протяжении 3 суток.
Для инокуляции клеточных культур готовили суспензию клеток псевдомонад, выращенных на питательной среде для морских гетеротрофных организмов. Инокуляцию проводили суспензией 22-часовой культуры. Через определенные интервалы времени (24, 48 часов) производили цитологические исследования.
Цитотоксические и инвазионные свойства оценивали по инфицированию культуры клеток бактериями, изменению морфологии отдельных клеток и деструкции монослоя 50%.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Определение видов бактерий, выделенных из проб, полученных из б. Киевка, б. Золотой Рог и б. Круглая
Определение проводилось по схеме Берджи.
Рисунок 3 - Схема идентификации
Подписи к рисунку:
Список видов, вкдюченных в схему идентификации: 1. Ps. Aeuruginosa; 2. Ps. Fluorescence; 3. Ps.putida; 4.Ps.cepacia;5.Ps.maltophyla; 6.Ps. Mendocina;7.Ps. Stutzeri;8.Ps. alcaligenes
Таблица 3 - Определение вида штаммов бактерий.
|
Шт. |
Грам“-“ палочки |
Оксидаза |
t 42oC |
Флуоресц. палочки |
Аргинин |
Лизин |
Глюкоза |
Лактоза |
Орнитин |
Крахмал |
Желатин |
Вид |
|
7k |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
Ps. stutzeri |
||||||
|
3k |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
5k |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
2k |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Ps.cepacia |
||||
|
6k |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Ps.cepacia |
||||
|
1k |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
8k |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Ps.cepacia |
||||
|
4k |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
9k |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
Ps.mendocina |
|||
|
6k |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Ps.cepacia |
||||
|
2z |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
4z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
5z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
6z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
7z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
8z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
9z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
10z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
11z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
12z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
Ps. fluorescence |
||||||
|
3z |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
13z |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
Ps.aeruginosa |
|||||
|
14z |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
Ps.aeruginosa |
|||||
|
1z |
+ |
- |
- |
- |
+ |
Ps.maltophyla |
||||||
|
9p |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
1p |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
3p |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
Ps.alcaligenes |
|||
|
7p |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Ps.cepacia |
||||
|
6p |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Ps.cepacia |
||||
|
2p |
+ |
+ |
- |
- |
Ps.putida |
|||||||
|
8p |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
Ps.cepacia |
||||
|
4p |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
Ps.alcaligenes |
|||
|
5p |
+ |
- |
- |
- |
+ |
Ps.maltophyla |
Всего выделено 32 штамма бактерий, относящихся к роду Pseudomonas. Из них по 9 штаммов выделенные из б. Круглая и б. Киевка, и 14 штаммов из б.Золотой Рог.
3.2. Определение биологических свойств выделенных псевдомонад
Определение ферментативных свойств
Результаты исследований ферментативных свойств бактерий рода Pseudomonas и антибиотикочувствительноти этих штаммов преведены в табл.2
Таблица 4 - Ферментативные свойства бактерий рода Pseudomonas, выделенных из морской среды
|
Шт. |
Протоелитики |
Липолитики |
Кровь |
Лецитиназа уголь/без угля |
Крахмал |
Антибиотики (устойчивость) |
|||||||
|
2 |
6 |
7 |
10 |
13 |
16 |
17 |
|||||||
|
Бухта Киевка |
|||||||||||||
|
1k |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
2k |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
3,3 |
2,5 |
2,7 |
1,5 |
4,0 |
- |
2,6 |
|
3k |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
2,5 |
2,5 |
- |
4,6 |
3,0 |
3,4 |
3,8 |
|
4k |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
3,2 |
2,3 |
2,6 |
2,4 |
3,1 |
2,7 |
2,0 |
|
5k |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
3 |
2,3 |
- |
3 |
2,6 |
2,8 |
1,6 |
|
6k |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
3,4 |
2,3 |
2,5 |
1,7 |
3,8 |
- |
2,8 |
|
7k |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
8k |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
2,6 |
2,3 |
- |
3,2 |
3 |
3 |
3,1 |
|
9k |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
3,6 |
4 |
4 |
4 |
4 |
3,6 |
4 |
|
Бухта Золотой Рог |
|||||||||||||
|
1z |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
2,7 |
1,7 |
1,7 |
3,3 |
2,7 |
3 |
3,1 |
|
2z |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
3z |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
4z |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
2,8 |
2,3 |
- |
4,4 |
2,4 |
4 |
3,6 |
|
5z |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
6z |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
7z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
1,3 |
- |
2,1 |
|
8z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
1,5 |
- |
1,2 |
|
9z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
1,7 |
- |
1,6 |
|
10z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
11z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
12z |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
13z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
14z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Бухта Круглая |
|||||||||||||
|
1p |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
2,5 |
- |
- |
4,2 |
3,5 |
2,3 |
|
2p |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
2,5 |
- |
- |
4,4 |
3,3 |
1,7 |
|
3p |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
3,0 |
- |
|
|
4p |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
3,3 |
- |
|
|
5p |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
1,1 |
1,2 |
- |
- |
2,6 |
- |
- |
|
6p |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1 |
3 |
- |
2,6 |
3,3 |
1,9 |
1,6 |
|
7p |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
3 |
3 |
3 |
2,5 |
4,8 |
1,6 |
3 |
|
8p |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
2,3 |
3 |
2 |
2,3 |
3,7 |
2,6 |
3,2 |
|
9p |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
2,1 |
- |
- |
Примечание: 2-карбеницилин, 6-тетрациклин, 7-ампицилин, 10-цефотаксим,
13-ципрофлоксацин, 16-цефтозидим, 17-цефоперазон
На рисунке 4 показаны активности штаммов на среде, содержащей яичный желток
а в
Рисунок 4 – Лецитиназная активность: а - ГРМ с углем, в - ГРМ без угля
На рисунке 5 показаны штаммы, наиболее чувствительные к антибиотикам.
а в
Рисунок 5 – Чувствительность к антибиотикам штамм: 1z (а), штамм 4k(в)
карбеницилин (2), тетрациклин(6), ампицилин (7), цефотаксим(10),
ципрофлоксацин(13), цефтозидим(16), цефоперазон(17)
По результатам проведенных работ установлено, что свойства у штаммов бактерий, выделенных из акваторий с разной степенью антропогенной нагрузки, проявляются по-разному.
Данные, полученные при исследовании ферментативных свойств штаммов, выделенных из б. Киевка, оказались малорезультативными. Протеолитической активностью обладали 33% штаммов, а штаммов. Разлагающих углеводы и липиды не было выявлено вовсе. Исследование штаммов б. Круглая показало, что 67% из них проявляют различные ферментативные свойства, наиболее часто встречаемой являлись липолитическая и лицитиназная активность. В б. Золотой Рог 64% штаммов обладали ферментативной активностью, причем большинство из этих штаммов (67%) обладали практически всем спектром исследуемых свойств, 22% обладали также гемолитической активностью.
При исследовании антибиотикочувствительности бактерий оказалось, что наиболее устойчивыми были штаммы, выделенные из б. Золотой Рог. 65% штаммов показали устойчивость ко всем антибиотикам, используемым в эксперименте. У 35% штаммов наиболее активное подавление роста вызвали ципрофлоксацин и цефоперазон, наименее активным оказался ампициллин (у 7% штаммов). Штаммы б. Круглая были устойчивы к 6-ти антибиотикам из 7-ми используемых в опыте. Наибольшее подавление роста наблюдали при воздействии ципрофлоксацина (100% подавление роста), наименьшее – ампициллин (22%). Среди штаммов, выделенных из б. Киевка 22% оказались устойчивыми ко всем антибиотикам. Наименьшее подавление роста клеток отмечено при воздействии ампициллина (44% штаммов) и цефтозидима (56%).
Таким образом, сравнительное исследование показало, что в акваториях, страдающих от мощного антропогенного загрязнения, в микробных сообществах преобладают микроорганизмы устойчивые к лекарственным веществам. Подобные результаты можно объяснить адаптационными свойствами микроорганизмов, при этом устойчивость к антибиотикам генетически связана с устойчивостью к тяжелым металлам.
Рисунок 6 - Антибиотикоустойчивость псевдомонад из районов с разной степенью антропогенной нагрузки
Определение цитопатических свойств псевдомонад
Для изучения цитопатических свойств морских псевдомонад, культуру испытуемых бактерий, содержащую 1 млрд клеток по оптическому стандарту мутности, разводили до 10-4 и добавляли в монослой клеток Hella. Результаты оценки цитопатического действия выделенных штаммов учитывали по проценту гибели клеток Hella в поле зрения микроскопа (табл. 5).
Таблица 5 - Оценка цитопатических свойствPseudomonas
|
Шт. |
Разведения |
||||
|
109 |
108 |
107 |
106 |
105 |
|
|
б. Киевка |
|||||
|
1k |
+ |
||||
|
2k |
+ |
||||
|
3k |
+ |
||||
|
4k |
+ |
+ |
|||
|
5k |
+ |
||||
|
6k |
+ |
+ |
|||
|
7k |
+ |
+ |
+ |
||
|
8k |
+ |
+ |
|||
|
9k |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
б. Золотой Рог |
|||||
|
1z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
2z |
+ |
+ |
+ |
||
|
3z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
4z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
5z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
6z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
7z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
8z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
9z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
10z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
11z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
12z |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
13z |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
14z |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
б. Круглая |
|||||
|
1p |
+ |
+ |
|||
|
2p |
+ |
+ |
|||
|
3p |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
4p |
+ |
+ |
+ |
||
|
5p |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
6p |
+ |
||||
|
7p |
+ |
||||
|
8p |
+ |
||||
|
9p |
+ |
+ |
|||
Примечание: “+” - разрушение клеток, “-” отсутствие разрушения
Как видно из данных, приведенных в таблице 3, практически все культуры при исходной концентрации клеток (109 клеток/мл) в 50% случаев разрушали клетки монослоя.
Разведение культур штаммов дало более четкие результаты в отношении их токсичности к чувствительным тест-клеткам. Так 79% штаммов, выделенных из б. Золотой Рог были патогенными даже при разведении культуры бактерий до 105 кл/мл. У коллекции штаммов, выделенных из б. Круглая такими цитопатическими свойствами обладали 22 % из всех изолятов, а из б. Киевка - 11 %.
Рисунок 7 - Сравнительная характеристика ЦПД псевдомонад из районов с разной степенью анторопогенной нагрузки.
Определение адгезивных свойств псевдомонад
При оценке адгезивных свойств микроба используют показатели СПА, К, ИАМ, причем подсчет ведется на 100 эритроцитах.
СПА-средний показатель адгезии, под ним понимается среднее количество микробов, прикрепившихся к одному эритроциту. Адгезивность считается нулевой при СПА от 0 до 1,низкой-при СПА от 1,01 до 2, средней—от 2,01 до 4, высокой-свыше 4. К (коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе) - процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы. ИАМ (индекс адгезивности микроорганизма) - среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците, исчисляется по формуле: ИАМ=СПА*100/К.
Микроорганизм считают неадгезивным ИАМ‹ 1,75,низкоадгезивным-от 1,76 до 2,5,среднеадгезивным – от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивным при ИАМ выше 4,0.
Таблица 6 - Адгезивные свойства бактерий
|
T |
Шт. |
Свободные эритроциты |
Связанные эритроциты |
Число микробов |
СПА |
К |
ИАМ |
|||
|
б. Киевка |
||||||||||
|
5 |
1k |
62 |
41 |
42 |
1,02 |
41 |
2,49 |
|||
|
2k |
13 |
87 |
173 |
1,98 |
87 |
2,28 |
||||
|
3k |
60 |
40 |
41 |
1,02 |
40 |
2,55 |
||||
|
4k |
43 |
57 |
58 |
1,01 |
57 |
1,77 |
||||
|
5k |
49 |
51 |
103 |
2,01 |
51 |
3,94 |
||||
|
6k |
36 |
51 |
71 |
1,11 |
64 |
1,73 |
||||
|
7k |
23 |
77 |
150 |
1,95 |
77 |
2,53 |
||||
|
8k |
19 |
81 |
99 |
1,22 |
81 |
1,51 |
||||
|
9k |
14 |
86 |
109 |
1,27 |
86 |
1,48 |
||||
|
10 |
1k |
43 |
57 |
58 |
1,01 |
57 |
1,77 |
|||
|
2k |
18 |
82 |
160 |
1,95 |
82 |
2,38 |
||||
|
3k |
59 |
41 |
42 |
1,02 |
41 |
2,49 |
||||
|
4k |
37 |
63 |
71 |
1,13 |
63 |
1,79 |
||||
|
5k |
39 |
61 |
90 |
1,47 |
61 |
2,41 |
||||
|
6k |
33 |
67 |
89 |
1,33 |
67 |
1,98 |
||||
|
7k |
43 |
57 |
58 |
1,01 |
57 |
1,77 |
||||
|
8k |
36 |
51 |
71 |
1,11 |
64 |
1,73 |
||||
|
9k |
14 |
86 |
109 |
1,27 |
86 |
1,48 |
||||
|
15 |
1k |
48 |
52 |
105 |
2,02 |
52 |
3,88 |
|||
|
2k |
23 |
77 |
150 |
1,95 |
77 |
2,53 |
||||
|
3k |
41 |
59 |
62 |
1,05 |
59 |
1,78 |
||||
|
4k |
19 |
81 |
99 |
1,22 |
81 |
1,51 |
||||
|
5k |
29 |
71 |
121 |
1,70 |
71 |
2,40 |
||||
|
6k |
42 |
58 |
81 |
1,40 |
58 |
2,41 |
||||
|
7k |
18 |
82 |
148 |
1,80 |
82 |
2,20 |
||||
|
8k |
36 |
51 |
71 |
1,11 |
64 |
1,73 |
||||
|
9k |
43 |
57 |
58 |
1,01 |
57 |
1,77 |
||||
|
25 |
1k |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
|||
|
2k |
21 |
71 |
158 |
2,22 |
71 |
3,13 |
||||
|
3k |
19 |
81 |
133 |
1,64 |
81 |
3,02 |
||||
|
4k |
14 |
86 |
109 |
1,27 |
86 |
1,48 |
||||
|
5k |
18 |
82 |
148 |
1,80 |
82 |
2,20 |
||||
|
6k |
18 |
82 |
160 |
1,95 |
82 |
2,38 |
||||
|
7k |
23 |
77 |
150 |
1,95 |
77 |
2,53 |
||||
|
8k |
43 |
57 |
58 |
1,01 |
57 |
1,77 |
||||
|
9k |
29 |
71 |
121 |
1,70 |
71 |
2,40 |
||||
|
45 |
1k |
20 |
80 |
161 |
2,01 |
80 |
2,51 |
|||
|
2k |
19 |
81 |
324 |
4,00 |
81 |
4,94 |
||||
|
3k |
5 |
95 |
188 |
1,98 |
95 |
2,08 |
||||
|
4k |
13 |
87 |
173 |
1,98 |
87 |
2,28 |
||||
|
5k |
49 |
51 |
103 |
2,01 |
51 |
3,94 |
||||
|
6k |
10 |
90 |
178 |
1,98 |
90 |
2,20 |
||||
|
7k |
14 |
86 |
109 |
1,27 |
86 |
1,48 |
||||
|
8k |
19 |
81 |
133 |
1,64 |
81 |
3,02 |
||||
|
9k |
43 |
57 |
58 |
1,01 |
57 |
1,77 |
||||
|
б. Золотой Рог |
||||||||||
|
5 |
1z |
25 |
75 |
140 |
1,87 |
75 |
2,48 |
|||
|
2z |
33 |
78 |
126 |
1,61 |
78 |
2,07 |
||||
|
3z |
32 |
68 |
139 |
2 |
68 |
2,94 |
||||
|
4z |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
5z |
21 |
79 |
157 |
1,99 |
79 |
2,52 |
||||
|
6z |
49 |
54 |
109 |
2,02 |
54 |
3,74 |
||||
|
7z |
28 |
72 |
173 |
2,40 |
72 |
3,33 |
||||
|
8z |
31 |
69 |
187 |
2,71 |
69 |
3,93 |
||||
|
9z |
32 |
68 |
187 |
2,75 |
68 |
4,04 |
||||
|
10z |
31 |
69 |
187 |
2,71 |
69 |
3,93 |
||||
|
11z |
21 |
79 |
157 |
1,99 |
79 |
2,52 |
||||
|
12z |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
13z |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
||||
|
14z |
49 |
54 |
109 |
2,02 |
54 |
3,74 |
||||
|
10 |
1z |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
|||
|
2z |
18 |
82 |
160 |
1,95 |
82 |
2,38 |
||||
|
3z |
32 |
68 |
187 |
2,75 |
68 |
4,04 |
||||
|
4z |
63 |
36 |
145 |
4,03 |
36 |
11,19 |
||||
|
5z |
28 |
72 |
173 |
2,40 |
72 |
3,33 |
||||
|
6z |
40 |
60 |
132 |
2,20 |
60 |
3,67 |
||||
|
7z |
21 |
79 |
157 |
1,99 |
79 |
2,52 |
||||
|
8z |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
9z |
28 |
72 |
173 |
2,40 |
72 |
3,33 |
||||
|
10z |
28 |
72 |
173 |
2,40 |
72 |
3,33 |
||||
|
11z |
49 |
54 |
109 |
2,02 |
54 |
3,74 |
||||
|
12z |
21 |
79 |
157 |
1,99 |
79 |
2,52 |
||||
|
13z |
32 |
68 |
187 |
2,75 |
68 |
4,04 |
||||
|
14z |
42 |
58 |
231 |
3,98 |
58 |
6,86 |
||||
|
15 |
1z |
12 |
88 |
220 |
2,50 |
88 |
2,84 |
|||
|
2z |
31 |
69 |
187 |
2,71 |
69 |
3,93 |
||||
|
3z |
50 |
50 |
201 |
4,02 |
50 |
8,04 |
||||
|
4z |
53 |
47 |
192 |
4,08 |
47 |
8,69 |
||||
|
5z |
27 |
73 |
183 |
2,50 |
73 |
3,43 |
||||
|
6z |
57 |
43 |
174 |
4,05 |
43 |
9,41 |
||||
|
7z |
27 |
73 |
183 |
2,50 |
73 |
3,43 |
||||
|
8z |
31 |
69 |
187 |
2,71 |
69 |
3,93 |
||||
|
9z |
49 |
54 |
109 |
2,02 |
54 |
3,74 |
||||
|
10z |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
11z |
42 |
58 |
231 |
3,98 |
58 |
6,86 |
||||
|
12z |
11 |
89 |
357 |
4,01 |
89 |
4,51 |
||||
|
13z |
53 |
47 |
192 |
4,08 |
47 |
8,69 |
||||
|
14z |
50 |
50 |
201 |
4,02 |
50 |
8,04 |
||||
|
25 |
1z |
5 |
95 |
285 |
3,00 |
95 |
3,16 |
|||
|
2z |
42 |
58 |
231 |
3,98 |
58 |
6,86 |
||||
|
3z |
33 |
67 |
273 |
4,07 |
67 |
6,08 |
||||
|
4z |
19 |
81 |
243 |
3,00 |
81 |
3,70 |
||||
|
5z |
3 |
97 |
218 |
2,25 |
97 |
2,32 |
||||
|
6z |
46 |
54 |
208 |
3,85 |
54 |
7,13 |
||||
|
7z |
21 |
79 |
315 |
3,99 |
79 |
5,05 |
||||
|
8z |
24 |
76 |
228 |
3,00 |
76 |
3,95 |
||||
|
9z |
25 |
75 |
301 |
4,01 |
75 |
5,35 |
||||
|
10z |
11 |
89 |
357 |
4,01 |
89 |
4,51 |
||||
|
11z |
24 |
76 |
228 |
3,00 |
76 |
3,95 |
||||
|
12z |
21 |
79 |
315 |
3,99 |
79 |
5,05 |
||||
|
13z |
5 |
95 |
285 |
3,00 |
95 |
3,16 |
||||
|
14z |
19 |
81 |
243 |
3,00 |
81 |
3,70 |
||||
|
45 |
1z |
1 |
99 |
298 |
3,01 |
99 |
3,04 |
|||
|
2z |
21 |
79 |
315 |
3,99 |
79 |
5,05 |
||||
|
3z |
25 |
75 |
301 |
4,01 |
75 |
5,35 |
||||
|
4z |
29 |
71 |
286 |
4,03 |
71 |
5,67 |
||||
|
5z |
24 |
76 |
228 |
3,00 |
76 |
3,95 |
||||
|
6z |
11 |
89 |
357 |
4,01 |
89 |
4,51 |
||||
|
7z |
42 |
58 |
231 |
3,98 |
58 |
6,86 |
||||
|
8z |
46 |
54 |
208 |
3,85 |
54 |
7,13 |
||||
|
9z |
29 |
71 |
286 |
4,03 |
71 |
5,67 |
||||
|
10z |
25 |
75 |
301 |
4,01 |
75 |
5,35 |
||||
|
11z |
21 |
79 |
315 |
3,99 |
79 |
5,05 |
||||
|
12z |
24 |
76 |
228 |
3,00 |
76 |
3,95 |
||||
|
13z |
21 |
79 |
315 |
3,99 |
79 |
5,05 |
||||
|
14z |
33 |
67 |
273 |
4,07 |
67 |
6,08 |
||||
|
Бухта Круглая |
||||||||||
|
5 |
1p |
19 |
81 |
99 |
1,22 |
81 |
1,51 |
|||
|
2p |
33 |
78 |
126 |
1,61 |
78 |
2,07 |
||||
|
3p |
29 |
71 |
121 |
1,70 |
71 |
2,40 |
||||
|
4p |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
||||
|
5p |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
6p |
36 |
51 |
71 |
1,11 |
64 |
1,73 |
||||
|
7p |
48 |
52 |
105 |
2,02 |
52 |
3,88 |
||||
|
8p |
14 |
86 |
109 |
1,27 |
86 |
1,48 |
||||
|
9p |
23 |
77 |
150 |
1,95 |
77 |
2,53 |
||||
|
10 |
1p |
48 |
52 |
105 |
2,02 |
52 |
3,88 |
|||
|
2p |
33 |
78 |
126 |
1,61 |
78 |
2,07 |
||||
|
3p |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
||||
|
4p |
21 |
71 |
158 |
2,22 |
71 |
3,13 |
||||
|
5p |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
||||
|
6p |
33 |
78 |
126 |
1,61 |
78 |
2,07 |
||||
|
7p |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
8p |
19 |
81 |
243 |
3,00 |
81 |
3,70 |
||||
|
9p |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
15 |
1p |
21 |
79 |
157 |
1,99 |
79 |
2,52 |
|||
|
2p |
28 |
72 |
173 |
2,40 |
72 |
3,33 |
||||
|
3p |
49 |
54 |
109 |
2,02 |
54 |
3,74 |
||||
|
4p |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
5p |
31 |
69 |
187 |
2,71 |
69 |
3,93 |
||||
|
6p |
19 |
81 |
243 |
3,00 |
81 |
3,70 |
||||
|
7p |
23 |
77 |
150 |
1,95 |
77 |
2,53 |
||||
|
8p |
28 |
72 |
173 |
2,40 |
72 |
3,33 |
||||
|
9p |
49 |
51 |
103 |
2,01 |
51 |
3,94 |
||||
|
25 |
1p |
21 |
79 |
315 |
3,99 |
79 |
5,05 |
|||
|
2p |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
3p |
27 |
73 |
183 |
2,50 |
73 |
3,43 |
||||
|
4p |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
||||
|
5p |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
6p |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
||||
|
7p |
19 |
81 |
324 |
4,00 |
81 |
4,94 |
||||
|
8p |
24 |
76 |
228 |
3,00 |
76 |
3,95 |
||||
|
9p |
48 |
52 |
105 |
2,02 |
52 |
3,88 |
||||
|
45 |
1p |
33 |
67 |
273 |
4,07 |
67 |
6,08 |
|||
|
2p |
27 |
73 |
183 |
2,50 |
73 |
3,43 |
||||
|
3p |
43 |
57 |
121 |
2,12 |
57 |
3,72 |
||||
|
4p |
5 |
95 |
285 |
3,00 |
95 |
3,16 |
||||
|
5p |
22 |
78 |
157 |
2,01 |
78 |
2,58 |
||||
|
6p |
19 |
81 |
243 |
3,00 |
81 |
3,70 |
||||
|
7p |
24 |
76 |
228 |
3,00 |
76 |
3,95 |
||||
|
8p |
21 |
79 |
315 |
3,99 |
79 |
5,05 |
||||
|
9p |
40 |
60 |
132 |
2,20 |
60 |
3,67 |
||||
Исследования показали, что наиболее выраженными адгезивными свойствами обладают штаммы, выделенные из поверхностных вод б. Золотой Рог.
В 43% случаев у штаммов, выделенных из б. Золотой Рог, проявлялись сильноадгезивные свойства, когда как у штаммов б. Круглая только в 9% случаев, а у штаммов из б. Киевка – в 2%.
Более слабые адгезивные свойства проявили 50% штаммов из бухты Золотой Рог, из бухты Круглая – 78% и 24% из бухты Киевка.
Наименьшие адгезивные свойства показали штаммы, выделенные из бухты Киевка (53% случаев), а также вовсе неадгезивные свойства показали штаммы в 21% случаев.
a
б
в
Рисунок 8 - Сравнение адгезивных свойств псевдомонад из районов с разной степенью антропогенной нагрузки: а – б. Киевка, б – б. Золотой Рог, в – б. Круглая
По результатам общего исследования штаммов была сделана сравнительная характеристика штаммов псевдомонад, относящихся к виду Pseudomonasputida, выделенных из районов с разной антропогенной нагрузкой, т.к. именно этот вид чаще всего встречался во всех испытуемых акваториях. Сравнение показало, что штаммы Ps. рutidaизменяли свои свойства в зависимости от места отбора. Штаммы, выделенные из б. Киевка и б. Золотой Рог не проявляли ферментативных свойств, тогда как штаммы из б. Круглая проявили активность в расщеплении жиров и лецитиназы.
Ps. putida, выделенные из б. Золотой Рог, оказались устойчивыми ко всем антибиотикам. Штаммы, выделенные из б. Киевка в 32% случаев оказались устойчивыми к различным антибиотикам, а штаммы из б. Круглая в 57%.
Сравнение адгезивных свойств выявило, что штаммы из б. Киевка проявляли в своем большинстве слабоадгезивные свойства (60%), штаммы из б. Круглая проявили в основном среднеадгезивные свойства (67%), а штаммы из б. Зотой Рог оказались сильноадгезивными в 60% случаев.
Рисунок 9 – Сравнение штаммов Ps. рutida, выделенных из разных акваторий
Наиболее высокий цитопатический эффект проявили штаммы, выделенные из б. Золотой Рог (разрушение клеток при разведении 10-4). Штаммы из б. Киевка и б. Круглая проявили активность в разрушении клеток лишь до разведения 10-1.
Рисунок 10 – Разрушение живых клеток клетками штаммов Ps. рutida, выделенных из различный районов
Следовательно, полностью повторили картину, которая получена на примере всех испытуемых штаммов псевдомонад.
ВЫВОДЫ
Доминирующими видами, выделенными из различных районов были, были Ps. рutida и Ps.cepacia, которые были обнаружены во всех исследуемых районах. Б. Золотой Рог характеризовалась большим процентом пигментирующих бактерий – 79%, так как пигментация является средством защиты бактериальных клеток в грязной среде.
Факторы патогенности более выражены у микроорганизмов из загрязненной акватории. Штаммы, выделенные из б. золотой Рог по всем показателям патогенности преобладают над штаммами, выделенными из бухт Киевка и Круглая.
В сравнении антибиотикочувствительности штаммов наиболее устойчивыми оказались штаммы, выделенные из б. Золотой Рог, что обуславливается высокой устойчивостью штаммов к тяжелым металлам.
В значительных концентрациях штаммы, выделенные из всех районов, оказывают разрушающее действие на живые клетки. Однако, при дальнейшем разведении культур бактерий наибольший цитопатический эффект показали штаммы из б. Золотой Рог. Следовательно, даже при малых количествах эти штаммы оказываются опасными для клеток живых организмов.
В исследовании адгезивных свойств штаммы псевдомонад, выделенные из б. Золотой Рог, более агрессивны. Это связанно с тем, что среда влияет на поверхностные структуры бактериальных клеток, что в свою очередь влияет на адгезивность клеток.
На примере б. Золотой Рог, где имеется смешенное загрязнение вод, было показано, что загрязнение среды порождает более агрессивные штаммы, которые обладают выраженной фактической патогенностью и высокой вирулентностью.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анисимова Л. А. Детерминируемая плазмидами грамотрицательных бактерий устойчивость к поллютантам // Мол. генетика, микробиология и вирусология / Анисимова Л. А., Боронин А.М. - № 3, 1994. - c.45-62.
2. Вахненко Р.В. Морские порты Японо-морского региона (экономико-георафическая характеристика) / Р.В. Вахненко. – Владивосток: Дальнаука, 1998.-132с.
3. Ващенко М.А. Загрязнение залива Петра Великого Японского моря и его биологические последствия/М.А. Ващенко//Биол. Моря. - 2000. - Т.26, №3. - с.149-159
4. Вольпе И.М. Патогенные микроорганизмы / Вольпе И.М., Чернова Т.И - М: МГУ, 1967. - 280с.
5. Гаврилевский А.В. Комплекная количественная оценка параметров источников загрязнения морской акватории, прилегающей к городу Владивостоку/А.В.Гаврилевский, Т.А. Гаврилова и др.//Гидрометеорологические процессы на шельфе: оценка воздействия на морскую среду/ДВНИГМИ.- Владивосток: Дальнаука, 1998.-с.102-103
6. Горленко В.М. Экология водных микроорганизмов / Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. - М: Наука, 1977. - 289с.
7. Иванов Д.В. Распространение и механизмы резистентности микроогранизмов штаммов бактерий Pseudomonas//Фарматека / Иванов Д.В., Егоров А.М. - 2007. №8/9. - c.159-168.
8. Карасевич Ю. Н. Экспериментальная адаптация микроорганизмов. - М.: Наука, 1975.- 180 с.
9. Каравайко Г.И. Физиология и геохимическая деятельность бактерий. - М: Наука, 1979. - 215с.
10. Кондратьева Е. Н., Хемолитотрофы и метилотрофы. - М: Наука, 1983. - 149с.
11. Красильников Н. А. Определитель бактерий и актиномицетов - М.— Л., 1949. - 459с.
12. Лопатин М. Д. Ускоренный выход антибиотика из клеток устойчивого к хлортетрациклину штамма Escherichia coli К-12, 1973 // Микробиология / Лопатин М. Д., Плакунов В. К. - №42. - c. 316.
13. Мишустина И.Е. Морская микробиология. - Вл-к: Изд-во ДВГУ, 1985. - 156с.
14. Покровский В.И. Медицинская микробиология / Покровский В.И., Поздеев О.К. - М: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 768с.
15. Рубан Е.Л Микология и фитопатология. - 1986. № 5. – c.395-401.
16. Смирнов В.В. Бактерии рода Pseudomonas/ Смирнов В.В., Киприанова Е.А. - Киев: Наук.думка, 1990. - 262с.
17. Цыбань А.В. Экологические свойства и динамика гетеротрофных микроорганизмов / Цыбань А.В., Панов Г.В., Баринова С.П., Мошарова И.В., Кнаб В.А. - М: Наука, 2000. - 375с.
18. Цыбань А. В. и др. Динамика экосистем Берингова и Чукотского морей. - М.: Наука, 2000. - 357 с.
19. Яковлев С.В. Устойчивость Pseudomonas aeruginosa к карбапенемам: уроки исследования MYSTIC//Биомедицинская химия. - 2007. Т.53, №6. - c.98-115.
20. Avers C. J., Pfeffer R., Rancourt M. W. 1965. Acriflavine induction of different kinds of «petite» mitochondrial populations in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacteriol., № 90. Р. 481-483.
21. Brockman R. W., Debavadi C. S., Stutts P., Hutchinson D. J. 1961. Purine ribonucleotide pyrophosphorylases and resistance to purine analogues in Streptococcus faecalis // J.Biol. Chem., № 26. Р. 147-150.
22. Citri N., Pollock M. R. 1966. The biochemistry and function of b-lactamase
(penicillinase) // Advances Enzymol., № 28. P. 237-240.
23. Franklin T. J. Resistance of Escherichia coli to tetracyclines. Changes in permeability to tetracyclines in Escherichia coli bearing transferable resistance factors // Biochem. J., 1967, № 15. P. 98-100.
24. Ivanov A.Yu., Khassanova L.A., Collery P. Microorganisms as tool of studying copper metal ions-induced changes in electrophysical cell properties // Cell. Mol. Biol. (France). 1996. V.42 (6): 825-831.
25. Kay W. W., Gronlund A. F. Isolation of amino acid transport-negative
mutant of Pseudomonas aeruginosa and cells with repressed transport activity // J. Bacteriol., 1969, № 20. P. 116-118.
26. Nagase H., Inthorn D., Miuamoto K. 1994. Use of photosynthetical organisms in biological purification//Jap. J. Toxicol. and Environ. Health, 40, № 6, 479-485.
27. Reddy G.N., Prasad M.N.V. 1990. Heavy metal binding proteine. Polypeptide: occurence, structure, synthesis and function//Environ. Exp. Bot. 30, N 3. 251-264.
28. Rehder D. 1991. Bioorganisme Chemie des Vanadiums//Angev. Chem., 103, № 2, 152-172.
29. Silver S., Misra T.K. Plasmid-mediated heavy metal resistances // Ann. Rev. Microbiol. 1988. V. 42. P. 717-743.
30. Tristram H., Neale S. The activity and specificity of the proline permease in wild-type and analogue-resistant strain of Escherichia coli // J. Gen. Microbiol., 1968, № 13. P. 121-123.