VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

ВВЕДЕНИЕ

Почва как компонент биогеоценоза имеет свою биоту, составной частью которой является множество микроорганизмов с разнообразными биологическими свойствами. Взаимоотношения между ними являются одним из факторов, влияющих на формирование микробного сообщества (Одум, 1975).

Определяющими факторами поддержания стабильности, состава и продуктивности микробных сообществ являются межпопуляционные взаимодействия, осуществляемые через продукты метаболизма (Егоров, Ландау, 1982). Известно, что среди метаболитов, продуцируемых микроорганизмами в сообществах, есть и летучие вещества, которые могут действовать как внутри- или межвидовые регуляторы размножения микробных клеток в сообществах. При этом отмечено как стимулирующее, так иингибирующее действие летучих веществ микробного происхождения на размножение микроорганизмов (Заварзин, 1976). Изучение характера взаимоотношений между бактериями в сообществах имеет большое значение для выяснения роли отдельных компонентов в биологических сообществах.

Известно, что характерной особенностью возбудителей сапрозоонозов является их способность в межэпидемический период жить и размножаться в объектах окружающей среды, в том числе и почве (Сомов, Литвин, 1991). Существование патогенных микроорганизмов в почвах определяется и контролем со стороны других микроорганизмов, который способствует либо стимуляции, либо ингибированию роста патогенных бактерий (Сидоренко, Бузолева, 2008). ДляListeriamonocytogenes, относящихся к возбудителям сапрозоонозов, существование и размножениев почве является известным фактом, что доказано выделением листерий из этого субстрата (Кузнецов и соавт., 1979; Гершун, 1980) и в модельных экспериментах (Бузолева, 2001). В этой связи важно исследовать взаимоотношения листерий, при обитании их в почве, с сапрофитной микрофлорой, что имеет важное эколого-эпидемиологическое значение.

Цель настоящей работы – изучить стимулирующее влияние метаболитов сапрофитных бактерий, выделенных из почвы, на рост и размножение Listeriamonocytogenes.

Задачи исследования:

1. Выделить из почвы, взятой в районе б. Лазурная (район индикации листерий), сапрофитные бактерии в культуру.

2. Провести скрининговое исследование биологической активности летучих метаболитов сапрофитных почвенных бактерий методом Тиранен в отношении размножения листерий, и выявить наиболее активные штаммы.

3. Подобрать оптимальную концентрацию экзометаболитов активных штаммов сапрофитных бактерий, стимулирующих рост эпидемически значимых штаммов Listeriamonocytogenes.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Почва, как среда обитания для микроорганизмов

Особое место среди природных сред обитания микроорганизмов занимает почва. Это чрезвычайно гетерогенный (разнородный) по структуре субстрат, имеющий микромозаичное строение. Почва представляет собой совокупность множества очень мелких (от долей миллиметра до 3—5 мм) агрегатов (шероховатых гранул, иногда объединенных в группы), пронизанных порами, омываемых почвенным раствором, протекающим по капиллярам.

Остатки растений и животных, гумусовые вещества — органический элемент почвы — распределены в ней не равномерно, а сосредоточены в отдельных микроочагах, часто устилая пленкой почвенные гранулы, создавая зоны, где протекает бурная, но непродолжительная деятельность микробных сообществ, заселяющих эти участки (Федоров, 1976).

Почва – обязательный компонент любого биогеоценоза – среда обитания множества различных микроорганизмов. В ней можно встретить самые различные микрозоны, в том числе достаточно благоприятные по своим свойствам для существования бактерий (Звягинцев, 1973; Кожевин, 1989). Наряду с этим патогенные микроорганизмы, попадая в почву, встречаются с неблагоприятными для них физико-химическими условиями и антагонистическим действием разнообразной почвенной биоты. Огромное разнообразие и комбинации компонентов, составляющих почву, отмечаются даже в пределах одной и той же ограниченной местности (Скворцов и соавт., 1966; Сомов, Литвин, 1988).

Почвенные микроорганизмы обитают в трехфазной полидисперсной среде, представленной твердой (минеральные и органические частицы), жидкой (почвенная вода) и газообразной (почвенный воздух) фазами. Жизнедеятельность микроорганизмов в почве осуществляется в основном на почвенных частицах, в определенных микрозонах которых представлены клетки, ресурсы и микробные метаболиты (Нетрусов и соавт, 2004).

С позиции экологии почвенных организмов почва – это их среда жизни, местообитание. Однако если для макрорганизмов почва предстает как целостная среда разной плотности сложения, для мезофауны – как система пор и пещер, заполненных водой (раствором) или воздухом, то для микроорганизмов почва представляет собой многофазную, очень гетерогенную систему микросред с резко противоположными условиями даже в одном микролокусе. В любом, даже самом мелком агрегате почвы на поверхности могут быть одни условия аэрации, влажности, pH, наличия доступных элементов питания, а внутри – совершенно иные. Поэтому усредненные показатели таких свойств почв, как содержание гумуса, pH, окислительно-восстановительный потенциал, имеют разное значение при изучении условий жизни в почве корневых систем растений, крупных или средних животных или микрорганизмов (Бабьева, 1989).

Основной резервуар сапрофитных микробов – почва, где они могут выживать какое-то время, находясь в состоянии анабиоза или метабиоза (Елинов, 1989).

Почвенная твердая среда обеспечивает мозаичность и гетерогенность среды обитания для микроорганизмов. В состав твердой части почвы входят главным образом минеральные соединения и в меньшей степени – органические остатки растений. На поверхности твердых почвенных частиц ссредоточены основные запасы питательных веществ: гумус, органоминеральные коллоиды, катионы Ca²⁺, Mg²⁺ и др.

Наиболее характерная особенность жизни микрорганизмов в почве – их адсорбция. Они закреплены на поверхности почвенных частиц, на органических остатках, на живых корнях растений. Это состояние иначе называют агдезией (прилипанием), а также иммобилизацией (обездвиживанием). По отношению к общей поверхности почвы микроорганизмы занимают лишь сотые или десятые доли процента, они не составляют единичной непрерывной пленки, а располагаются небольшими колониями в микроочагах. Колонии микроорганизмов обычно разобщены, и взаимодействие между ними осуществляется не в рамках всей почвенной системы, а в отдельных локусах.

Почвенный раствор, составляющий жидкую часть почвы, заполняет капилляры и образует разной толщины водные пленки вокруг почвенных частиц. При насыщении почвы влагой до полной влагоемкости почти все поры и пространства заняты раствором, за исключением пор с «заземленным воздухом». Такое состояние почвы сказывается на ее аэрации и способствует усилению анаэробных процессов (Бабьева, 1989).

В составе почвенного раствора есть минеральные, органоминеральные и органические вещества в молекулярно-растворенном или коллоидном состоянии. Их соотношение неодинаково в почвах разного типа, оно меняется также по горизонтам и по сезонам года. В подзолах и болотных почвах органические вещества преобладают, в черноземах примерно равное соотношение органических и минералых веществ, а в каштановых и сероземах больше минеральных веществ, чем в органических. В верхних горизонтах, как правило, концентрация органических веществ выше, чем в нижних. Из минеральных веществ в минимуме обычно находятся азот и фосфор. Калий входит в состав твердой части почвы. Большое значение для развития рстений, животных и микроорганизмов в почве имеет содержание микроэлементов в почвенном растворе. Молибден усиливает азотфиксацию, уран и радий в малых дозах оказывают стимулирующее действие на микрорганизмы, бор активирует нитрификацию, тяжелые металлы (кадмий, ртуть, свинец) снижают фиксацию азота и тормозят рост многих микроорганизмов (Бабьева, 1989).

Среди органических веществ почвенного раствора есть такие, которые оказывают действие в малых концентрациях. Это физиологически активные соединения, вырабатываемые микроорганизмами почвы или поступающие в виде корневых выделений. К физиологически активным веществам относятся витамины, ферменты, ауксины, гиббереллины, токсины, антибиотики и др.

Почвенный воздух. Почвенные поры, составляющие от 25% до 70% общего объема почвы, заполнены либо водой, либо воздухом. Содержание воздуха в почве зависит от ее влажности: газ и вода в почве – антагонисты, особенно в бесструктурной почве.

Состав почвенного воздуха значительно отличается от атмосферного и определяется, с одной стороны, биохимическими процессами, идущими в почве, а с другой – обменом с атмосферой.

Микрозональность почвы создает возможность одновременно развиваться в небольших участках аэробным и анаэробным организмам. В одном агрегате существует градиент концентрации кислорода при переходе от поверхности агрегата к его внутренним пространствам. Благодаря выделяющимся газам осуществляется связь микрозон между собой, так как газовая фаза более подвижна по сравнению с жидкой и твердой частями почвы (Бабьева, 1989).

Таким образом, почва представляет собой благоприятную среду для обитания и развития микрорганизмов.

1.2. Факторы среды, способствующие размножению микроорганизмов в почве

Условия, существующие в почве, в значительной степени определяют природу и количество содержащихся в ней микроорганизмов. На популяцию почвенных микроорганизмов оказывают влияние многие факторы; рассмотрим их последовательно.

Состояние микроорганизмов в почве определяется прежде всего экологическими условиями местообитания (Никитенко, 1991).

Органические вещества, служащие источником энергии и питательных веществ для большинства микроорганизмов, представляют собой, бесспорно, один из самых важных факторов, определяющих микробную популяцию почвы. Прямое следствие их роли в удовлетворении питательных и энергетических потребностей микробов состоит в том, что в почвах, богатых органическими веществами, развивается значительно более плотная популяция микроорганизмов. Кроме того, органические вещества оказывают косвенное благоприятное воздействие на микроорганизмы, улучшая некоторые условия среды, например, улучшая структуру почвы, увеличивая её способность задерживать влагу и способствуя термическому равновесию почвы (Пошон, Баржак, 1960). Сапрофитная микрофлора, которой в настоящей работе уделяется основное внимание, конечно, прежде всего отражает особенности органических соединений почвы.

Необходимо отметить, что органические вещества распределены в почве не равномерно, а зонально (Мишустин, Перцовская, 1954).

Исследования Лебедева (2005) показали, что все виды органических субстратов усиливают биологическую активность дерново-подзолистых почв. На их фоне в пахотном слое возрастает количество основных групп микроорганизмов.

Результаты, полученные Броуном и Бентоном (1930), Грэем и Мак-Мастером (1933) и в особенности М.И. Тимониным (1935), хорошо иллюстрируют влияние органических веществ на плотность и общую активность микрофлоры. Анализируя десятки профилей различных типов, Тимонин отметил постоянное совпадение между концентрацией органических веществ в различных изученных горизонтах и содержанием в них микроорганизмов. Поверхностные горизонты более богаты органическими веществами, чем горизонты, расположенные глубже; более богаты также и микроорганизмами. Однако подобное соответствие наблюдается не во всех случаях, и следует остерегаться делать вывод, что чем больше органических веществ, тем больше микроорганизмов.

Выявлено, что изменение содержания микробной биомассы в чернозёме типичном коррелирует с содержанием в нём влаги и лабильных гумусовых веществ (Глазунов, 2009).

Другие авторы: Д. Г. Звягинцев с соавторами (Звягинцев, 1978а, 1987; Кожевин и др., 1979) считают, что почва в целом представляет собой среду, слабо обеспеченную доступным органическим веществом, неблагоприятную для развития микроорганизмов. Громадный пул почвенных микроорганизмов представлен в основном клетками в состоянии замедленного метаболизма, так как поступающего в почву органического вещества (ежегодный опад надземной и подземной биомассы) достаточно только для поддержания почвенных микроорганизмов в состоянии основного обмена (Никитенко, 1991).

Природа, число и активность бактерий различных типов зависит одновременно от наличия питательных веществ и почвенных условий (Пошон, Баржак, 1960).

Усвоение органического вещества в значительной степени зависит от таких факторов среды, как влажность и температура почвы (Criffin, 1963).

Выявлено, что возбудитель листериоза размножается и долго сохраняется в почвах с высоким плодородием. Из почвы (за исключением почвы хвойных лесов) листерии выделяются круглый год (Григорьев, Честнова, 2002).

Влажность. Микроорганизмы довольно требовательны к влаге, и более или менее интенсивное их развитие происходит лишь в достаточно увлажненной почве. Совершенно очевидно, что не только для разных групп, но даже и для различных видов почвенных микроорганизмов могут быть найдены специфические отличия по их отношению к влаге.

М. Г. Еникеева (1947) приходит к заключению, что бактерии могут использовать для своего развития пленочную воду, труднодоступную высшим растениям в силу её малой подвижности. По данным Еникеевой, при наличии гигроскопической влаги хотя и слабо, но все же могут развиваться грибы. Оптимальное развитие микробов имеет место в присутствии капиллярной воды. Гравитационная вода оказывает неблагоприятное влияние на аэробов. Анаэробные микроорганизмы, конечно, способны активно размножаться и при очень высоких степенях увлажнения (Мишустин, Перцовская, 1954).

Влажность, несомненно, оказывает большое влияние на численность и активность микробной популяции в почве. Однако некоторые авторы, не обнаружившие определенной зависимости между содержанием воды и микрофлорой в почве, отрицают её существование (Timonin, 1935; Brown, Benton, 1930), тогда как другие дают ей объяснения, нередко противоречащие одно другому.

Н.В. Алесина, Т.А. Снисаренко (2010) в своих исследованиях выяснили, что влажность почвы 60% является оптимальной для развития микроорганизмов ризосферы, в частности для бактерий рода Pseudomonas, Недостаточная влажность почвы не стимулирует развитие какой-либо отдельной группы микроорганизмов, но в целом неблагоприятно сказывается на микробном составе ризосферы, за счёт уменьшения общего количества микроорганизмов.

H. L. Иенсен (1934) показал, что в луговых почвах Нового Южного Уэльса снижение влажности приводит к увеличению отношения актиномицеты/бактерии (в результате уменьшения числа бактерий) и к уменьшению количества грибов. Наоборот, W. G. Игглтон (1938) для луговых почв Англии отмечает, что увеличение влажности оказывает сильное стимулирующее действие на бактерии, довольно сильное на актиномицеты, но, не оказывает никакого влияния на грибы. По мнению H. J. Кона (1932) грибам благоприятствует относительно сухая почва.

При исследовании роста актиномицетов на агаризованной среде с различным давлением влаги, впервые установлено, что каждому уровню влажности соответствует определенная специфика развития актиномицетов. При уровне давления влаги -53,6 МПа (aw 0,67) развитие ограничивается стадией выхода в трубку. При влажности -22,6 МПа (aw 0,86) и -11,6 МПа (aw 0,92) большинство актиномицетов образуют микроколонии без спор, а при -2,8 МПа (aw 0,98) актиномицеты осуществляют полный цикл развития от прорастания споры до спорообразования воздушного или субстратного мицелия на макроколониях. Установленные факты позволяют считать, что жизнедеятельность мицелиальных прокариот в почве осуществляется в условиях низкой влажности среды обитания, мало пригодной для активности немицелиальных бактерий (Дорошенко, 2005).

Водный баланс оказывает большое влияние на жизнедеятельность листерий. В почвах с влажностью 22% и ниже они не размножаются, и их концентрация снижается. При увеличении влажности почвы до 60% число этих бактерий способно возрастать в 100-200 раз (Григорьев, Честнова, 2002).

Таким образом, влажность оказывает в основном лишь качественное действие. При увеличении влажности до определенного максимума активность всех аэробных микроорганизмов усиливается в одинаковой степени; дальнейшее же повышение влажности сопровождается, наоборот, снижением активности аэробов, что обусловливается уменьшением кислорода вследствие избытка воды (Пошон, Баржак, 1960).

Обычно максимальное количество микроорганизмов в почве имеется во влажный и теплый период времени (Мишустин, 1975).

Аэрация. Воздух в почве не образует непрерывного слоя, но находится в сильно диспергированном состоянии и в большей или меньшей степени адсорбирован на коллоидах. Кроме того, часть воздуха может быть растворена в почвенной воде, а часть воды, превращаясь в пар, более или менее насыщает атмосферу почвы.

Аэрация почвы находится, следовательно, в зависимости от степени влажности; она усиливается, когда влажность уменьшается, и, наоборот, снижается, когда влажность почвы повышается. Но любое усиление аэрации благоприятно отражается на активности нитрифицирующих и азотфиксирующих бактерий, актиномицетов, грибов и других организмов, разлагающих органические вещества путем окисления. Поэтому в легких, хорошо аэрируемых почвах, в противоположность тяжелым почвам, возможность накопления органических веществ ограничена(Пошон, Баржак, 1960).

Температура. Для большинства почвенных микроорганизмов оптимальные температуры обычно лежат в районе 35°, т. е. значительно выше, чем температура почвы даже в летнее время. Что касается биологических реакций, то считается, что при каждом повышении температуры на 10° они ускоряются в 2-3 раза.

Для температуры, так же как и для степени влажности, можно установить качественную связь с активностью микроорганизмов. Активность последних усиливается с повышением температуры до известного максимума, а затем начинает снижаться.

Было установлено, что повышение температуры стимулирует общую активность микрофлоры. Так Г. Л. Иенсен (1936) показал, что с повышением температуры количество СО₂, выделенное 1 млрд. бактерий, увеличивается: при 15° оно соответствовало 16% сухого веса бактерий, при 28° повышалось до 30%, а при 37° - до 50%.

По мнению одних исследователей (Fener, Franch, 1938), повышение температуры приводит к ускорению развития бактерий; по мнению же других, наблюдается обратная тенденция. Независимо от того, обуславливаются ли эти противоречия различиями в экспериментальных условиях (различные методики и почвы) или другими факторами, они не дают возможности делать какие либо достоверные выводы о количественном влиянии температуры на почвенные микроорганизмы.

Исследования влияния температуры затрудняется еще и с тем, что большинство почвенных микроорганизмов обладает способностью развиваться в довольно широких пределах колебаний температуры и быстро адаптироваться к ее изменениям (Пошон, Баржак, 1960).

Исследования Ю.И. Григорьева, Т.В. Честновой (2002) выявили резкое понижение концентрации листерий в почве в летнее время. Это происходит тогда, когда длительно устанавливается стабильно высокая температура, и нет дождей.

Глубина. Максимальное количество микроорганизмов обнаруживается обычно в поверхностных слоях почвы. Горизонты А, как правило, значительно богаче, чем горизонты В, которые, с вою очередь содержат больше микробов, чем горизонты С. Однако численность микроорганизмов уменьшается очень неравномерно, если учитывать подразделения этих трех групп горизонтов.

Чаще всего по мере увеличения глубины количество питательных веществ уменьшается. Этим последним обстоятельством обусловливается, по-видимому, часто наблюдаемое относительное увеличение численности анаэробов (бактерий и грибов, по данным Тимонина (1935)) и актиномицетов по сравнению с общим числом микроорганизмов по мере углубления в почву и соответствующее ограничение развития аэробных организмов.

Максимальное развитие микробная популяция достигает там, где (в рассматриваемом профиле) имеются обильные источники питательных веществ и энергии и где окружающие условия являются оптимальными, причем совокупность этих условий обычно встречается в верхних слоях почвы. По мере углубления и удаления от горизонтов почвы, обладающих этими оптимальными условиями, численность почвенных микроорганизмов проявляет тенденцию к уменьшению, но равномерность и скорость этого снижения зависят и от других факторов, в частности от распределения и от природы органических веществ, аэрации, кислотности (Пошон, Баржак, 1960).

Листерии, подобно бруцеллам, в слое почвы на глубине 2-3 см при низких температурах остаются активными до 6 месяцев (Григорьев, Честнова, 2002).

pH. Кислотность среды, в которой обитают микроорганизмы, оказывает на них большое влияние. Это один из наиболее важных факторов, определяющих рост и размножение организмов, так как он действует на организм непосредственно или косвенно через ионное состояние и доступность многих ионов и метаболитов, стабильность макромолекул. Значения реакции среды определяют состояние веществ в окружающей среде.

Для большинства микроорганизмов оптимальны значения реакции среды около рН 7. Очень кислая или очень щелочная реакции обычно токсичны для бактерий (Емцев, Мишустин, 2005).

Изменения pH почвы как в одну, так и в другую сторону может оказывать влияние на численность и активность живущих в ней микроорганизмов. Оптимум pH для бактерий и актиномицетов обычно лежит между pH 6 и 8, а для грибов он ниже, часто между pH 3 и 5 (Пошон, Баржак, 1960).

Способность L. monocytogenes выживать в значительном диапазоне рН среды, широко освещена в литературе. По данным определителя бактерий Берджи (1997), листерии не являются кислотоустойчивыми микроорганизмами, поэтому диапазон рН, в котором осуществляется их выживание и размножение составляет от 6 до 9. Однако, по мнению J.M. Farber (1991), а также И.С. Тартаковского с соавт. (2002), этот диапазон значительно выше и составляет от 4 до 10.

Величина рН играет значительную роль в сохранении листерий в почве. В почвах хвойных лесов, имеющих показатель рН 3,3-4,6, они почти не размножаются (Григорьев, Честнова, 2002).

1.3 Listeriamonocytogenes – возбудитель сапрозоонозов

Внешняя среда как главная среда обитания микроорганизмов, способных вызывать болезни человека, признана недавно. Существенно, что такие микроорганизмы, как правило, способны поражать не только человека, но и животных, а некоторые из них – и растения. Болезни, вызываемые такими микроорганизмами, стали называть сапронозами, хотя этимологически этот термин нельзя признать удачным. Выделено несколько эколого-эпидемиологических групп сапронозов. Дискутируется вопрос о том, дополнительной или случайной средой обитания для этих возбудителей является организм человека, животных и растений (Ряпис, Беляков, 1997).

Следует допустить, что существуют две группы сапронозов, возбудители одной из которых (истинные сапронозы) не связаны с теплокровным организмом, а возбудители другой (сапрозоонозы) более или менее связаны с ним. Для возбудителей сапронозов окружающая среда (почвенные, водные ценозы) – это нормальное существование, а для сапрозоонозов – среда, к которой они вынуждены адаптироваться, изменяясь (Сомова с соавт., 2009) вплоть до крайней формы изменчивости некультивируемого или покоящегося состояния, и переживать эти условия до возвращения пролиферативной функции (Бузолева, 2011).

Процесс существования патогенных бактерий в естественных экосистемах в настоящее время мало изучен. На самом деле автономное обитание в почве или воде многих патогенных бактерий и грибов, вызывающих инфекционные болезни человека и животных, закономерные и многообразные связи с почвенными и водными организмами делают их полноправными сочленами естественных экосистем, главным образом, почвенных и водных. Циркуляция патогенных бактерий - возбудителей сапронозов осуществляется благодаря одним и тем же эпидемиологическим законам, что и циркуляция возбудителей антропонозов и зоонозов, но значительно менее изучена (Зуев, 2004).

До 80-х годов ХХ века листериоз рассматривался как типичный зооноз с фекально-оральным механизмом передачи возбудителя (Seeliger, 1992; Сб. сан-вет правил, 1996).

L. monocytogenes относится к возбудителям сапрозоонозов и обладает двойсвенной (сапрофитной и паразитической) природой, благодаря чему способна существовать как в эндотермных, так и в эктотермных организмах, растительных объектах, а также в почвенной и водной средах. Для L. monocytogenes характерен широкий диапазон экологической толерантности, т.е. способность выживать в различных условиях (Бузолева,Терехова, 2004).

Следует отметить, что первичным природным резервуаром листерий является почва, а далее возбудитель способен попадать в растительные субстраты. Источником заражения сельскохозяйственных животных служат корма, в частности, силос, где листерии активно размножаются и неопределенно долго существуют (Гершун, 1981, 1988).

Возбудитель листериоза выделен от более 90 видов диких и домашних животных, птиц, рыб, моллюсков, насекомых и клещей. Листерии – частый компонент фекальной микрофлоры многих млекопитающих (Schuchat et al, 1991). Традиционным источником инфекции для человека служат сельскохозяйственные животные и грызуны.

Данные исследователей последних лет свидетельствуют об исключительно широких адаптативных способностях листерий, позволяющих им размножаться в сапрофитической среде в различных природных субстратах. LМ способны к сохранению и размножению в различных, абсолютно контрастных по своим характеристикам, экологических нишах: теплокровный организм животных и человека, растения, морские и речные гидробионты, вода (Беляков, Литвин, 1994). Листерии способны к размножению в широком диапазоне температуры (4-45oС), рН (4,8-9,0) и влажности, в присутствии NaCl (20%) и 15% СО2. Высокая метаболическая пластичность листерий обусловливает возможность перехода их от сапрофитической фазы к паразитической и наоборот. Эти обстоятельства наряду с традиционными представлениями о связи листерий с теплокровными животными позволяют рассматривать листериоз как типичный сапрозооноз (Литвин, 1996).

Известно, что в почвенных и водных биоценозах регуляция численности L. monocytogenes может осуществляться посредством экзогенных метаболитов бактерий, стимулирующих их размножение (Тирранен, 1989; Сидоренко, 2001; Бухарин и др., 2003).

1.4 Почвенные микроорганизмы – продуценты биологически активных веществ

Микроорганизмы, подобно более высокоорганизованным формам, выделяют продукты, образующиеся в процессе дыхания, а также неассимилируемые остатки пищи. Кроме того, некоторые организмы образуют, по-видимому, специфические вещества, обладающие угнетающими свойствами в отношении их самих или других организмов. Одни их этих веществ, еще очень плохо изученные, задерживают развитие микроорганизмов-продуцентов даже на средах, полностью удовлетворяющих их потребности в питательных веществах; другие, лучше изученные благодаря все повышающемуся интересу к ним со стороны патологов, оказывают специфическое антибиотическое действие на другие микроорганизмы.

Поведение и метаболизм микробов в смешанных культурах отличаются от таковых в чистых культурах. Принцип, на котором построена вся экологическая микробиология, вытекает из этого основного положения (Пошон, Баржак, 1960).

Если почвенные микроорганизмы могут оказывать друг на друга взаимно благоприятное действие, то эти факты вовсе не исключают того, что часто между ними происходит борьба или по крайней мере наблюдается конкуренция за обеспечение их собственного развития и питания. Быстрое исчезновение из почвы большинства бактерий, вызывающих инфекционные болезни человека и животных, обусловливается, вероятно, именно наличием антагонистических взаимоотношений. За некоторыми исключениями (возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма, сибирской язвы, актиномикоза), патогенные бактерии быстро инактивируются или разрушаются обычной микропопуляцией почвы (Kligler, 1921; Waksman, 1940, 1945). Действие последней проявляется либо косвенным образом в результате влияния ее на окружающие условия (физико-химические изменения среды, истощение запасов усваиваемых питательных веществ), либо непосредственно (поедание представителями микрофауны, разрушение бактериофагами или сапрофитными микроорганизмами, образование антибиотиков).

В настоящее время установлено, что очень многие микроорганизмы, выделенные из почвы, в частности бактерии, актиномицеты и грибы, способны вырабатывать антибиотические вещества.

Из спороносных бактерий, живущих в почве, антагонисты очень часто встречаются среди представителей Bacillus, из неспороносных – среди Pseudomonadaceae(Пошон, Баржак, 1960).

Почвенные грибы и прокариоты образуют разнообразные летучие соединения органической природы. Известен, например, геосмин – летучее вещество со специфическим запахом земли. Его выделяют актиномицеты. Микроорганизмы способны проводить метилирование ртути и других металлов с образованием высокотоксичных продуктов, например монометил- и диметилртути. Органические летучие вещества оказывают влияние на развитие микроорганизмов, иногда меняя их морфологию, иногда действуя как антибиотики. Их называют, поэтому средовыми гормонами. Выделяют газообразные вещества и корни растений (Бабьева, 1989).

Естественная микрофлора почвы обладает выраженной антагонистической активностью в отношении других микроорганизмов. Этот факт подтверждает известный постулат о внешней среде как о «кладбище» для патогенных бактерий. Действительно, И.А. Максименковой (1987) установлено, что в естественной (нестерильной) почве – как в лабораторных экспериментах, так и в полевых условиях, – популяция псевдотуберкулезного микроба сохраняет весьма низкий уровень численности, в то время как в аналогичной стерильной почве иерсинии достигают высоких концентраций. При сопоставлении этих данных можно заключить, что подавление бактериальной популяции вызывается комплексом биотических факторов почвы – антагонистическим действием микроорганизмов и выеданием хищниками, в первую очередь, простейшими (Литвин В.Ю. и др., 1997). Выраженная антагонистическая активность почвенных микроорганизмов также подтверждается исследованиями Н.Д. Архиповой (2002), в которых установлено действие биологически активных веществ сапрофитного микроорганизма B. subtilis на популяцию патогенных микобактерий. Однако, в сфере учения о сапронозах, влияние среды обитания на патогенные микроорганизмы не ограничивается односторонним губительным действием. Так, представители свободноживущих простейших - инфузорий и амеб — способны поддерживать существование патогенных микроорганизмов в почвенной экосистеме, вступая с ними в симбиотические взаимоотношения (Ly et al., 1990). Показано, что эризипелотриксы в ассоциации с инфузориями длительно существовали как в стерильной, так и в нестерильной почвенной вытяжке, тогда как в отсутствие простейших эризипелотриксы быстро отмирали (Пушкарева, 1994).

Довольно детальное исследование бактерий-антагонистов различных почв, проведенное Т. В. Гудковой (1950), привело к выводу, что среди бактерий основными продуцентами антибиотических соединений в почвах являются Bac. asterosporus, Bac. mesentericus, Bac. subtilisи др. Среди других видов антагонистически действующие представители встречаются гораздо реже.

Сергеева А.Г. и Куимова Н.Г. (2006), проделав работу, целью которой являлось изучение разнообразия актиномицетов аллювиальных почв и донных отложений бассейна р. Амур, и поиск новых, активных продуцентов биологически активных веществ, выяснили, что в подавляющем большинстве случаев отдельные виды актиномицетов синтезируют не один, а несколько вторичных метаболитов (антибиотики, пигменты и т.д.), обладающих антагонистическими свойствами по отношению к условно-патогенной микрофлоре..

Накопляющиеся в почве продукты жизнедеятельности микроорганизмов и растений, а также сложившиеся взаимоотношения между многими группами почвенного микробиоценоза приводят к его относительной стабильности и тенденции к устранению чуждых для него форм микроорганизмов (Мишустин с соавт., 1979).

Анализ данных литературы показывает, что почвенные микроорганизмы являются продуцентами биологически активных веществ различного действия, как антагонистического, так и стимулирующего.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Объекты исследования

В качестве объектовисследования были использованы штаммы сапрофитных бактерий, выделенных из почвы б. Лазурная, где, по данным литературы, были индицированы листерии.

В качестве модельных бактерий для исследования использовали 10 штаммов Listeriamonocytogenes, которые были выделены от больных листериозом людей и животных, представленных в таблице 1.

Таблица 1 - Штаммы Listeriamonocytogenes, используемые в работе

Порядковый номер	Вид	№ штамма
1	L. monocytogenes	37206/4 №311
2	L. monocytogenes	8708
3	L. monocytogenes	9148/1
4	L. monocytogenes	6144 №315
5	L. monocytogenes	4835/6 №316
6	L. monocytogenes	15861 №302
7	L. monocytogenes	2786 №313
8	L. monocytogenes	5642/6 №313
9	L. monocytogenes	12731/8-8097
10	L. monocytogenes	9156/2

2.2. Методы проведения опыта

1. Выделение в культуру сапрофитных почвенных бактерий

Для выделения сапрофитных бактерий 0,5 г почвы помещали в пенициллиновый флакон, и заливали физиологическим раствором. Оставляли на сутки в темном месте. Полученную эмульсию высевали на три чашки с питательным агаром и на три чашки с казеиново-дрожжевым агаром по методу Дригальского. Через сутки выросшие колонии сапрофитов откалывали и сеяли на скошенный агар. Таким образом, было обработано 6 проб почвы.

2. Метод определения стимулирующего действия летучих метаболитов сапрофитов на размножение листерий

Для отбора активного штамма использовали скрининговый метод Л. С. Тирранен (1980). Со скошенного агара делали смыв культуры сапрофитов. Полученной суспензией засевали “газоном” чашки Петри со средой (высевали штаммы бактерий выделенные из почвы). Производили посев уколом листерий на чашки с казеиново-дрожжевым агаром (всего разместили 10 штаммов на чашку Петри со средой). Чашки с посевами сапрофитов и листерий соответственно состыковывали. Посевы выдерживали в течение семи суток при комнатной температуре (рисунок 1).

Рисунок 1 - Чашки с посевами Рисунок 2 - Зоны роста L. monocytogenes

Для оценки размножения L. monocytogenes замеряли зоны роста в месте укола (приложение А, рисунок 2). Контролем служили чашки с тест-культурами, не подвергавшимися действию летучих продуктов жизнедеятельности испытуемых микроорганизмов. Результаты сравнения размеров колоний выражали в миллиметрах. Всего было проведено 32 варианта опыта.

Воздействие культуры сапрофитов на тест-культуру L. monocytogenes оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер колоний тест-культур в опыте был соответственно увеличен или снижен на 20% и более по сравнению с контролем. Если размер колоний тест-культуры L. monocytogenes в опыте отличался от контрольной не более чем на ±20%, действие испытуемой культуры оценивали как нулевое.

Штамм сапрофита, отличающийся биологической активностью в отношении листерий в скрининговом методе, отбирали для следующего этапа работы.

3. Определение биологической активности экзометаболитов сапрофитных бактерий на штаммах L. monocytogenesфизиологическим методом

Получение экзометаболитов

Культуру бактерий, выросшую на скошенном агаре, через сутки смывали физиологическим раствором. Полученную жидкость помещали в центрифужные стаканчики, отделяли от клеток центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут и фильтровали через бактериальный фильтр Millex GP с диаметром пор 0,22 нм.

Определение биологической активности экзометаболитов

Определение биологической активности экзометаболитов сапрофита №7, взятых в концентрации 0,5 мл; 1мл; 1,5 мл; 2 мл; 2,5 мл; 3 мл, на штамме L. monocytogenes 6144 №315

Для этого взяли 6 флаконов с 50 мл раствора Петерсона-Кука, в которые добавляли по 1 мл эмульсии L. monocytogenes (живая культура 10⁹ КОЕ/мл) и по 0,5 мл; 1 мл; 1,5 мл; 2 мл; 2,5 мл; 3 мл метаболитов бактерий. ). В контроле по 1 мл эмульсии L. monocytogenes.

Для построения кривой роста бактерий определяли динамику численности последних по мутности культуральной среды на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Сразу после загрузки опыта наблюдалась исходная оптическая плотность. Наблюдение за ростом вели в течении 11 суток.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При использовании скринингового метода Л.С. Тирранен из образцов почвы были отобраны штаммы сапрофитных бактерий, обладающие стимулирующим действием в отношении роста патогенных листерий. Следует отметить, что все штаммы исследуемых сапрофитов в той или иной степени стимулировали рост листерий, по сравнению с контролем (приложение А).

По результатам эксперимента построена таблица взаимодействия культуры сапрофитов и листерий на уровне летучих метаболитов (приложение Б), в которой определено 319 данных. Среди них 287 положительных (летучие метаболиты стимулировали ростL. monocytogenesотносительно контроля), 11 отрицательных (летучие метаболиты подавляли рост L. monocytogenes). Остальные результаты (21результат) оценены как нулевые, хотя они могли быть слабыми положительными или отрицательными, но не учитываемыми данным методом (рисунок 3).

Рисунок 3 - Влияние летучих метаболитов сапрофитных бактерий на рост L. monocytogenes.

Среди штаммов сапрофитных бактерий, которые оказали положительное воздействие на L. monocytogenes, были отмечены: активные (стимулировали рост ≥100%), средние (стимулировали рост ≥50%), слабые (стимулировали рост до 50%) (рисунок 4).

Рисунок 4 – Оценка положительного влияние летучих метаболитов сапрофитных бактерий на рост L. monocytogenes.

Для выполнения следующей задачи, определяли биологическую активность экзометаболитов наиболее активного штамма.

Как видно из данных, представленных в приложении А, наибольшую активность в отношении стимуляции роста Listeria monocytogenes (штаммы 37206/4 №311; 8708; 914811; 6144 №315; 4835/6 №310; 15861 №302; 2780 №318; 5642/6 №313; 12731/8-8097; 9156/2) оказал штамм сапрофита №7.

В дальнейшем определяли биологическую активность экзометаболитов штамма сапрофита №7 на штамме L. monocytogenes (штамм 6144 №315)физиологическим методом. Были взяты концентрации экзометаболитов: 0,5 мл, 1 мл, 1,5 мл, 2 мл, 2,5 мл, 3 мл. . С этой целью в качестве исходной среды для роста Listeria monocytogenes , в которой будут оценивать рост листерий, использовали экзометаболиты сапрофитных бактерий в жидкой среде. Для этого сапрофиты выращивали в минеральной среде сутки. Затем отделяли бактерии с помощью бактериальных фильтров. В фильтрат вносили культуру L. monocytogenes по оптической плотности равной 0, 1.Наблюдение вели в течении 11 суток., снимая показатели спектрофотометра против контроля.

Рисунок 5 - Влияние экзометаболитов сапр. №7, 0,5 мл на рост Listeriamonocytogenes(штамм 6144 №315).

На рисунке 5 видно, экзометаболиты незначительно стимулировали рост L. monocytogenes в начале опыта, максимальное стимулирующее действие на 322% относительно контроля отмечено на седьмые сутки. Показания контроля на последние сутки опыта достигли нулевых значений.

Рисунок 6 - Влияние экзометаболитов сапр. №, 1 мл на рост Listeriamonocytogenes(штамм 6144 №315).

Из данных, представленных на рисунке 6, видно, что на третьи сутки стимулирование листерий экзометаболитами сапрофита составило на 122%, постепенно увеличиваясь на четвертые сутки (на 157%) и достигло максимума на седьмые сутки (на 289%).

Рисунок 7 - Влияние экзометаболитов сапр. №7, 1,5 мл на рост Listeriamonocytogenes(штамм 6144 №315).

В отличии от двух предыдущих концентраций, стимулирование L. monocytogenes (штамм 6144 №315) экзометаболитами сапрофита №7 в концентрации 1,5 мл оказалось максимальным: на 589% относительно контроля на седьмые сутки опыта.

Рисунок 8 - Влияние экзометаболитов сапр. №7, 2 мл на рост Listeriamonocytogenes(штамм 6144 №315).

Экзометаболиты сапрофита №7 в концентрации 2 мл оказали слабый угнетающий эффект в первый день опыта, затем на рисунке 8 видно, что рост L. monocytogenes (штамм 6144 №315) на вторые, третьи и четвертые сутки опыта практически не отличался относительно контроля. На седьмые сутки опыта отмечен значительный стимулирующий эффект (311%).

Рисунок 9 - Влияние экзометаболитов сапр. №7, 2,5 мл на рост Listeriamonocytogenes(штамм 6144 №315).

На рисунке 9 видно, что при увеличении концентрации до 2,5 мл наблюдается стимулирование с максимумом на седьме сутки (на 355%).

Рисунок 10 - Влияние экзометаболитов сапр. №7, 3 мл на рост Listeriamonocytogenes(штамм 6144 №315).

В отличиие от предыдущей концентрации, экзометаболиты сапрофита №7 в концентрации 3 мл оказали больший стимулирующий эффект на седьмые сутки опыта (на 467%).

Таким образом, выявлено, что при увеличении концентрации усиливается стимулирующий эффект, причем максимальное стимулирование на седьмые сутки опыта (на 589%) отмечено при концентрации 1,5 мл, затем при увеличении концентрации экзометаболитов сапрофита №7 до 2 мл, наблюдается слабое угнетение в первые сутки опыта и снижение стимулирования на седьмые сутки (на 311%). При последующем увеличении концентрации (до 2,5 мл, 3 мл) наблюдается увеличение стимулирующего эффекта.

.

4. Выводы

1. В культуру выделено штаммов почвенных бактерии, которые в микробных сообществах с L. monocytogenes в большей степени стимулировали (90% случаев), чем угнетают рост патогенных листерий.

2. По результатам скринингового анализа наибольшую биологическую активность в отношении стимуляции роста Listeria monocytogenes проявил штамм сапрофита №7 ( % стимуляция роста по сравнению с контролем ).

3. Из всех листерии

4. Подобрана наиболее оптимальная концентрация экзометаболитов – 1,5 мл, при которой отмечен максимальный стимулирующий эффект. Стимуляция роста L. monocytogenes при взаимодействии с экзометаболитами сапрофитов, зависела от выбранной концентрации экзометаболитов сапрофитов, от биологических особенностей, как сапрофитов, так и штамма листерий

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Алесина Н.В., Снисаренко Т.А. Влияние различной влажности почвы на состав микробных ценозов ризосферы и ризопланы на примере овса (Avena sa tiva) / Н.В. Алесина, Т.А. Снисаренко // Вестн. МГОУ. Сер. Естественные науки. - 2010. - №2. – С. 38-44.

Бабьева И. П. Биология почв. - М.: Изд-во Московского университета, 1989. - 336 с. : ил.

Беляков В.Д., Литвин В.Ю. и др.Патогенные бактерии, общие для человека и растений. В:М., 1994, с.13-14.

Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды: Автореф. дис. … д-ра биол. наук / Бузолева Л. С. - Владивосток, 2001. - 48 с.

Бузолева Л.С. Сапрозоонозы: вчера, сегодня, завтра. Бюллетень СО РАМН, Том 31, №4, 2011

Бузолева Л.С., Сидоренко М.Л. Влияние газообразных метаболитов почвенных бактерий на размножение Listeriamonocytogenes и Yersiniapseudotuberculosis// Журн. микробиол., 2005. №2. С. 7-11.

Бузолева Л.С., Терехова В.Е. Выживаемость и адаптивная изменчивость штаммов Listeria monocytogenes в морской и речной воде. Ветеринарная патология. № 4. 2004. С. 31-35.

Бухарин О.В. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р / О. В. Бухарин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2000. – Т. 130, № 7.

Бухарин О.В. Межбактериальные взаимодействия Текст. / О.В. Бухарин, Б. Я. Усвяцов, JI.M. Хуснутдинова // Журн. микробиол. — 2003.-№4.-С. 3-8.

Гершун В. И. Влияние абиотических факторов на жизнеспособность листерий в почве. Сиб. вестник с/х науки. Новосибирск, 1980, 3: 78-81.

Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-ата, 1981.

Глазунов Г. П. Активный пул органического вещества чернозема типичного и его связь с урожайностью зерновых культур: Автореф. дис. … к-та с/х наук/ Глазунов Г. П. – Курск, 2009. – 181 с.

Григорьев Ю.И., Честнова Т.В. Эпидемиологическая оценка выживаемости листерий в окружающей среде// Вестник новых медицинских технологий. 2002.

Гудкова Т. В. Бактерии-антагонисты кишечно-тифозной группы в подзолистых почвах. Гигиена и санитария, 1950, 5, 41.

Дорошенко Е. А. Влияние влажности на рост и развитие почвенных актиномицетов: Автореф. дис. … к-та биол. наук/ Дорошенко Е. А. - Москва, 2005. – 97 с.

Егоров Н.С., Ландау Н.С. Биосинтез биологически активных соединений смешанными культурами микроорганизмов. Прикладная биохимия и микробиология. 1982, 18 (6): 835 - 849.

Елинов Н.П. Химическая микробиология. М.: Высш. шк., 1989. – 448 с.

Еникеева М. Г. Влажность почвы и деятельность микроорганизмов. Тезисы диссертации. 1947.

Жизнь растений. В 6-ти т. Гл. ред. чл. -кор. АИ СССР, проф. Ал. А. Федоров. Т. 2. Грибы. Под. ред. проф. M. В. Горленко. М., «Просвещение», 1976, 479 с., ил.

Звягинцев Д. Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. – М.: Изд-во МГУ, 1973. – 256 с.

Зуев В. С. Ветеринарная патология, 2004. № 4. С. 11-16.

Кожевин П. А. Микробные популяции в природе. – М.; Изд-во МГУ, 1989. – 170 с.

Кузнецов В. Г., Раковский В. В., Валекжанин Т. С., Сомов Г. П. Изучение эпидемиологии дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки в Приморском крае. Выделение псевдотуберкулезного микроба из почвы и роль почвы в распространении инфекции. Журн. микробиол. 1976, 7: 138-139.

Лебедев Н. В. Влияние различных органических субстратов на плодородие дерново-подзолистых почв и продуктивность зернового и зернотравяного звеньев севооборота в Верхневолжском регионе: Автореф. дис. … к-та с/х наук/ Лебедев Н. В. – Тверь, 2005. – 180 с.

Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблемы и факты. Журн микробиол 1996; 2:101-4.

Миллер Г. Г. Биологическое значение ассоциаций микроорганизмов // Вестник РАМН. – 2000. – С. 45–51.

Мишустин Е. Н. Ассоциации почвенных микроорганизмов. М., «Наука», 1975, стр. 1-105.

Мишустин Е. Н., М. И. Перцовская. Микроорганизмы и самоочищение почвы. М.: Изд-во Академии наук СССР, 1954. - 651 c.

Мишустин Е. Н., Перцовская М. И., Горбов В. А. Санитарная микробиология почвы. М.: Наука, 1979, с. 1-304.

Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др. Экология микроорганизмов. – М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.

Никитенко З. И. Микробный мониторинг наземных экосистем. - Новосибирск: Наука, сибирское отд- е, 1991. – 222 с.

Никитина Д. И. Почвенная микробиология/ Пер. с англ. В. В. Новикова. – М.: Колос, 1979. – 316 с., ил.

Одум Ю. Основы экологии. М., Мир, 1975.

Пошон Ж., Г. де Баржак. Почвенная микробиология. - М.: Изд-во иностранной литературы, 1960. – 560 с.

Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сб сан вет правил. М., 1996.

Ряпис Л.А. Беляков В.Д.. Ж. Микробиол., 1997, 5, 96-99.

Сергеева А.Г., Куимова Н.Г. Актиномицеты как продуценты биологически активных веществ // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. – 2006. – Вып. №22. – С. 88-90.

Сидоренко М. Л., Л. С. Бузолева. Влияние летухих метаболитов сапрофитной микрофлоры почв на размножение патогенных бактерий// Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, N-3, 2004. С. 18-23.

Сидоренко М.Л. Влияние летучих метаболитов бактерий рода Pseudomonas на размножение патогенных бактерий Текст. / М.Л. Сидоренко // Тихоокеанский медицинский журнал. — 2001. — №7. — С. 131-134.

Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С. Характер взаимоотношений сапрофитной микрофлоры почв через газообразные метаболиты// Микробиол., 2008. Том 77. №2. С. 273-277

Скворцов В.В., Киктиенко В.С., Кучеренко В.Д. Выживаемость и индикация патогенных микробов во внешней среде. – М.: Медицина, 1966. – 350 с.

Сомов Г. П., Литвин В. Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий (экологические аспекты). Новосибирск: Наука, 1991. - 204 с.

Сомова Л. М. Ультраструктура патогенных бактерий в разных экологических условиях/Л. М. Сомова, Л. С. Бузолева, Н. Г. Плеханова; под ред. Н. Н. Беседновой. – Владивосток: Медицина ДВ, 2009. – 200 с.: ил.

Сомова Л.М., Бузолева Л.С., Плехова Н.Г. Ультраструктура патогенных бактерий в разныхэкологических условиях. Владивосток, 2009.

Тирранен JI.C. Характер взаимодействия микроорганизмов через их газообразные метаболиты Текст. / JI.C. Тирранен., Б.Г. Ковров, О.А. Черепанов // Журн. микробиол. — 1980. Т. 49, вып. 5. -С. 788-793.

Brown P. E., Benton T. H., Iowa Agr. Exp. Sta. Res. Bull, 132, 1930.

Conn H. J., N. Y. State Agr. Exp. Sta. Tech. Bill., 204, 1932.

Eggleton W. G. E., Soil. Sci., 46, 351 (1938).

Fener D., Franch M., Arch. Microbiol., 4, 447 (1933); 8,, 249 (1937); 9, 193 (1938).

Gray, Mc Master, Can. J. Research., 8, 375 (1933).

Jensen H. L., Proc. Linn. Soc. N. S. Wales, 59, 101 (1934).

Jensen H. L., Proc. Linn. Soc. N. S. Wales, 61, 27 (1936).

Kligler I. J., Rockefeller Inst. Med. Res., 15, 1921.

Schuchat A., Swaminathan B., Broome C.V. Epidemiology of Human Listeriosis. Clin Microbiol Rev 1991; 4:169-83.

Seeliger H.P. Listeria and Law in "Listeria 1992, ISOPOZ XI". Copenhagen 1992; 1-6.

Timonin M. I., Can. J. Research, 13, 32 (1935).

Waksman S. A., Microbial antegonisns and antibiotic substances (New York), 1945

Waksman S. A., Woogruff H. B., Soil Sci., 50, 421 (1940).

Приложения

Приложение А

Диаметр роста колоний (мм) листерий под влиянием летучих метаболитов сапрофитных бактерий, выделенных из почвы в районе б. Лазурная

L.m штаммы	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	3	4	3	3	5	5	6	7	8	7
2	3	5	6	5	5	3	8	6	7	6
3	3	3	5	6	7	3	6	4	8	8
4	6	7	7	5	6	7	8	7	7	8
5	6	6	5	6	6	8	8	6	8	9
6	6	7	6	5	8	7	6	7	9	8
7	15	9	15		14	8	13	11	12	12
8	6	3	7	6	7	5	8	9	8	9
9	3	6	7	5	5	6	7	6	8	6
10	3	6	7	3	6	10	5	6	8	8
11	9	8	5	8	8	7	9	10	9	8
12	8	5	6	6	6	6	7	7	10	9
13	9	7	8	7	7	7	10	9	8	7
14	3	3	5	5	5	8	8	4	7	4
15	4	5	5	5	6	6	7	7	7	5
16	8	8	9	9	8	7	10	6	1	7
17	5	8	5	5	5	4	8	7	8	7
18	5	7	4	8	7	8	7	6	7	6
19	4	5	5	6	6	6	7	5	6	5
20	7	8	6	9	6	6	10	6	9	6
21	6	8	6	8	7	7	8	5	7	8
22	6	6	4	3	5	6	7	4	9	6
24	3	7	3	5	3	5	6	5	6	4
25	8	6	8	7	9	8	9	8	8	7
26	6	8	7	8	8	6	11	7	5	6
27	6	6	6	6	4	8	9	3	8	6
28	7	8	8	8	8	8	8	7	8	7
29	6	7	8	8	7	9	8	6	7	6
30	7	8	8	8	7	8	10	8	10	8
31	7	9	6	8	8	9	9	9	9	10
33	6	5	7	7	6	6	8	6	7	6
36	6	8	7	6	8	6	7	7	8	7
К	4	3	3	2	3	4	6	3	4	3

Примечание: по горизонтали – штаммы листерий; по вертикали – штаммы сапрофитных почвенных бактерий.

Приложение Б

Оценка влияния метаболитов сапрофитных бактерий на рост Listeriamonocytogenes

Lm. сапр..	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	-	+	0	+	+	+	0	+	+	+
2	-	+	+	+	+	-	+	+	+	+
3	-	0	+	+	+	-	0	+	+	+
4	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
5	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
6	+	+	+	+	+	+	0	+	+	+
7	+	+	+		+	+	+	+	+	+
8	+	0	+	+	+	+	+	+	+	+
9	-	+	+	+	+	+	0	+	+	+
10	-	+	+	+	+	+	0	+	+	+
11	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
12	+	+	+	+	+	+	0	+	+	+
13	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
14	-	0	+	+	+	+	+	+	+	+
15	0	+	+	+	+	+	0	+	+	+
16	+	+	+	+	+	+	+	+	-	+
17	+	+	+	+	+	0	+	+	+	+
18	+	+	+	+	+	+	0	+	+	+
19	-	+	+	+	+	+	0	+	+	+
20	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
21	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
22	+	+	+	+	+	+	0	+	+	+
24	-	+	0	+	0	+	0	+	+	+
25	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
26	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
27	+	+	+	+	+	+	+	0	+	+
28	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
29	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
30	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
31	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
33	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
36	+	+	+	+	+	+	0	+	+	+

Примечание: «0» - действие отсутствует, «+» - действие положительное, «-» - действие отрицательное.

 

 

 

Код для цитирования: Скопировать