VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

В последние годы практикующих ветеринарных врачей волнует проблема стафилококковых заболеваний, рост которых не уменьшается до настоящего времени. Работами многочисленных исследователей вскрыты их патогенетические закономерности развития и течения. В ветеринарной практике эта проблема остается малоизученной, но не теряет своей актуальности.

Изучение литературы показало, что увеличение числа стафилококковых заболеваний большинством исследователей связывается с появлением антибиотикоустойчивых штаммов стафилококка, развитием дисбактериоза и в связи с этимснижением антагонистического действия нормальной микрофлоры, нарушением защитных механизмов организма.

Картина клинических проявлений стафилококковых заболеваний многообразна, в связи с этим возникают трудности диагностики. Стафилококкоз может протекать в виде очаговых поражений (фурункулез, пневмония, маститы, холециститы и др.) либо в виде общей гноеродной инфекции, т.е. сепсиса. Установлено наличие бактериемии при маститах, фурункулезе, хирургических заболеваниях. Стафилококковая бактериемия выявляется и при инфекционных заболеваниях.

Стафилококковые инфекции достаточно широко распространены у различных животных. Резервуаром возбудителя стафилококковой инфекции являются грызуны, птицы, крупный и мелкий рогатый скот, собаки, кошки. Заболевание проявляется у всех возрастных групп животных. Первичная стафилококковая пневмония встречается обычно у молодняка, реже у взрослых собак и кошек. Поверхностная стафилококковая инфекция чаще в виде пиодермии встречается у котят и щенков, тогда как абсцедирование происходит в основном у взрослых животных. Выделение возбудителя происходит с носовыми истечениями, фекальными массами, мочой, истечениями из половых органов (препуция и влагалища), гнойными выделениями из кожных поражений (язвы, свищи).

Однако появление стафилококковой бактериемии у собак и кошек при различных патологических состояниях, ее роль как условно-патогенной флоры и участие в дальнейшем течении основного заболевания достаточно мало изучены. В одних случаях сочетаемого течения болезни стафилококк обнаруживается как случайная находка и не вызывает видимых отклонений от основного заболевания, в других - отягощает ход болезни. Это обстоятельство послужило поводом для детального изучения роли условно патогенных стафилококков при различных заболеваний кожи и желудочно-кишечного тракта у мелких домашних непродуктивных животных. Кроме того, существует достаточно высокая вероятность передачи возбудителя стафилококковой инфекцией от животных к человеку, в связи с этим проблема своевременной, эффективной и доступной диагностики также является актуальной задачей для современной медицинской и ветеринарной микробиологии.

Цель настоящего исследования:

1. оценить частоту встречаемости заболеваний, вызванных стафилококками, у домашних животных (собак и кошек), проходивших лечение в ветеринарных клиниках г. Владивостока на основании анализа данных бактериологического обследования;

2. определить чувствительность выделенных культур стафилококков к антибиотикам;

3. выяснить влияние метаболитов симбионтной микрофлоры на рост клеток Staphilococcussp.

Литературный обзор

1. Характеристика бактерий рода Staphylococcus.

В 1947 году Foggie (Foggie,1947) опубликовал доклад о выделении штаммов коагулазо-положительных стафилококков от стада ягнят в Шотландии. Он показал, что стафилококки были изолированы из рта, носа, и влагалища животных. Gustafson и Svehag в 1956 году выделили 259 коагулазо-положительных организмов из группы в 292 собак, страдающих отитом (Gustafson, 1956). Выделенные штаммы проявляли устойчивость к пенициллину, стрептомицину и террамицину. Также в 1956 году Rountree, Freeman и Johnston опубликовали сообщение о выделении Staphylococcus из носовой полости домашних и лабораторных животных. Они обнаружили, что 11,5 процентов обследованных собак являются носителями коагулазо-положительных штаммов, и что среди типичных культур были найдены так называемые человеческие типы. В 1959 году Манн (Mann, 1959) oбследовав 100 собак и 100 кошек, обнаружил, что 23 процентов собак и 7 процентов кошек являются носителями коагулазо - положительного штамма стафилококка, из них были выделены две культуры, чувствительные к человеческим фагам. Pagano и сотрудники (Pagano, 1960) сообщили, что им удалось изолировать стафилококк от 88% собак, наблюдавшихся в ветеринарной клинике Канзасского университета. Результаты исследования показали, что домашние животные могут рассматриваться в качестве еще одного источника потенциально патогенных и устойчивых к антибиотикам, коагулазо-положительных штаммов S. Аureus (Morrison, 1961).

По классификации Берги, стафилококк относится к 14-й группе, включающей три семейства. Род Staphilococcus входит в семейство Micrococcacea. Данный род включает три вида: S. aureus, S. epidermaticus, S. saprophyticus. Вместе с тем, сейчас уже известно ещё 10 видов стафилококка, которые пока не включены в официальную систематику. Это S. xylosus, S. haemolyticus, S. cohnii, S. warneri, S. cupitis, S. scinri, S. simulans, S. hominis, S. hyicus, S. intermedium (Berg, 1984).

Стафилококки, представляющие собой грамположительные неподвижные аэробные или факультативно анаэробные кокки, относящиеся к семейству микрококков, крупные клетки, располагаются в мазках в виде гроздьев или бесформенных скоплений. Их название обусловлено типичным скоплением микроорганизмов в окрашенном препарате, приготовленном из колоний, выросших на твердой питательной среде (рис. 1).

А Б

Рисунок 1 - Рост колоний на питательной среде: Staphylococcus epidermidis (А), Staphylococcus aureus(Б).

Шарообразная клетка микроорганизма имеет трехслойную клеточную стенку с мощным пептидогликановым слоем, который пронизан фибриллоподобными (нитеобразными) структурами тейхоевых кислот. Ранее считалось, что стафилококки не образуют капсулы. Сейчас у вирулентных штаммов стафилококков наличие таких структур установлено (Смирнов, 1988).

Считается, что болезнетворные (патогенные) штаммы стафилококков отличаются от непатогенных большим количеством продуцируемых ферментов и токсинов. Патогенные стафилококки способны к анаэробной ферментации глюкозы и чувствительны к лизостафинэндопептидазе. Все штаммы стафилококков, продуцирующие коагулазу, называют золотистыми. В отличие от коагулазоотрицательных стафилококков, золотистый стафилококк ферментирует маннитол, продуцирует диазу и проявляет высокую чувствительность к лизостафину. Штаммы золотистого стафилококка обычно проявляют более высокую биохимическую активность, чем коагулазоотрицательные стафилококки. Различия штаммов золотистого и эпидермального стафилококков имеют значение при идентификации общего источника во время эпизоотии при вспышках стафилококковой инфекции. Штаммы золотистого стафилококка могут быть идентифицированы по чувствительности к антибиотикам, лизису под воздействием стафилококкового бактериофага (фаготипирование) и выявлению плазмид внутри микроорганизма. Из этих методов наименее точен метод определения чувствительности к антибиотикам, а наиболее точен метод выявления плазмид.

Большинство штаммов стафилококков лизогенны, т.е. являются хозяевами многочисленных бактериофагов с различным спектром литического действия. Основные биохимические свойства S. aureus состоят в том, что они продуцируют каталазу, в аэробных условиях ферментируют глюкозу и другие углеводы до кислот и газа. Крахмал не утилизируют. Большинство штаммов выделяет ацетон. При выращивании в бульоне с аргинином образуют аммиак, восстанавливают нитраты до нитритов или свободного азота. Индол на среде с триптофаном не образуют. Расщепляют некоторые белки и жиры. Стафилококки — факультативные анаэробы (ассимилируют кислород или используют брожение, преимущественно выделяя молочную кислоту). Поскольку стафилококки продуцируют каталазу, то образующаяся как метаболит в аэробных условиях перекись водорода для них не токсична. Поэтому они большей частью хорошо растут в присутствии кислорода, но легко переносят и отсутствие кислорода, а некоторые штаммы даже являются строгими анаэробами. Температурный оптимум 25-35°С, оптимум рН 7,0-7,5. Стафилококки хорошо переносят повышенное осмотическое давление, поэтому селективной питательной средой для них может быть среда с высоким содержанием хлорида натрия (до 15%).

1.  

   1. Эпизоотия.

Коагулазоотрицательные стафилококки — это часть обычной флоры кожных покровов, слизистых оболочек и нижнего отдела кишечника; их чаще всего обнаруживают в передних отделах носовых ходов у 70—90% животных. Они могут выделяться в течение продолжительного периода. Носительство в носовых ходах часто сопровождается вторичной колонизацией кожи. Полагают, что нарушение целостности кожных барьеров способствует колонизации золотистого стафилококка (Старченков, 2006).

Несмотря на то, что стафилококки могут выживать в окружающей среде в течение продолжительного периода, а некоторые штаммы распространяются воздушно-капельным путем, передача от одного животного к другому через контакт служит наиболее важным путем передачи инфекции. Пациенты с острой стафилококковой инфекцией или с интенсивной колонизацией, особенно на коже (хирургические раны, ожоги, язвы от пролежней, царапины, укусы, расчесы), представляют собой важнейший источник для возникновения инфекций. Нарушения правил асептики и антисептики способствуют передаче микроорганизмов от одного животного другому. Как золотистый, так и эпидермальный стафилококк может стать причиной эндемичной инфекции с обширными поражениями кожи, особенно при множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов в результате интенсивного лечения противобактериальными препаратами. При тщательном обследовании обнаруживают, что в период усиленной передачи стафилококков у большей части носителей кожная инфекция активизируется. Стафилококки чаще выделяются в качестве возбудителей как первичной, так и вторичной бактериемии, а также при кожных и хирургических раневых инфекциях.

Известно, что люди, зараженные золотистым стафилококком, резистентным к метициллину, могут передавать инфекцию своим собакам, кошкам или другим домашним любимцам при обычном дневном контакте, что ведет к реинфекции человека, несмотря на соответствующую терапию. Аналогично, работники здравоохранения, инфицированные по роду занятий золотистым стафилококком, могут передавать его далее через животных до тех пор, пока все носители не будут выявлены и вылечены (Чухловин, 2008)

Одной из важнейших особенностей стафилококковой инфекции является тот факт, что имеется выраженная индивидуальная чувствительность или устойчивость к возбудителю заболевания. Для того чтобы животное заразилось, оно должно либо обладать слабой сопротивляемостью к действию патогенного стафилококка либо доза заражения должна быть массивной. В зависимости от происхождения, предрасполагающие к этому заболеванию факторы можно разделить на несколько групп:

1. нарушение углеводного обмена, а именно, повышение уровня углеводов (глюкозы, сахарозы) в крови и тканях (коже). Заболевание имеет выраженный характер при сахарном диабете и при неправильном кормлении;

2. иммунодефициты врожденные и приобретенные (особенно при нарушениях киллерной функции фагоцитов и синтеза секреторного IgA);

3. нарушение гормонального уровня - снижение количества гормонов щитовидной железы (гипотиреоидизм) или увеличение количества кортикостероидных гормонов;

4. нарушение витаминного (особенно при недостатке витаминов А, Е и витаминов группы В) и минерального обменов;

5. общие токсикозы - хронические отравления токсическими веществами, а также нарушение функций печени и почек;

6. систематические травматические и воспалительные повреждения кожи, аллергии немедленного и замедленного типов, а также патологические процессы, индуцированные демодекозом, блохами, чесоточным клещом, язвы и эрозии;

7. индивидуальный Ir-генный контроль - т.е. генетически обусловленная неспособность иммунной системы данного индивидуума адекватно отвечать на стафилококковые токсины. В случае слабой реактивности сопротивление размножению стафилококка в организме подавлено.

Стафилококковые инфекции обычно развиваются в результате сочетания таких факторов, как вирулентность бактерий и снижение защитных сил организма. К важным факторам вирулентности стафилококков относятся их способность к выживанию при неблагоприятных условиях, компоненты клеточной стенки, продукция ферментов и токсинов, содействующих проникновению в ткани, способности к внутриклеточной персистенции в определенных фагоцитах и приобретению резистентности к противобактериальным препаратам. К важным защитным функциям организма животного относят целостность слизисто-кожного барьера, достаточное количество функционально активных нейтрофилов и удаление чужеродных тел или омертвевших тканей. При нарушении целостности наружных покровов и слизистых оболочек местное размножение бактерий сопровождается воспалительной реакцией и некрозом тканей. В этом очаге быстро появляются нейтрофилы, захватывающие большое число стафилококков. Происходит тромбоз прилегающих капилляров, по периферии откладывается фибрин, затем фибробласты образуют бессосудистую стенку вокруг этой зоны. Когда защитные механизмы животного не в состоянии ограничить инфекцию в пределах кожи или подслизистого слоя, стафилококки могут проникать в лимфатическую систему и кровоток. Обычными участками обсеменения бывают диафизы длинных костей, а также легкие, почки, клапаны сердца, миокард, печень, селезенка и головной мозг. Многоядерные лейкоциты, обладающие способностью к нормальному хемотаксису, захватыванию и уничтожению микроорганизмов, и составляют важнейший элемент защитных механизмов организма животного против стафилококковых инфекций. Несмотря на то, что эти инфекции встречаются у животных любого возраста и породы, они тяжело протекают, прежде всего, у молодняка и старых животных, особенно у страдающих хроническими заболеваниями.

1.  

   1. Чувствительность к антибиотикам и изменчивость бактерий стафилококка.

Таблица1 - Основные гены S.aureus, контролирующие вирулентность и антибиотикорезистснтность

Гены вирулентности
Hia	Контролируются взаимосвязанной структурой генных регуляторов, ответственных за адаптацию и выработку различных факторов вирулентности	Кодирует выработку гемолизина
fnbA, fnbB		Кодирует фибронектин-связывающий белок и белок А
Cap		Кодирует выработку капсульных полисахаридов, биопленки
arfRS		Контролируют выработку биопленки
Agr
Sae		Активирует выработку сериновой протеазы, нуклеазы
Coa		Контролирует продукцию коагулазы
clfA		Контролирует clumping-фактор A ClfA
clfB		Контролирует clumping-фактор В ClfB
Spa		Кодирует белок А
Гены антибиотикорезистентности
mecA	Кодирует метициллин-связывающий белок
msrA1	Контролирует обмен белков антибиотикорезистентности
pls	Кодирует поверхностный фактор метициллинрезистентности
ccr	Контролирует устойчивость к нелактамным антибиотикам

С момента открытия пенициллина в 1944 г. и его широкого использование в клинической практике, большинство штаммов S. aureus выработали устойчивость к пенициллинам. После этого стали активно использовать метициллин – является химически модифицированным пенициллином, который не разрушается под действием пенициллиназы. Последнее время отмечается устойчивость и к метилпенициллину, в связи с чем стали разделять S. aureus на метициллин-чувствительные (MSSA - methicillin-sensitive S. aureus) и метициллин-резистентные штаммы (MRSA - Methicillin Resistant Staphylococcus aureus). Недавно среди S. aureus стали выделять ванкомицин-резистентный (VRSA) и гликопептид-резистентный (GISA). Такое разделение имеет важное значение и в прогностическом плане – у пациентов, инфицированных метициллин-устойчивыми штамми S. aureus смертность достигает 30 %. Раньше MRSA-штаммы выделялись только как внутрибольничная инфекция, теперь же эти штаммы получили широкое распространение. Чаще MRSA-штаммы вызывают поражение кожи и мягких тканей, реже – пневмонию. Приобретенная устойчивость бактерий S. aureus к антибиотикам, контролируется плазмидами (таблица 1).

Поскольку препаратами выбора для лечения стафилококковых инфекций (вызванных как золотистым, так и коагулазонегативными стафилококками) являются бета-лактамные антибиотики, то в первую очередь необходимо исследовать чувствительность к этим препаратам. Устойчивость стафилококков к бета-лактамным антибиотикам связана либо с продукцией ферментов бета-лактамаз, либо с наличием дополнительного пенициллиносвязывающего белка ПСБ2а.

Широкое применение препаратов широкого спектра действия в медицинской и ветеринарной практике создало проблему контроля инфекций, вызванных резистентной флорой, поскольку антибиотикиоказывают давление на возбудителей инфекций и способствуют селекции резистентной флоры. Факторами риска инфекции, вызванной резистентными стафилококками, являются длительное применение антибиотиков широкого спектра, применение повторных курсов антибактериальной терапии, раневая инфекция, катетеризация центральных вен, катетеризация мочевого пузыря. Данные состояния с трудом поддаются лечению с помощью антибиотиков. Ключевой их особенностью является то, что после успешного проведения лечебных мероприятий, направленных на борьбу с инфекцией, по истечению некоторого времени (нескольких месяцев, лет) могут происходить рецидивы данных заболеваний.

Доктор Леффлер (Löffler) и группа возглавляемая ею учёных из института медицинской микробиологии, расположенного в Мюнстере (Германия), склонны считать, что указанные выше рецидивы – это результат «фенотипического манёвра» — изменения поведения бактерий (Tuchscherr, 2011). После заражения организма бактерии объединяются в мутантные колонии, преодолевая, таким образом, влияние иммунной системы и различных антибиотиков. В таком состоянии инфекция продолжает медленно размножаться. «Микробиологам очень сложно отследить появление небольших мутантных колоний бактериальной природы при проведении клинических исследований. Это связано с низкой скоростью роста данных колоний: на образование одной колонии требуется несколько дней. Поэтому часто при диагностике присутствие инфекции в организме остаётся неустановленным. Проведённые нами исследования дали ответ на два вопроса: является ли развитие мутантных колоний бактерий неотъемлемой частью инфекции организма, и какова динамика формирования данных колоний» — говорит доктор Löffler. В ходе проведения лабораторных исследований было установлено, что бактерии могли находиться в спокойном состоянии в организме хозяина на протяжении нескольких недель с момента инфекции. Это приводило к образованию указанных выше колоний. Таким образом, формирование мутантных колоний происходило после попадания инфекции в организм, после надлежащих действий со стороны иммунной системы. Персистенция инфекционных агентов в организме хозяина приводила к появлению фенотипического разнообразия данных агентов. «Результаты проведённых исследований говорят о том, что бактерии S. aureus – это крайне изменчивые микроорганизмы, которые постоянно воспринимают условия окружающей среды и могут быстро подстроиться под их изменение. Формирование мутантных колоний – это «фенотипический манёвр», являющийся неотъемлемой частью инфекционного процесса» — говорит Löffler. Такое поведение бактерий позволяет им избегать активности иммунной системы хозяина и воздействия антибиотиков. По-видимому, под влиянием антибиотиков вирулентность стафилококков может даже значительно усиливаться. По мнению некоторых авторов лечение антибиотиками ускоряет развитие резистентности к ним у штаммов S. аureus и приводит к так называемой «микробной селекции». Антибиотики разрушают чувствительные штаммы и дают возможность штаммам вирулентным усиливать свою вирулентность, стимулируя отбор наиболее патогенных микроорганизмов. С другой стороны, все больше и больше увеличивается количество здоровых носителей стафилококка, что способствует более широкому распространению патогенных штаммов, циркулирующих в окружающей среде и вызывающих вспышки инфекционных заболеваний.

Для стафилококков характерна высокая изменчивость, связанная с плазмидами устойчивости к различным антибиотикам (прежде всего — к пенициллинам). В результате происходящих мутаций у больных стафилококковыми инфекциями наряду с типичными микроорганизмами обнаруживают атипичные клетки. Существует мнение, что они возникают в результате применения антибиотиков, ингибирующих синтез клеточной стенки. При трансформации стафилококков в L-формы тормозится функция их размножения при сохранности роста. Наряду с этим блокируется синтез клеточных стенок, образуются большие шарообразные клетки. При пересеве материала они принимают исходную форму. Клетки в состоянии L-формы (форма выживания) обладают пониженной вирулентностью и могут длительное время не вызывать воспаления, что создает обманчивое впечатление выздоровления. В последнее время появились сообщения о том, что высеваемость стафилококков из различных патологических очагов у больных резко снизилась в связи с применением антибиотиков в неадекватных дозах, которые не убивают стафилококки, а способствуют их трансформации в L-формы. Такие формы изменчивости утрачивают многие типичные свойства, но сохраняют главный признак — способность вызывать заболевания. Считают, что формирование бациллоносительства и хронически текущих форм пиодермии, появление атипичных форм заболеваний и вариантов бактерий с высокой лекарственной устойчивостью обусловлены трансформацией стафилококков в L-формы. Существует мнение, что белый стафилококк, не коагулирующий плазму, не типирующийся фагами, часто выделяемый в последнее время при различных гнойных процессах (особенно при осложнениях после хирургических вмешательств), а также из крови септических больных, есть тоже одна из форм изменчивости патогенных стафилококков (Скрипкин, 1995).

Для процесса изменчивости большое значение имеет явление, получившее наименование «признака состояния» микробной культуры. Ранее было установлено, что некоторые виды микробов, в том числе бактерии рода Staphilococcus, являются носителями антигенов, родственных белкам человека, т. е. имеют «антигенную метку» организма, в котором вызывают патологический процесс (Косенко,1973). Полагают, что антитела, вырабатывающиеся организмом против микроба, снабженного «антигенной меткой», могут связываться собственными тканями больного (Петров, 1976). Во всяком случае не вызывает сомнения тот факт, что иммунокомпетентная система вследствие свойственной ей толерантности к собственным антигенам не может дать выраженного иммунного ответа на микроб, несущий «антигенную метку» человека. Этими же авторами было показано, что микробы с «признаком состояния» чаше вызывают более тяжелые воспалительные и гнойные заболевания, а продуцирующие коагулазу стафилококки, высеянные из мокроты больных, находящихся в фазе обострения хронической пневмонии, имеют «антигенную метку» человека в 80% случаев (Сильвестров,1982).

1. Механизм развития и клинические проявления стафилококковой инфекции.

Динамика патогенетического процесса, вызываемого стафилококками, изучена недостаточно. Предполагается, что на первоначальном этапе патогенеза вирулентные штаммы стафилококка после проникновения в организм прикрепляются к клеткам-мишеням (преимущественно эпителия и дермы) с помощью факторов адгезии. Как правило, способность к адгезии (прикреплению) у стафилококков коррелирует с их вирулентностью. Установлено, что за функцию адгезии к клеткам эпителия отвечают некоторые поверхностные структуры бактериальной клетки, устойчивые к действия температуры и ферментов. Из клеток стафилококка было выделено вещество гликопротеидной природы с большим содержанием аминокислот (аспарагина, серина и глицина), и аминосахаров (глюкозамина и галактозамина). Это вещество оказалось ответственным за связывание фибриногена и фибрина. Данные свойства, объясняют феномен коагуляции плазмы коагулазо-позитивными штаммами и напрямую коррелируют с процессами адгезии к клеткам эпителия.

Имеются сообщения и о связывании рецепторов стафилококка с ламинином - белком базальной мембраны сосудистой стенки. Предполагают, что описанный рецептор способствует проникновению стафилококков через стенку кровеносных сосудов. Имеются также данные о способности некоторых рецепторов связывать коллаген, что прямо коррелирует с их патологической функцией при дерматитах. Эти коллагеновые рецепторы стафилококков термоустойчивы и устойчивы к действию многих химических реагентов. Различают два класса подобных рецепторов и насчитывают их до 130-150 штук на одну клетку стафилококка. (Смирнов, 1988). Существует мнение, что процессу адсорбции стафилококка способствует накопление легко усвояемых углеводов (глюкозы, сахарозы) в тканях. При подавлении процессов гликолиза, показано явное снижение интенсивности стафилококкового воспалительного процесса. Прикрепившиеся (адсорбированные) микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности начинают продуцировать целый комплекс экзо- и энтеротоксинов. Именно токсины обусловливают клинические проявления болезни. В настоящее время установлено более 30 различных метаболитов, продуцируемых стафилококком, обладающих свойствами токсинов и нарушающих нормальные физиологические реакции в организме хозяина (таблица 2).

Подробно изучен рад экзотоксинов - гемолизинов, лизирующих эритроциты, и ряд токсинов, лизирующих лейкоциты. Лизирующие токсины обладают довольно широким спектром действия, и их предлагают вообще называть цитолизинами. Лизирующее действие многих из них основано на способности разрушать молекулы, формирующие клеточную мембрану. Например, В-гемолизин вызывает расщепление сфингомиелина, в результате чего происходит лизис клетки. Лизирующий эффект зависит от присутствия ионов некоторых металлов (Mg++, например). При увеличении в среде ионов Са++ эффект лизиса отменяется, так как кальций связывается со сфингомиелином и стабилизирует мембраны.

У стафилококков выявлено несколько типов эксфолиативного токсина, который не лизирует клетки, но тем не менее вызывает в них специфические нарушения. Цитолизины и эксфолиативные токсины играют важную роль в развитии воспалительных реакций при стафилококкозе у собак. Они же могут участвовать в инициации процессов образования гнойных масс путем усиленного лизиса лейкоцитов в зоне воспаления. К настоящему времени идентифицировано и шесть стафилококковых энтеротоксинов (А; В; С; D; E; F), вызывающих преимущественно реакции типа пищевых отравлений (диарея, рвота), которые имеют проявления в основном у подсосных щенков в первые дни жизни, и значительно реже у взрослых животных. Энтеротоксины стафилококков представляют собой белковые молекулы, токсичность которых, как предполагают, определяет дисульфидная петля, находящаяся в центре молекулы токсина и образованная между двумя остатками цистеина, эти белки сходны по структуре и имеют незначительные вариации по молекулярной массе (26-34 кД) (Езепчук, 1985).

Таблица 2 - Основные поверхностные антигены S. аureus

Структура	Функция
Пептидогликан (муреин, мукопептид, гликопептид)	Эндотоксинподобная активность: пирогенность, обеспечение неспецифической резистентности, активация комплемента. Сенсибилизирующий эффект.
Капсула	Антифагоцитарное действие, стимуляция появления в сыворотке крови опсониное и протективных антител
Тейхоевые кислоты	Сильный тимус-независимый антиген, активация комплемента, обладают видовой антигенной специфичностью
Белок А	Свойства преципитиногена, агтлютиногенв благодаря неспецифическому взаимодействию с Fc-фрагментом сывороточных иммуноглобулинов и связывание комплемента

Точный молекулярный механизм действия токсинов не установлен до настоящего времени, но у них обнаружена мощная NAD-гликогидролазная активность - т. е. способность осуществлять ферментативный гидролиз NAD до никотинамида (NA+) и АДФ-рибозы. В результате может подавляться активность АТФ-связывающих белков, они перестают участвовать в регуляции аденилатциклазной системы. Эта патология влечет за собой изменения внутриклеточного соотношения циклических нуклеотидов цАМФ/цГМФ (циклического аденозинмонофосфата/циклического гуанозинмонофосфата). Нарушение содержания этих клеточных регуляторов в клетках кишечного эпителия приводит к изменению функций K-Na насоса энтероцитов. Водные массы в этом случае не всасываются, а наоборот, секретируются из организма в просвет кишечника, что, в свою очередь, приводит к диарее и обезвоживанию.

Таким образом, в результате жизнедеятельности прикрепившихся к клеткам хозяина стафилококков вырабатывается целый ряд токсинов, которые лизируют клетки хозяина или нарушают их нормальную структуру. В итоге развиваются воспалительные реакции, приводящие к появлению клинических симптомов дерматитов, отитов, вагинитов, пищевых отравлений (рвота, диарея) и т.д.

2.1Клинические проявления инфекции

Одним из основных клинических симптомов стафилококкоза являются дерматиты, называемые обычно пиодермиями. Особенно подвержены этому заболеванию собаки, поскольку у них, по сравнению с другими млекопитающими, снижены функции кожных барьеров, вследствие чего они особенно восприимчивы к воздействию различных патогенов. Пиодермию можно классифицировать в соответствии с клинической картиной по признаку глубины поражения дермы - различают поверхностную, неглубокую и глубокую пиодерму. Вид S. intermedius является самым часто изолируемым от собак стафилококком, особенно от животных, имеющих кожные заболевания.

Для поверхностной пиодермы характерны поражения верхних слоев эпидермальной ткани и, как следствие, неглубокие эрозии, напластованиягрануляции, экссудативные процессы и периодический зуд. Пораженные области часто болезненны. Различают две разновидности этой пиодермии. Одну из них - острый мокнущий дерматит - иногда называют влажной экземой или летней экземой, так как её проявлению способствует жаркая и влажная погода. Быстроразвивающиеся поражения кожи могут охватывать область паха, подгрудка, шею и хвост. Предрасполагающими факторами для этой формы могут служить аллергия (особенно к блохам), ожирение, а также плохая кожная вентиляция. Последнее особенно характерно для длинношерстных пород, а также в случае плохого ухода за шерстью. Нередко к подобному дерматиту приводят и небольшие травмы кожи. Развитие другой разновидности, называемой в иностранной литературе "intertrigo", связано с определенными анатомическими особенностями у некоторых пород собак. Наличие складок кожи затрудняет вентиляцию этих участков, способствует скапливанию слюны в углах губ или мочи в области паха и т.д. Все это облегчает стафилококковую колонизацию эпителиальных клеток и развитие воспалительного процесса. При отсутствии лечения или неадекватном ответе иммунной системы воспалительный процесс может расширяться и захватывать более глубокие слои дермы (рисунок 3). При неглубокой пиодерме в патологический процесс вовлекаются все слои эпидермиса, а также поверхностные структуры волосяных фолликулов. Обычно эта форма ассоциируется с возникновением пустул. Различают также два варианта этой пиодермии: импетиго, или пустулезный дерматит раннего возраста, и поверхностный фолликулит. Первый вариант характеризуется появлением пустулезных высыпаний в паховой или подмышечной областях у животных, не достигших половой зрелости. Этот дерматит может быть обнаружен даже случайно при уходе за собакой. Часто он сопровождается зудом. Считают, что предрасполагающими факторами к этому варианту болезни могут служить гормональные и иммунные нарушения, эндо- и эктопаразиты, неправильное кормление и неумелый уход.При неглубокой пиодерме в патологический процесс вовлекаются все слои эпидермиса, а также поверхностные структуры волосяных фолликулов. Обычно эта форма ассоциируется с возникновением пустул. Различают также два варианта этой пиодермии: импетиго, или пустулезный дерматит раннего возраста, и поверхностный фолликулит. Первый вариант характеризуется появлением пустулезных высыпаний в паховой или подмышечной областях у животных, не достигших половой зрелости. Этот дерматит может быть обнаружен даже случайно при уходе за собакой. Часто он сопровождается зудом. Считают, что предрасполагающими факторами к этому варианту болезни могут служить гормональные и иммунные нарушения, эндо- и эктопаразиты, неправильное кормление и неумелый уход (Старченков, 2006).

А Б

Рисунок 2 – Поражение кожи при пиодерме у кошек (А) и собак (Б)

При втором варианте (поверхностном фолликулите) в воспалительный процесс вовлекаются поверхностные структуры волосяного фолликула. Это приводит к выпадению волос и облысению участков кожи. Возникает сильный зуд, который сопровождается расчесами и травмами. Иногда образуются аллопеции, эритемы и довольно часто гиперпигментация (рис.2). Чаще всего поражается нижняя часть живота, подмышечная и паховая области. Предрасполагающими факторами здесь могут быть гиперчувствительность к эктопаразитам, анатомические и иммунологические факторы, а также нарушение эндокринных процессов - гипотиреоидизм и гиперпродукция кортикостероидных гормонов.

Глубокая пиодермия характеризуется вовлечением в воспалительный процесс не только волосяных фолликулов и эпидермального слоя, но и собственно дермы и подкожной клетчатки. Фолликулярные стенки обычно разрушаются и могут образовываться фурункулезные очаги. Наиболее вероятной причиной возникновения такой пиодермии является демодекоз (подкожный клещ), течение которого почти всегда осложняет стафилококковая инфекция. Из других предрасполагающих факторов необходимо отметить недостаток выработки тиреоидного гормона или повышенный уровень адренокортикотропного гормона, а также выраженный иммунодефицит. Длительное применение кортикостероидов тоже может служить причиной данного заболевания.

Глубокая пиодермия бывает как локализованной, так и генерализованной. Генерализованная форма глубокой пиодермии самое тяжело протекающее заболевание кожи, сопровождающееся фурункулезом, изъязвлением, увеличением регионарных лимфоузлов, и обильным экссудативным процессом. При сильно выраженном течении возможен также подъем температуры тела. Анализ крови в этот период часто свидетельствует о нейтрофилии и лимфопении. Отмечается снижение альбуминов и повышение уровня гаммаглобулинов. Из локально протекающих глубоких пиодермии наиболее часто встречаются лицевой и подбородочный фолликулит и фурункулез, межпальцевый фолликулит, анальный фурункулез и назальная пиодермия, поражающая спинку носа у собак.

Демодекоз — заболевание, которое вызывается паразитированиемклещей Demodexcanis в волосяных фолликулах и сальных железах кожи, а также во внутренних органах собак. Характеризуется дерматитом, гиперкератозом, прогрессирующим истощением и хроническим течением. Локальная и общая формы заболевания могут переходить одна в другую. При неосложненной микробной суперинфекцией форме, воспалительный дерматоз не сопровождается зудом. Генерализованная форма демодекоза является следствием развития локальной, осложненной стафилококковой инфекцией. Поверхностный дерматит или бактериальный фолликулит характеризуется присутствием многочисленных выступающих беловатых гнойничков. Глубокая пиодермия характеризуется вовлечением в воспалительный процесс не только волосяных фолликулов и эпидермального слоя, но и дермы и подкожной клетчатки. Фолликулярные стенки разрушаются и образуются фурункулезные очаги. В процесс вовлекаются волосяныемешочки, в которых скапливается белая смесь кожного сала и гноя, изобилующая клещам (Авдиенко, 2007).

Другим очень важным клиническим признаком стафилококкоза является поражение слизистых оболочек половых органов. У сук отмечают развитие вагинитов, сопровождаемых гнойными (реже катаральными) выделениями. При отсутствии лечения может быть поражена и матка (эндометриты и пиометра). У кобелей развиваются поститы, сопровождающиеся гнойными выделениями из препуция. При хроническом течении могут активироваться пролиферативные процессы, приводящие к патологическому разрастанию эпителиальных тканей препуция. При микроскопии в экссудате обнаруживают слущенные клетки эпителия, фагоциты, лимфоциты (и обломки этих клеток), а также в значительном количестве микробные клетки стафилококков.

Стафилококковый мастит обычно развивается у лактирующих сук. Болезнь быстро прогрессирует, сопровождаясь повышением общей и местной (в области пораженных долей вымени) температуры, снижением аппетита, угнетением, затрудненными движениями и залеживанием животного, увеличением размера пораженной доли вымени, которая становится отечной и болезненной. Кожа маститной доли вымени гиперемируется. В молоке появляется гной. Образуются абсцессы, размер которых варьирует в широких пределах. Поверхностные абсцессы обычно спонтанно вскрываются, оставляя в последующем после себя рубцы, а расположенные в глубине вымени могут формировать свищи, из которых наружу выделяется гной. Глубоко расположенные абсцессы прощупываются в виде горячих, болезненных и уплотненных очагов. В тяжелых случаях мастит может закончиться летальным исходом. При переходе в хроническую форму пораженная доля вымени участками или диффузно уплотняется.

Особенно тяжело протекает гангренозный мастит. Болезнь сопровождается лейкоцитозом (25000-48600 кл/мкл) и тромбоцитопенией (107000-179000 кл/мкл), причем в крови повышается относительное количество очень крупных тромбоцитов. Между изменениями тромбоцитов и тяжестью симптоматики имеется корреляция.

Еще одним из клинических проявлений стафилококковой инфекции является развитие отитов. Их также можно различать по интенсивности поражений. В одних случаях они протекают скрытно, вызывая лишь небольшое беспокойство животных, которое выражается в частом встряхивании головой и усиленном расчесывании больного уха. При его пальпации можно услышать хлюпающие звуки скопившегося экссудата. При более интенсивном поражении в воспалительный процесс вовлекаются ткани наружного уха и эпителия ушной раковины. Воспаление обычно сопровождается отечностью, покраснением и болезненностью.

В отдельных случаях течение болезни может проявляться в виде конъюнктивита или воспалительного процесса в некоторых железах. У щенков, в первые дни жизни болезнь протекает по типу пищевых отравлений. Заболевание начинается внезапно на 2-7-й день жизни. Отмечают диарею и быстрое обезвоживание, приводящее к летальному исходу. У взрослых животных хронические диареи стафилококкового происхождения встречаются редко.

Среди расстройств желудочно-кишечного тракта у мелких животных большое значение имеют диспепсии неинфекционного происхождения, возникающие на почве некачественных и количественных погрешностей в кормлении собак и кошек. При лечении таких расстройств антибиотиками резко изменяются ассоциации микрофлоры кишечника. На почве возникшего дисбактериоза, бурно развиваются устойчивые к антибиотикам условно-патогенные микробы, подавляемые антагонистическим действием кишечной палочки и молочнокислых бактерий. Среди микробов, вызывающих вторичную инфекцию при лечении расстройств желудочно-кишечного тракта антибиотиками, главная роль принадлежит стафилококку, штаммы которого характеризуются значительной устойчивостью к большинству антибиотиков. В этих случаях стафилококковая инфекция без лабораторного подтверждения часто ошибочно диагностируется как энтероколит или энтерит.

Отодектоз - одно из самых распространенных заболеваний собак и кошек. Стафилококки как условно-патогенная микрофлора организма отягощают течение отодектоза. Отодектоз или ушная чесотка одно из самых распространенных заболеваний собак и кошек причиняющее вред их здоровью. Больные животные беспокоятся, трясут головой, расчесывают уши, на внутренней поверхности ушей появляются царапины, нагноения, темные струпья, развивается воспаление. В начальной стадии заболевания собаки плохо едят, раздражительны. Со временем состояние их стабилизируется, что притупляет бдительность их владельцев, которые не спешат обратиться за помощью к ветеринарному врачу, хотя на этой стадии с заболеванием легче справиться. Чаще владельцы собак и кошек обращаются в ветеринарную клинику, когда заболевание приобретает осложненную форму, которая наносит большой вред питомцам, причиняет неприятности хозяевам и сложности специалистам, так как на этой стадии очень трудно бороться с этой патологией. В ряде случаев могут развиться осложнения в виде прободения барабанной перепонки, воспаления среднего уха, конвульсий и судорог. Некоторые животные на протяжении всей своей жизни мучаются от отодектоза, несмотря на оказываемое им лечение и, кроме того, являются постоянным источником заражения для других собак.

Поражения золотистым стафилококком костей и суставов обычно развиваются у щенков и старых собак, как следствие гематогенного распространения инфекции из первичных очагов. В отдельных случаях золотистый стафилококк проникает в опорный аппарат животного в результате травм. При остеомиелите у животного отмечают клинические признаки местной реакции (отек мягких тканей, болезненность, повышение температуры), а также системные нарушения (угнетение, снижение аппетита, лихорадку и хромоту). В последующем во многих случаях образуются свищи, из которых наружу выделяется гной. На рентгеновских снимках видны признаки периостальной реакции, кортикального лизиса, секвестрации костной ткани, формирования гнойных карманов и абсцедирования, очаги формирования новой костной ткани.

Острый эндокардит развивается как следствие гематогенного распространения инфекции из первичного очага. Заболевание сопровождается сердечной недостаточностью, ассоциированной с перфорацией сердечных клапанов, образованием абсцессов в миокарде, скоплением крови в перикарде и гнойным воспаления последнего. Тяжесть поражений может колебаться в широких пределах, час- то становясь несовместимой с жизнью животного.

У плотоядных, в частности собак, стафилококки обычно выступают как секундарная инфекция, осложняющая течение уже развившихся дерматитов, но стафилококкоз может быть и самостоятельным, генерализованным заболеванием, вовлекающим в патологический процесс не только кожу, но и другие органы. Генерализованная форма стафилококковой инфекции представляет собой особую форму болезни, со своеобразным симптомокомплексом, которая может развиться на фоне основного заболевания (таблица 3).

Таблица 3 - Генерализованная форма стафилококковых заболеваний*

№ п/п	Наименование болезней	Количество больных животных	Больных собак		Больных кошек
Очаговые стафилококковые болезни
1	Пневмонии	28	26		2
2	Гнойно-воспалительные заболевания кожи, подкожной клейчатки и костей	4	2		2
3	Воспалительные заболевания почек бактериальной этиологии	10	6		4
4	Воспалительные процессы мочеполовых органов	7	6		1
5	Отит	23	20		3
6	Энтероколит	6	4		2
7	Мастит	3	2		1
Заболевания нестафилококковой этиологии
1	Аденовирусная инфекция	5		5	0
2	Пищевая токсикоинфекция (сальмонеллез, ботулизм)	46		44	2
3	Отодектоз	25		10	15
4	Дерматомикозы	60		29	31
5	Дисбактериоз лекарственный	100		65	35
6	Чума	1		1	0
7	ПВ энтерит	3		3	0
8	Полиартрит	1		1	0
9	Нефрит острый	3		1	2
10	Болезнь ЖКТ	2		1	1
11	Глистная инвазия	23		15	8
	Итого	350

* По материалам: О.А. Костылева, 2008.

Клиническая картина генерализованной формы стафилококкоза характеризуется рядом характерных симптомов: у больных животных наблюдается подъем температуры на 0,5-1,5° от нормы. В большинстве случаев отмечаются симптомы интоксикации: слабость, отказ от корма, обезвоживание, ознобы, нарушение движения, тахикардия, коллапс. При тяжелом течении имеются гемморагические симптомы - сыпь в области живота и паха. Постоянными симптомами тяжелого течения стафилококкоза является увеличение печени и увеличение подчелюстных лимфоузлов.

Материалы и методы

1. Образцы

Таблица 4 - Образцы для исследования

Образец (№)	Вид/Пол	Заболевание	Хроническое/Не хроническое
1	Собака/Кобель	Нарыв после укуса в области шеи	Не хроническое
2	Собака/Кобель	Нарыв после укуса в паховой области	Не хроническое
3	Собака/Сука	Зуд около анального отверстия	Не хроническое
4	Собака/Сука	Вагинит	Хроническое
5	Собака/Кобель	Ушной зуд	Не хроническое
6	Кошка/Самка	Ушной зуд	Хроническое
7	Кошка/Самка	Инфекция мочевыводящих путей	Хроническое
8	Котёнок/Самка	Простуда	Не хроническое
9	Кошка/Самка	Коньюктивит	Не хроническое
10	Кот/Самец	Коньюктивит	Хроническое
11	Собака/Кобель	Простуда	Хроническое
12	Кошка/Самец	Инфекция мочевыводящих путей,цистит	Хроническое
13	Кошка/Самка	Простуда	Хроническое
14	Собака/Кобель	Коньюктивит	Не хроническое
15	Собака/Кобель	Инфекция мочевыводящих путей	Не хроническое
16	Собака/Кобель	Выделения из уретры	Не хроническое
17	Собака/Кобель	Простуда	Не хроническое
18	Собака/Кобель	Простуда	Не хроническое
19	Собака/Кобель	Постит	Хронический
20	Собака/Сука	Коньюктивит	Хронический
21	Кошка/Самка	Простуда	Хроническое
22	Кот/Самец	Отит	Хроническое
23	Кошка/Самка	Отедекоз	Хроническое
24	Кошка/Самка	Стаматит	Не хроническое
25	Кот/Самец	Простуда	Не хроническое

Взятые пробы регистрировались с помощью специально разработанных бланков.

Таблица 5 - Бланк пробы

№ образца
Вид	Собака-Кошка
Место отбора пробы
Возраст
Длительность	Хроническое – Не хроническое
Пол
Диагноз

Забор проб осуществлялся сотрудниками ветеринарной клиники «Томасина», при осмотре животного в пенициллиновые флаконы с заранее разлитым в них сахарным бульоном в количестве 5 мл,при помощи стерильных одноразовых урогенитальных зондов (рис. 3)

Рисунок 3. Инструменты, использованные для взятия образцов.

2 Питательные среды

Мясопептонный бульон (МПБ). Состав:

- ферментативный пептон

- экстракт мяса(1:2)

- натрия хлорид

- глюкоза

Сахарный бульон. Питательная среда для бактерий. Готовят добавлением к МПБ, сделанному на основе перевара Хоттингера (рН 8), или к бульону Мартена (рН 8,2) 40% стерильного р-ра глюкозы так, чтобы конечная концентрация глюкозы достигала 1-2%. Стерилизуют при 112°С в течение 30 мин.

Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ПД-агар), pH (7,2±0,2). Состав (на 1 л):

- пептон ферментативный, сухой для бактериологических целей – 9,0 г

- гидролизат казеина ферментативный, неглубокой степени расщепления – 8,0 г

- дрожжевой экстракт – 3,0 г

- хлорид натрия – 5,0 г

- натрий гидроортофосфат – 2,5 г

- агар микробиологический – 13 г

Навеску компонентов в количестве 38,5г. размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3мин. до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, разливают в чашки Петри слоем 3-4мм. После застывания среды, соблюдая правила асептики, чашки подсушивают при t (37+1)°С в течение 40-60мин. Готовая среда в чашках прозрачная или слегка опалесцирующая желтого цвета.

Питательный солевой агар (ПА). Состав:

-мясной воды — 1000 мл;

-хлористый натрий — 75,0 г;

-пептона — 10,0 г

- агар-агар — 20,0 г.

Среда стерилизуется при 110°С тридцать минут, рН = 7,2— 7,4. После стерилизации в автоклаве среду сохраняют в рефрижераторе при температуре 6—10°С.

Желточно-солевой агар (ЖСА)— элективно-дифференциальная среда для выделения патогенных стафилококков. Приготовление: к растопленному и остуженному до 50—55° мясопептонному агару, содержащему 10% хлорида натрия, добавляется 20процентная желточная взвесь. Яйцо перед вскрытием моют в теплой воде с мылом, помещают в 5% раствор карболовой кислоты на 4 минуты, протирают стерильной ватой, смазывают спиртом и обжигают. В стерильную колбу выливают стерильно извлеченный желток, перемешивают с 180—200 мл стерильного физиологического раствора до получения однородной суспензии. Желточная взвесь, разлитая на чашки, может храниться при температуре от 4 до 8° 20— 30 дней. На этой среде патогенный стафилококк через 24 часа образует колонии с радужным венчиком в результате лецитовителазной реакции. При отсутствии ЖСА для выделения стафилококков можно использовать МПА с 10% содержанием хлорида натрия и МПБ с 10—15% содержанием хлорида натрия.

Агар Мюллера-Хинтона ,рекомендуется для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и сульфаниламидам методом дисковой диффузии, как установлено Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS). Состав:

Мясопептонный порошок

2.0 г

Дигерирование казеина в кислоте

17.5 г

Крахмал

1.5 г

Агар

17.0 г

Размешать 58,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Довести до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при давлении 1,1 атм (121ºС) в течение 15 мин. Тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри.

3 Определение чувствительности к антибиотикам

Для определения чувствительности стафилококка к антибиотикам смыв 1,0 мл двухмиллиардной суспензии испытуемой культуры засевают газоном на чашку Петри с ПА или на среду Мюллера-Хинтона. На засеянные, подсушенные чашки, пинцетом (стерильно) накладывают бумажные цветные диски, пропитанные различными антибиотиками. Хранить диски нужно в сухом месте при температуре не выше 20°С. Диски накладывают на расстоянии двух сантиметров от края чашки и на равном расстоянии один от другого. Чашки на 18—20 часов помещают в термостат при температуре 37°С. Появление стерильных зон вокруг дисков указывает на задерживающее действие антибиотиков. Величина стерильных зон указывает на эффективность действия антибиотиков. Оценка результатов производится с помощью линейки. Измеряют диаметр зон задержки роста микробов вокруг бумажных дисков, включая диаметр самого бумажного диска. Если зона задержки роста вокруг диска отсутствует, то, следовательно, микроб устойчив к данному антибиотику. Микроб малочувствителен, когда зона задержки роста диаметром до 15 мм, чувствителен — от 15 до 25 мм и высокочувствителен при зоне задержки более 25 мм.

1. Определение влияния метаболитов на рост колоний микроорганизмов

На твердой среде (агар). В эксперименте используются суточные культуры. Культура микроорганизмов, формирующих симбионтные колонии высевают на среду в чашке Петри газоном, тестовую культуру (S. аureus штамм 6538) высевают уколом (5 уколов на чашку), культивируют при комнатной температуре в течение суток.

На жидкой среде (сыхарный бульон). Физиологическим раствором (3 мл) смывают с косяков клетки симбионтных колоний. Центрифугируют 15 мин при 500 об/мин. Надосадочнуюжидкость отсасывают шприцом с фильтром. Осадо переносят во флаконы с сахарным бульоном (1 мл), добавляют тестовую культуру стафилоккока до достижения концентрации по стандарту мутности 0,05-0,1. Пробы культивируют в течение 72 часов при 37°С. Изменение концентрации клеток фиксируют спомощью спектрофотометра, при длине волны 590 нм, в кювете объемом 1 см³.

Результаты и обсуждение

1 Идентификация стафилококков. Из клиники пробы забирались в течении часа, хранились в холодильнике. В лаборатории каждая проба (1-2 капли) высевалась газоном на чашки Петри с дифференциальной средой (ЖСА) и культивировалась в течении суток в термостате при 37°С. На следующие сутки производилось описание колоний.

Из 25 образцов в 10 был зафиксирован рост колоний, некоторые из которых по морфологическим признакам - форме, размерам, цвету, наличию радужного венчика (зеркальца) можно было отнести отнести к роду Staphilococcus.

Образец 2. Сплошной рост, колонии глянцевые, грязно-белые (бесцветные), выпуклые, ровный край, гладкие, однородная структура, зеркальце с бензиновым отливом, снимается легко. Одна колония оранжевая (пигментированная), глянцевая, не выпуклая, ровный край, гладкая, однородная структура, снимается легко. Четыре колонии тёмно молочно цвета (пигментированная) с тёмным центром, глянцевая, гладкая, не выпуклая, ровный край, однородная структура, снимается легко.

Образец 3. Сплошной рост представлен несколькими матовыми колониями, неправильной формы («ромашка»), окраска белая (пигментированная), тусклая, ровный край, выпуклая, структура мелкозернистая, плотная. Также есть колонии жёлтые (пигментированные), ровный край, глянцевые, гладкие, не выпуклые, однородная структура, снимается легко. Белые (пигментированные), с зеркальцем, выпуклые, ровный край, гладкие, однородная структура, снимается легко.

Образец 4. Крупные единичные колонии неправильной формы («ромашка»), белая (пигментированная), тусклая, ровный край, выпуклая, структура мелкозернистая, плотная. Три жёлтые (пигментированные), ровный край, глянцевые, гладкие, не выпуклые, однородная структура, снимается легко. Две колонии оранжевые (пигментированная), глянцевые, не выпуклые, ровный край, гладкие, однородная структура, снимается легко. Белые (пигментированные), с зеркальцем, выпуклые, ровный край,гладкие, однородная структура, снимается легко.

Образец 5. Единичные колонии, четыре неправильной формы («ромашка»), белая (пигментированная), глянцевая, ровный край, выпуклая, структура мелкозернистая, плотная. Три колонии белые (пигментированные), с зеркальцем, выпуклые, ровный край, гладкие, однородная структура, снимается легко.

Образец 10. Сплошной рост мелкие, глянцевые, гладкие, белые (пигментированные), с зеркальцем, выпуклые, ровный край, однородная структура, снимается легко.

Образец 14. Сплошной рост, грязно-белые (бесцветные), матовые, складчатые с зеркальцем, ровный край, выпуклые, структура однородная, плотная.

Образец 15. Сплошной рост, грязно-белые (бесцветные) к центру насыщенней, глянцевые, гладкие, выпуклые, с зеркальцем, ровный край, однородная структура, снимается легко. Круглая, белая (пигментированная), гладкая, плоская, матовая, в центре глянцевая выпуклая пуговка, крупная 5мм, ровный край, структура однородная, слизистая (прилипает к петле).

Образец 16. Сплошной рост, глянцевые, гладкие, выпуклые, грязно-белые (бесцветные) к центру молочные, с зеркальцем, ровный край, однородная структура, снимается легко. Несколько колоний глянцевые, круглые, светло-оранжевые (пигментированные), гладкие, выпуклые, мелкие 2мм, ровный край, структура однородная, тягучая. Одна жёлтая (пигментированная), мелкая, круглая, глянцевая, гладкая, выпуклая, ровный край, однородная структура, снимается легко. Три матовых, с зеркальцем, с выпуклой глянцевой пуговкой, ровный край, структура однородная, снимается легко.

Образец 18. Сплошной рост, круглые, грязно-белые (бесцветные), гладкие, выпуклые, глянцевые, мелкие 1мм, ровный край, структура однородная, снимается легко. 13 колоний матовых, с зеркальцем, с глянцевой выпуклой пуговкой, ровный край, выпуклые, структура однородная, снимается легко.

Образец 20. Сплошной рост, глянцевые, оранжевые (пигментированные), гладкие, выпуклые, мелкие 2мм, звёздообразные, с зеркальцем, ровный край, структура однородная, тягучая. Круглые, грязно-белые (бесцветные), гладкая, не выпуклые, мелкие 1мм, ровный край, структура однородная, снимается легко.

Колонии, образовавшие зеркальце, были пересеяны на чашки с ПА и использованы в дальнейших экспериментах.

Количество образцов, в которых были обнаружены стафилококки, позволяет сделать вывод о том, что в структуре возбудителей различных инфекций, выявленных у домашних животных (у собак, преимущественно) в период с июля 2012 г. по апрель 2013 г. стафилококки не преобладают.

2 Определение чувствительности к антибиотикам культур Staphilococcussp., выделенных от животных

Устойчивость бактериальных агентов инфекционных заболеваний к антибиотикам является основной причиной, ограничивающей эффективность антибактериальной терапии. Особое значение проблема резистентности микроорганизмов имеет по отношению к стафилококкам, шигеллам, эшерихиям, протею, среди которых антибиотикоустойчивые штаммы выделяются с наибольшей частотой. У других, реже встречающихся микроорганизмов, таких как Citrobacter, Providenciae, Moraxella и Acinetobacter, также может развиваться резистентность к ряду антибиотиков.

При лечении заболеваний, вызванных стафилококками, необходимо учитывать, что в результате широкого применения антибиотиков (с лечебными и профилактическими целями) появились устойчивые к антибиотикам разновидности и возникли в связи с этим большие затруднения в лечении больных людей и животных. Поэтому перед началом лечения очень важно установить чувствительность выделенного микроба к антибиотикам, а при необходимости — к сульфаниламидам и препаратам нитрофуранового ряда.

В данной работе чувствительность выделенных от животных стафилококков к различным антибиотикам определялась с помощью метода стандартных дисков (таблица 6). Эффективность ингибирующего действия антибиотиков оценивали по величине стерильной зоны вокруг дисков. Если зона задержки роста вокруг диска отсутствовала, то делался вывод, что микроб устойчив к данному антибиотику. Размер зоны задержки роста, служащий критерием чувствительности микроорганизма, различается для каждого использованного в эксперименте антибиотика и составляет от 12 до 29 мм.

Таблица 6 - Определение чувствительности к антибиотикам

АНТИБИОТИК (СТЕРИЛЬНАЯ ЗОНА - КРИТЕРИЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ, ММ)	ОБРАЗЦЫ, ИЗ КОТОРЫХ ПОЛУЧЕНЫ КОЛОНИИ
	4	3	14	15	16	20
КЛАРИТРОМИЦИН (≥ 18)	22	25	39	10	20	34
ТЕТРАЦИКЛИН (≥ 22)	27	33	Н.о.	Н.о.	Н.о.	Н.о.
ЦИПРОФЛОКСАЦИН (≥ 21)	22	24	Н.о.	Н.о.	Н.о.	Н.о.
АЗИТРОМИЦИН (≥ 18)	21	24	27	26	Н.о.	14
БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИН (≥ 29)	11	12	25	2	Н.о.	42
ВАНКОМИЦИН(≥ 12)	13	15	26	24	0	21
ЛЕВОФЛОКСАЦИН(≥17)	23	24	38	30	46	31
АМОКСИЦИЛЛИН(≥ 29)	12	13	36	24	40	39
АМОКСИЦИЛЛИН/ КЛАВУЛАНОВАЯ КИСЛОТА(≥ 20)	35	33	32	32	Н.о.	43
ОКСАЦИЛЛИН(≥13)	Н.о.	Н.о.	0	0	Н.о.	20
КЛИНДАМИЦИН(≥21)	Н.о.	Н.о.	47	26	Н.о.	39
ГЕНТАМИЦИН(≥ 17)	Н.о.	Н.о.	42	33	30	30
ФУЗИДИН(≥ 21)	Н.о.	Н.о.	34	12	40	45
РИФАМПИЦИН(≥20)	Н.о.	Н.о.	10	0	Н.о.	32
ЛЕВОМИЦЕТИН(≥ 19)	Н.о.	Н.о.	36	0	38	44

0 – отсутствие зоны просветления, Н.о. – колонии неправильной формы, слившиеся друг с другом

Не была обнаружена корреляция между хроническим течением заболевания (на примере образцов 4, 3и 20)и повышенной устойчивостью к антибиотикам. Культуры стафилококков, выделеннае из образцов 3 и 4, были нечувствительны к 6 антибиотикам из 15, в том числе к тем, которые традиционно используются для лечения стафилококковых инфекций (оксациллин, гентамицин, фузидин, рифампицин) и малочувствительны к некоторым β-лактамным антибиотикам (бензилпенициллин, амоксициллин). Напротив, культура, выделенная из образца 20, также полученного от животного с хроническим заболеванием, была наиболее чувствительна по отношению ко всем использованным антибиотикам, за исключением тетрациклина и ципрофлоксацина. Культура стафилококка, выделенная из образца 16, также была не чувствительна к 9 антибиотикам из 15, однако к кларитромицину, левофлоксацину, амоксициллину, гентамицину, фузидину и левомицетину проявляла повышенную чувствительность. Образцы 14 и 15 были нечувствительны к тетрациклину, ципрофлоксацину, оксациллину. Образец 15 – к рифампицину и левомицетину.

Таким образом, образцы культур Staphilococcussp,полученные от животных, страдающих различными заболеваниями, характеризуются разной степенью чувствительности к антибиотикам разных классов. Чувствительность к антибиотикам не зависит от пола животного и от характера заболевания, так от животных с хроническими инфекциями выделяются как устойчивые, так и чувствительные к антибиотикам культуры стафилококков.

3 Изучение влияния метаболитов симбиотических культур на рост клеток Staphilococcussp на твердой и жидкой средах

Вся микрофлора тела животного может быть названа аутомикрофлорой,, то есть это микрофлора любого состава данного организма в норме и при патологии. Нормальную микрофлору, связанную только со здоровым статусом организма, можно подразделить на две части:

1) облигатную, постоянную часть, сложившуюся в филогенезе и онтогенезе в процессе эволюции, которую еще называют индигенной (т. е. местной), аутохтонной (коренной), резидентной и т. д.;

2) факультативную, или транзиторную.

Многие входящие в указанные группы виды являются призванными симбионтами макроорганизма (лактобактерии, бифлдобактерии) и полезны для него. Определенные полезные функции выявлены у многих непатогенных видов клостридии, бактероидов, эубактернй, энтерококков, непатогенных кишечных палочек и т. д. Однако, в состав аутомикрофлоры периодически могут включаться и случайно проникающие в макроорганизм патогенные микроорганизмы. В дальнейшем эти патогены могут:

а) более или менее длительно существовать в организме в составе всего комплекса его аутомикрофлоры; в таких слу чаях формируется носительство патогенных микробов, но ко личественно, все же, превалирует нормальная микрофлора;

б) быть вытеснены (быстро или несколько позже) из макроорганизма полезными симбиотическими представителя ми нормальной (аутохтонной) микрофлоры и элиминировать;

в) размножиться, потеснив нормальную микрофлору, и при определенной степени колонизации макроорганизма способны вызвать соответствующее заболевание.

Нами была исследована активность, в отношении культуры стафилококка, метаболитов, продуцируемых колониями микроорганизмов выделенных из различных образцов одновременно со стафилококками. В качестве образцов симбионтной микрофлоры были взяты микроорганизмы из колоний, которые по морфологическим и биохимическим свойствам отличались от колоний Staphilococcussp. (таблица 7).

Таблица 7 – Образцы симбионтных колоний

Образец (№)	Симбионтная колония	Описание
15	5,3	Круглая, белая (пигментированная), гладкая, плоская, матовая, в центре глянцевая выпуклая пуговка, крупная 5мм, ровный край, однородная, слизистая (прилипает к петле).
16	6,1	Круглая, светло-оранжевая (пигментированная), гладкая, выпуклая, глянцевая, мелкая 2мм, ровный край, однородная, тягучая.
18	8,2	Круглая, грязно-белая (бесцветная), гладкая, выпуклая, глянцевая, мелкая 1мм, ровный край, структура однородная, снимается легко.
20	11,1	Круглая, грязно-белая (бесцветная), гладкая, не выпуклая, мелкая 1мм, ровный край, структура однородная, снимается легко.

Действие симбионтов оценивали по влиянию на рост тестовой (контрольной) культуры на твердой среде (рис. 4) по методу Тирранен [Тирранен, 1980 ].

Было показано, что метаболиты 8,2, 6,1, 5,3, выделяемые микроорганизмами, колонии которых существуют в симбиозе с колониями стафилококков, в значительной степени ингибируют рост тестовой культуры S.aureus. Размер колоний тестовой культуры в присутствии всех метаболитов снижался более чем на 20% (рис.4). Процент ингибирования роста составил от 84 до 89%. Исключение составляет метаболит 11,1, влияние которого на рост тестовой культуры не столь заметно, процент ингибирования роста в этом случае составил 31%.

Рисунок 4 . Влияние симбионтных метаболитов на рост культуры S.aureus, штамм 6538, на агаре; 8,2; 6,1; 11,1; 5,3 – образцы метаболитов.

Сходное действие оказывают метаболиты и на рост «опытных» колоний стафилококка, выделенных из образцов, полученных от больных животных (рис.5). Так, было показано, что метаболиты 8,2; 6,1; 5,3 значительно угнетают рост стафилококков «опытной» культуры, процент ингибирования роста составляет от 82% до 100%-колонии из образцов 15 и 18. Метаболит 11,1 также отличается от других метаболитов более «мягким» воздействием на «опытные» колонии, также как и на тестовую культуру, процент ингибирования роста в этом случае составляет от 46% до 58%. Исключением является стимулирующее действие метаболита 11,1, на колонии, полученные из образца 18. В присутствие этого метаболита произошло увеличение размера «опытной» колонии на 140%, тогда как в присутствии остальных метаболитов она полностью подавлялась.

Рисунок 5. Влияние симбионтных метаболитов на рост культур стафилококков, выделенных из образцов (15, 16, 18, 20), полученных от животных; на агаре. 8,2; 6,1; 11,1; 5,3 – образцы метаболитов.

Из всех выделенных колоний стафилококков, культура, полученная из образца 20, оказалась наиболее чувствительная к действию антибиотиков. В связи с этим она была взята в качестве «опытной» культуры, в отношении которой также оценивали действие метаболитов симбионтной микрофлоры.

В результате эксперимента было показано (рис.6, а), что все метаболиты, при совместном культивировании с образцом «опытной» культуры, на жидкой питательной среде, в незначительной степени ингибируют ее рост. Наблюдения проводили в течение 72 часов, результаты оценивали по значениям оптической плотности, измеряемой с помощью спектрофотометра при длине волны 590 нм. Процент ингибирования роста составил от 10% до 30% (рис.6,б).

А

Б

Рисунок 6. Влияние симбионтных метаболитов на рост культуры стафилококка, выделенной из образца 20 (а, б) на жидкой среде. 8,2; 6,1; 11,1; 5,3 – образцы метаболитов.

Известно [Cидоренко, 2004], что скорость роста микроорганизмов на разных средах различна и накапливаемые ими метаболиты на разных средах могут различаться качественно и количественно. Взаимодействие микроорганизмов посредством выделяемых ими веществ широко распространено и может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие.

Исходя из результатов проделанного эксперимента, можно сделать вывод, что микрофлора, сосуществующая в симбиозе с патогенными стафилококками, выделенными от животных, способна продуцировать метаболиты, которые, в основном, тормозят рост патогенов. Возможно, это проявление определенного приспособительного механизма, характерного для макроорганизма, который позволяет избегать развития генерализованной формы инфекции.

Выводы

1. В структуре возбудителей различных инфекций, выявленных у домашних животных в период с июля 2012 г. по апрель 2013 г. стафилококки не являются доминирующими. Возбудители стафилококковой инфекции выделяются преимущественно от собак (90% образцов).

2. Образцы культур Staphilococcussp,полученные от животных, характеризуются разной степенью чувствительности к антибиотикам разных классов. Чувствительность к антибиотикам не зависит от пола животного и от характера заболевания, так от животных с хроническими инфекциями выделяются как устойчивые, так и чувствительные к антибиотикам культуры стафилококков.

3. Микрофлора, сосуществующая в симбиозе с патогенными стафилококками, выделенными от животных, способна продуцировать метаболиты, которые, в основном, тормозят рост патогенов.

Список литературы

1. Авдиенко, В.А. Методические рекомендации по лечению демодекоза плотоядных, осложненного стафилококковой инфекцией // Российский паразитологический журнал – 2007.- № 2. - С.1-5.

2. Езепчук, Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. / Ю.В. Езепчук, М., Медицина, 1985.

3. Косенко В.А. Материалы к изучению «признаков состояния» у стрептококков и стафилококков, выделенных при некоторых ЛОР-заболеваниях / В.А.Косенко // Автореф.дис.канд.биол.наук., Ленинград, 1973.

4. Костылева, А.О. Стафилококкозы собак и кошек (клиника, лечение) // Вестник Государственного Алтайского аграрного университета. - 2008. -№2(18). -С.1-4.

5. Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С. Влияние летучих метаболитов сапрофитной микрофлоры почв на размножение патогенных бактерий // Журн. микробиол.,2004 - №.3 – С. 18-23.

6. Сильвестров, В. П., Лутошкин, С. Ф., Резников, Ю. П. // Терапевтический архив — 1982. — № 10. — C. 69—72.

7. Скрипкин, Ю.К. Кожные и венерические болезни. Руководство для врачей. /Под ред Ю.К.Скрипкина - М.: Медицина, 1995 г.

8. Смирнов, В.В. Стафилококк. / В.В. Смирнов –Киев.: Наукова думка, 1988.

9. Старченков, С.В. Болезни собак и кошек. Комплексная диагностика и терапия болезней собак и кошек / под ред. С.В.Старченкова.- М.: Специальная литература, 2006.-655с.

10. Тирранен Л.С., Ковров Б.Г., Черепанов О.А. Характер взаимодействия микроорнанизмов через их газообразные метаболиты // Микробиолгия – 1980 –Т.49 - № 5 – С. 788-793.

11. Чухловин, А.Б. Общие болезни человека и собак: проблемы диагностики и профилактики //Клинико-лабораторный консилиум - 2008.- №. 4.- С.1-6.

12. Berg, J.N., Maas, J.P., Paterson, J.A., Krause, G.F., Davis, L.E. Efficacy of ethylenediamine dihydriodide as an agent to prevent experimentally induced bovine foot rot // Am J Vet Res.-1984.-V.45(6).-P.1073-1078.

13. Foggie, A. Studies on the source of the staphylococcal infection found in tick pyaemia of lambs // J. Comp. Path. & Therap.-1947.-N.57.-P. 245-260.

14. Gustafson, B. A., Svehag, A. Antibiotic resistance of staphylococci isolated from dogs // Nord. veterinarmed. – 1956.-N.8.-P. 493-496.

15. Mann, P. H. Antibiotic sensitivity testing and bacteriophage typing of staphylococci found in the nostrils of dogs and cats //J. Am. Vet. M.A.-1959.-N. 134.-P. 469-470.

16. Morrison, J. F. Fair, and K. K. Kennedy Staphylococcus aureus in domestic animals//Public Health Rep-1961.-N. 76. - P. 673-677.

17. Pagano, J. S. Isolation from animals of human strains of staphylococci during an epidemic in a veterinary school // Science-1960.-N. 131. - P. 927-928.

18. Tuchscherr, L., Medina, E., Hussain, M., Völker, W., Heitmann, V., Niemann, S., Holzinger, D., Roth, J., Proctor, R. P., Becker, K., Peters, G., Löffler, B. [Электронный ресурс] // Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection: EMBO Molecular Medicine: электрон. журнал. - Режим доступа: http://www.sciencedaily.com/releases/2011/01/110126081521.htm

 

Код для цитирования: Скопировать