VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

Введение

Важным этапом контроля и лечения инфекционных заболеваний, вызванных разнообразными вирусами, является лабораторная диагностика, которая в большинстве случаев основывается на выявлении специфических антител и антигенов в сыворотках крови инфицированных и переболевших людей или животных. В настоящее время разработаны средства и методы диагностики, позволяющие в короткие сроки выявлять большинство инфекционных заболеваний. Однако диагностика некоторых инфекциях представляет актуальную, но сложную проблему и требует разработки и внедрения в практику современных диагностических наборов на основе высокочувствительных тест-систем.

Несмотря на то, что диагностика многих инфекций решена на уровне практического применения наборов для иммуноферментного анализа (ИФА), лабораторная практика России пока не располагает диагностическими наборами для проведения дифференциального серологического мониторинга геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусной инфекции у природных носителей. Одной из возможных проблем, обуславливающих отсутствие решений этой проблемы, может служить трудность получения иммунных сывороток, используемых для создания тест-систем, выбора и исследования соответствующего антигена, и обладающих высоким титром нейтрализующих антител. Известные в настоящее время способы получения лечебно-профилактических и диагностических иммунных сывороток, имеют общие недостатки, заключающиеся в невысокой активности получаемых препаратов, трудоёмкости процесса их изготовления, низком выходе целевого продукта, обусловленного высокими отходами животных-продуцентов. Другой причиной является циркуляция на территории Российской Федерации большого количества разных антигенных вариантов (серотипов) хантавирусов, как вызывающих заболевание людей, так и апатогенных. Таким образом, в настоящее время дифференциация возбудителей ГЛПС в каждом конкретном случае, при наличии пригодного для исследования материала, как правило, проводится по результатам РТГА и РН и только в исследовательских лабораториях.

Целью настоящей работы является совершенствование и разработка подходов к получению иммунных анти-хантавирусных сывороток с высоким титром нейтрализующих антител, с использованием современных иммуномодулирующих средств, которые в дальнейшем могут использоваться для приготовления тест-систем для дифференциации различных хантавирусов.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Усовершенствовать получение анти-хантавирусных иммунных или гипериммунных сывороток на модели лабораторных животных.

2. Показать иммуностимулирующее действие препарата полиоксидония при получении иммунных сывороток.

3. Оптимизировать дозы вводимых вирусных антигенов и полиоксидония для получения наиболее максимального титра нейтрализующих антител.

4. Определить диагностическую ценность полученных иммунных сывороток для дифференциации различных штаммов хантавирусов.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Иммунные и гипериммунные сыворотки, основные понятия, использование, способы получения

Иммунизация это создание искусственного иммунитета - активного (при введении вакцин и анатоксинов) или пассивного (при введении сывороток и гамма-глобулинов). Этот метод часто применяют в лечебных и профилактических целях для лечения и профилактики различных инфекционных заболеваний. Также иммунизацию используют для получения диагностических сывороток, содержащих антитела к определенным возбудителям, или их составляющим, для использования в научно-исследовательских целях.

Путем модификации используемого для иммунизации биоматериала можно повысить его антигенность и иммуногенность.

Антигенность - способность антигенов взаимодействовать со свободными антителами, клеточными рецепторами и другими эффекторами иммунного ответа.

Иммуногенность - способность антигенов вызывать иммунный ответ. Сила иммунного ответа зависит от двух основных факторов: свойств макроорганизма и особенностей антигенов, используемых для иммунизации. Иммуногенность антигенов, получаемых из возбудителей инфекционных болезней, неодинакова. Наиболее иммуногенны экзотоксины и поверхностные антигены микроорганизмов.

Гипериммунная сыворотка — сыворотка, которая содержит антитела в наиболее высоком количестве (титре), по сравнению с иммунной сывороткой, это достигается благодаря повторной иммунизации. Гипериммунная сыворотка используется для обеспечения пассивного иммунитета в предельно короткие сроки, например при острой инфекции, если человек или животное предварительно не получали вакцину. Такие сыворотки применяются в области ветеринарной вирусологии, микробиологии и биотехнологии, в частности при производстве биопрепаратов, которые предназначены для специфической иммунотерапии, пассивной профилактики смешанных форм инфекционных заболеваний.

Применение гипериммунных сывороток для лечения ряда бактериальных инфекций (дифтерия, скарлатина, столбняк, дизентерия, сибирская язва) началось еще в конце XIX века и было обусловлено исследованиями в области иммунологии и, в частности, учением о специфических антителах. С проведением первых наблюдений, касающихся терапевтической эффективности специфических сывороток, начало формироваться направление прикладной иммунологии, получившее название сывороточного дела.

Еще в 1890 г. Е. Behring и Sh. Kitasato, иммунизируя кроликов столбнячным токсином, установили появление антитоксических свойств у сыворотки и показали, что введение этим животным 20 ДL m столбнячного токсина не вызывает заболевания. В том же году этими же авторами было показано наличие дифтерийного антитоксина в крови морских свинок, получавших сублетальные дозы дифтерийного токсина. Через год после этого открытия Е. Behring путем иммунизации лошадей впервые получил лечебную противостолбнячную сыворотку, а уже в 1893 г. С. П. Федоров и Ф. Н. Ремезов провели подобные наблюдения в России. В 1892 г. Е. Behring и К. Wernieke была получена противодифтерийная сыворотка. В России указанная сыворотка была приготовлена на лошадях одновременно в разных городах — Г. К. Габричевским (1895) в Москве, А. Д. Павловским и А. М. Максутовым (1895) в Киеве, С. К. Дзержговским (1895) в Петербурге, В. В. Родзевичем (1897) в Самаре, П. В. Бутягиным (1897) в Томске.

Первые попытки получения специфической сыворотки против газовой гангрены были предприняты в 1910 г. М. Weinberg. Автор проводил иммунизацию морских свинок постепенно возрастающими дозами Cl. perfringens и установил, что хотя сыворотка этих животных и не обладала агглютинирующими и бактерицидными свойствами, но показывала слабовыраженный защитный эффект. Более активный препарат был получен этим же исследователем только в 1915 г. вначале на баранах, а затем на лошадях.

В конце XIX в. начали предприниматься первые попытки по изучению возможности изготовления специфической сыворотки против бешенства (Babes, Lepp, 1889), а уже в 1891 г. Babes и Archez применили сыворотку иммунизированных собак для профилактики бешенства у 12 лиц, покусанных больным волком, и сообщили, что введение им 40 — 60 мл сыворотки обеспечило предупреждение заболевания у 11 человек. В дальнейшем достаточно активная сыворотка была получена от кроликов и баранов (A. Marie, 1905).

Позже исследованиями S. Ftexner (1910), S. Flexner, P. Lewis (1910), A. Petit (1918) было показано, что введение вируса полиомиелита козам, овцам и лошадям приводит к выработке специфических антител, способных нейтрализовать вирус в достаточно больших концентрациях. В дальнейшем были получены специфические гипериммунные сыворотки против вирусов оспы (Albreshoff, 1928), желтой лихорадки (G. Bauer, N. Hudson, 1930; A. Petit, G. Stefanopoulo, 1933), гриппа (P. Laidlaw с соавт., 1935), клещевого (Е. Н. Левкович, М. П. Чумаков, 1937) и японского (И. М. Родин, Л. И. Мартьянова, 1956) энцефалитов, чумы, (А. И. Желтенков, 1946), и при других опасных для человека вирусных и бактериальных инфекциях. (http://bio-mind.ru// serum/immune-1)

Интенсивно проводились исследования по возможности изготовления асцитических жидкостей, получаемых путем иммунизации белых мышей и крыс (Е. Неггшап, С. Engle, 1958; S. Buescher, 1962; A. Sartorelli с соавт., 1966; С. Я. Гайдамович с соавт., 1969).

Постоянно ведутся исследования, направленные на повышение специфической активности сыворотки животных-продуцентов путем отбора их в зависимости от иммунологической реактивности, разработки оптимальной схемы эксплуатации, повышения качества антигена, использования различных адъювантов.

В настоящее время использование гипериммунных и иммунных сывороток ограничено, и они применяются только в особых случаях при неэффективности или недоступности традиционного антибактериального лечения бактериальных инфекций (бешенство, столбняк, дифтерия) или для экстренной профилактики и лечения вирусных инфекции у ранее не вакцинированных людей и животных.

Большинство иммунологических методов исследования предусматривают применение иммунных сывороток, получаемых из крови животных, иммунизированных различными антигенами (АГ), при этом их активность существенно влияет на результаты исследования. Для получения сывороток необходимо подобрать рациональную схему иммунизации животных. Под этим подразумевают, прежде всего, такие факторы, как физико-химическое состояние АГ, дозы, способы, интервалы и кратность введения АГ, общую продолжительность цикла иммунизации, применение адъювантов и иммуномодуляторов.

Общеизвестна зависимость антителообразования от дозы АГ, вводимого животному. В малых дозах АГ обычно даёт недостаточное иммунозащитное раздражение, а в слишком больших – вызывает, так называемое, иммунизаторное утомление, приводящее к снижению титров антител (АТ). При введении больших доз АГ образуются АТ с низким аффинитетом и их синтез продолжается в течение длительного периода времени. Уменьшая дозу, можно подобрать такую, которая будет индуцировать образование высокоаффинных АТ. (Фонталин, Певницкий1978)

Результаты изучения зависимости антителообразования от кратности введения АГ свидетельствуют о совершенно очевидном преимуществе многократной иммунизации перед однократной иммунизацией. Интервалы между инъекциями иммуногена выбираются эмпирическим путем, причём результаты опытов обычно могут быть использованы только применительно к данному конкретному препарату.

Прослеживается зависимость между способом введения АГ и уровнем АТ в сыворотке крови животных. Основными причинами различия эффективности являются скорость, с которой АГ распространяется от места инъекции, и вероятность его прохождения через лимфатические узлы и другие органы иммунной системы. (Hurn, Chantler1980)

Как полагает Т. Чард, одна и та же конечная цель может быть достигнута различными путями, но в любом случае, схема иммунизации, предлагаемая для производства, должна соответствовать определенным требованиям, главное из которых – возможность получения сывороток с достаточно высоким титром специфических АТ за сравнительно короткий промежуток времени при минимальном расходовании антигенного и другого материала. (Чард1981)

Известны разнообразные способы получения высокоактивных сывороток против бактериальных антигенов различных возбудителей, реализуемых при иммунизации экспериментальных животных. Как правило, схемы их иммунизации подбирают эмпирически, ориентируясь на показатели титров гуморальных антител после завершения этапов введения соответствующих антигенных препаратов. При этом не всегда достигается требуемый уровень антител к отдельным антигенам, возникает необходимость проведения повторных циклов иммунизации. На осуществление подобных методических приемов у исследователей затрачивается большое количество времени, животных и дорогостоящих препаратов.

Например, в работе (авторское свидетельство 1069819) рассматривается способ получения антитоксической гипериммунной сыворотки против колибактериоза. Данная работа основывается на схеме, в которой с целью сокращения сроков иммунизации животным-продуцентам вводят тетравит, а введение антигена проводят пятикратно с 4-дневными интервалами между инъекциями с постепенно увеличивающейся антигенной нагрузкой.

В тех случаях, когда в работе используют антигены, сведения, об иммуногенности которых ограничены, и существует опасность неэффективной стимуляции гуморального звена иммунитета, например, при иммунизации линейных мышей-доноров В-лимфоцитов на этапе подготовки к последующему воспроизведению гибридомной технологии, важно не допустить неконтролируемого угнетения функции антителообразования вследствие передозировки использованного антигена.

Например, существует работа о способе получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к возбудителю мелиоидоза. (Новицкая, Рыбкин 1989) В основе этой работы лежит использование трех различных схем иммунизации мышей антигенами возбудителя Burkholderia pseudomallei, отличающихся сроками иммунизации и интервалами между инъекциями. Однако данные методики оказались недостаточно эффективны, трудоемки и процент антителпродуцирующих клонов в результате был не всегда достаточно высок. (http://freepatent.ru/patents/2371196)

1.2 Способы улучшения иммуногенности и получения диагностических сывороток с высоким титром

Предлагается много способов улучшения иммуногенности биоматериалов. Например, изобретение Хухарева В.В. и др. (2001) касается способов повышения антигенности и иммуногенности биоматериала. Сущность изобретения включает способ повышения антигенности и/или иммуногенности биоматериала путем воздействия на него излучения лазера с длиной волны от 9 до 11 мкм и плотностью мощности 0,1-1,0 кВт/см², при этом биоматериалом являются рекомбинантные или синтетические белки, или клеточные мембраны, или вирусы, или бактерии, или хламидии, или нормальные зрелые клетки человека, или эмбриональные клетки. Изобретение также включает способ повышения антигенности и/или иммуногенности биоматериала путем его физической модификации in vivo излучением лазера клеток эпидермиса кожи. Изобретение относится к способам повышения антигенности и иммуногенности биоматериала и предназначено для использования в биологии и медицине, в частности для диагностики и иммунотерапии инфекционных заболеваний и солидных опухолей. (http://bankpatentov.ru/node/109890)

Другое изобретение Тюменцева С.Н. и др. (1994) предназначено для производства высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток. Животных-продуцентов пятикратно иммунизируют авирулентным антигенным материалом внутривенно. Одновременно вводят внутримышечно в качестве иммуномодулятора тималин. В третьей инъекции антигена внутримышечно вводят иммуномодулятор циклофосфан. Отделяют кровь и приготавливают сыворотку. Изобретение повышает специфическую активность диагностических сывороток, упрощает и снижает трудоемкость процесса их получения при высоком выходе целевого продукта. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток при снижении трудоемкости и отхода животных-продуцентов.

Известен способ получения иммунных сывороток для тест-системы диагностической иммунофлуоресцентной (непрямой метод) к возбудителям зоонозов: чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы. (Тюменцева1996)

Схема иммунизации по этому способу включает последовательные многоточечные внутрикожные введения смеси антигенов с полным адъювантом Фрейнда. Гипериммунизация включает четыре инъекции с интервалом в шесть дней, месячный перерыв и еще четыре инъекции с шестидневным интервалом. Иммунный ответ с производственными титрами сывороток (1:256 - 1:512), определяемыми в НРИФ, отмечается лишь у 25-30% иммунизируемых кроликов по причине неравнозначного иммунного ответа на отдельные антигенные компоненты, кроме того у животных развивается адъювантная болезнь. Способ длителен и трудоемок.

Известен способ получения диагностической видоспецифической чумной сыворотки. (Дертева 1966)

Иммунизация животных-продуцентов осуществляется тремя курсами с двухнедельными перерывами между ними. В первые два курса инъекции проводят 3-кратно через 4 суток, в третьем курсе 6 инъекций через 4 суток. В каждом курсе дозы антигена увеличивают с каждой инъекцией. Животных обескровливают на 7-9 сутки после последней инъекции. Агглютинационные титры сыворотки 1:50-1:200. Сыворотка малоспецифична, способ ее получения очень длителен и трудоемок.

Таким образом, все известные способы получения диагностических моно- и поливалентных сывороток имеют общие недостатки, заключающиеся в недостаточной активности получаемых сывороток, трудоемкости процесса их получения, низком выходе целевого продукта, обусловленном высокими отходами животных продуцентов, что не обеспечивает возможности организации.

Иммуногенность препаратов это важный фактор, обуславливающий эффективность проведения. Как правило, корпускулярность препаратов, например, вакцин (живых, убитых) обеспечивает необходимую иммуногенность, в остальных случаях часто приходится использовать дополнительные методы повышения иммуногенности. Наиболее широко изучены способы повышения иммуногенности вакцин:

1. Использование оптимальной концентрации антигена.

2. Очистка вакцин от низкомолекулярных веществ, способных вызывать специфическую или неспецифическую супрессию иммунного ответа.

3. Агрегация антигена с помощью ковалентного связывания и других методов комплексообразования.

4. Включение в вакцину максимального количества эпитопов антигена.

5. Сорбция на веществах, создающих депо антигена (гидроокись алюминия, фосфат кальция и др.).

6. Использование липосом (водно-масляной эмульсии).

7. Добавление микробных, растительных, синтетических и других видов адъювантов.

8. Связывание слабого антигена с белковым носителем (столбнячным, дифтерийным анатоксином и др.).

9. Включение антигена в микрокапсулы, обеспечивающие выброс антигена через заданный промежуток времени.

10. Улучшение условий обработки и представления антигена. Использование антигенов гистосовместимости 1 и II классов или антител к этим антигенам.

Все указанные способы улучшения имунногенности вакцин, в определенной мере можно и экстраполировать на биоматериал, используемый для иммунизации животных с целью получения иммунных сывороток.

1.3 Виды адъювантов и иммуномодулирующих препаратов, используемых для улучшения иммунного ответа

Проблема поиска и внедрения новых высокоэффективных адъювантов, например, для противовирусных вакцин по-прежнему актуальна. Ее решение позволит сократить число введений антигена, что не только снизит антигенную нагрузку на организм, но также значительно упростит и удешевит сам процесс вакцинации домашних животных. К таким адъювантам предъявляются четкие требования: они должны значительно повышать иммуногенность вакцин и напряжённость иммунитета, не обладать токсичностью и аллергенностью.

Адъюванты (adjuvans – (лат.) помогающий, поддерживающий) представляют собой неспецифические иммуностимуляторы неорганической и органической природы. Впервые возможность повышения эффективности вакцины путем добавления к антигену различных веществ была продемонстрирована в 1925 году французским ученым Гастоном Рамоном. Именно Рамон ввел концепцию адьювантной поддержки вакцинации, обнаружив, что при иммунизации лошадей дифтерийным токсином более сильный иммунный ответ наблюдали у тех животных, у которых на месте введения вакцины возникала воспалительная реакция. Позднее в 1926 году А. Гленни с соавторами установили, что алюмопреципитация дифтерийного токсина значительно повышает его антигенные свойства.

Дальнейшие исследования возможности усиления иммуногенности вакцин путем преципитации белков различными металлами показали, что наилучший эффект и безопасность достигаются при использовании именно соединений алюминия.

На современном этапе, несмотря на то, что прошло более чем 80 лет с момента данного открытия, соли алюминия (гидроокись алюминия, фосфат алюминия, алюмокалиевые квасцы), по-прежнему остаются наиболее широко используемым вакцинными адъювантами. Вакцинный антиген адсорбируется на них посредством ионного взаимодействия, поэтому вакцины, приготовленные с такими традиционными адъювантами, принято называть адсорбированными или сорбированными. Считается, что в основе механизма действия вакцины, содержащей в качестве адъюванта соединение алюминия, лежит образование при парентеральном введении в месте инъекции воспалительных гранулем. Такая местная воспалительная реакция способствует повышению активности макрофагов, а образование фиброзной капсулы позволяет длительно сохранять антиген и препятствует его быстрому удалению. Однако в случае быстрого проведения инъекции, в месте введения могут образовываться стерильные персистирующие узелки. Многие сорбированные вакцины обладают достаточной антигенностью у людей при первичной иммунизации. По времени наступления, силе и продолжительности вторичного иммунного ответа при повторной (бустерной) иммунизации различия между нативной и адъювантной вакцинами незначительные. На сегодняшний день в медицинской практике большинство вакцин содержит гидрат окиси алюминия. Это относительно слабый, но безопасный вид вакцинных адъювантов.

Минерально-масляный адъювант Фрейнда представляет собой эмульсию водного адъюванта в минеральном масле с низким удельным весом и вязкостью. При использовании такого адъюванта предварительно растворенный или суспендированный в воде антиген очень тонко диспергируют в масле. По стимуляции образования антител полный адъювант Фрейнда не имеет себе равных. Однако из-за высокой токсичности, развития лихорадки, возможности повреждения внутренних органов и формирования абсцессов в месте введения его используют только в экспериментальных целях для иммунизации лабораторных животных. Использование неполного адъюванта Фрейнда в инактивированных вакцинах против гриппа и полиомиелита продемонстрировало их эффективность при низком уровне токсичности, однако недостатками этого вида вакцин, является их недостаточная стабильность.

Сапонин, экстрагируемый из коры южно-американского дерева Guillaja saponaria Molina, давно применяется в качестве адъюванта в ветеринарной иммунологии. Сапонин (Квил-А) является типичным представителем адъювантов — организаторов надмолекулярной структуры белковых антигенов. Установлено, что в основе адъювантного действия Квил-А лежит образование иммуностимулирующего комплекса (ИСКОМ) нового типа.Преимущества вакцин, приготовленных по типу ИСКОМ, заключается в возможности приготовления эффективных вакцин, их стандартизации и стабилизации. Они сохраняют морфологию и иммуногенность в живом или лиофилизированном состоянии в течение трех лет.

На современном этапе широкое использование инновационных технологий (липосом, иммуносом), послужило толчком к разработке нового типа микрокапсулированных липосомных вакцин – Новосом. Они не вызывают образования гранулем в месте введения, а местная реакция обычно исчезает в течение двух недель. Первые экспериментальные положительные результаты получены с липосомными вакцинами против ньюкастлской болезни и других вирусных болезней птиц.

Механизм усиления иммунного ответа в случае использования сорбированных или эмульгированных вакцин связан с корпускулированием антигена. В такой форме антиген более эффективно захватывается макрофагами, что в свою очередь стимулирует активацию лимфоцитов. Установлено, что использованием сорбентов или эмульгаторов в вакцинах приводит к более выраженной и продолжительной пролиферации лимфоидной ткани: в месте введения вакцины и дренирующих лимфатических узлах происходит образование грануломатозных процессов.

Однако, представление об основном механизме воздействия адъювантов на иммуногенез – длительном удержании антигена в так называемом «депо» в настоящий момент претерпело значительные изменения. Механизм адьювантного действия оказался гораздо сложнее и разнообразнее и в последние годы активно изучается, а список новых адъювантов, входящих в состав вакцин, а также препаратов, обладающих иммуноадъювантными свойствами, постоянно пополняется.

В целом, механизмы действия различных иммуноадъювантов разнообразны и до настоящего времени до конца не изучены, что обусловлено различием строения, как антигенов, так и самих адъювантов.

Многочисленные исследования по изучению адъювантных свойств лекарственных препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью демонстрируют их стимулирующее влияние на иммуногенность вакцин. Установлено, что использование препаратов с иммуномодулирующей активностью на фоне вакцинации изменяет баланс эндогенных цитокинов в организме и оказывает влияние на развитие антигенспецифического иммунного ответа.

Вещества, обладающие иммуномодулирующей активностью, можно разделить на три группы: эндогенные, экзогенные и синтетические. К иммуномодуляторам первой группы относятся иммунорегуляторные пептиды и цитокины, второй группы – вещества микробного происхождения, в основном грибкового и бактериального. При этом воздействие иммуномодуляторов на иммунную систему заключается в способности как вызывать развитие иммунного ответа, так и регулировать его дальнейшее развитие. Наиболее характерными представителями адъювантов второго типа являются О-антигены, или липосахаридные эндотоксины грамположительных бактерий, играющие роль адъювантов для других антигенов, одновременно присутствующих в данной вакцине. Усиливающий эффект одного из антигенов (например, возбудителя коклюша) часто учитывают при вакцинации детей комбинированными вакцинами против наиболее распространенных заболеваний (АКДС). К третьей группе относятся синтетические аналоги препаратов первых двух групп, а также вещества, полученные в результате направленного химического синтеза, например, полиэлектролиты.

Впервые адъювантные свойства убитых бактерий были продемонстрированы в работах Фрейнда. Несколько позднее Ледерер с соавторами показал, что именно компоненты клеточной стенки микобактерий (трипептидные моносахариды) обладают адъювантным действием. В дальнейшем были синтезированы химические аналоги мурамилдипептидов, которые в настоящий момент используются как иммуномодуляторы (ликопид), а так же входят в состав некоторых вакцин в качестве адъювантов.

В серии работ отечественных ученых получены убедительные данные об адъювантной активности полиоксидония, ликопида, ИРС-19, рибомунила. (Харит 2004)Одним из перспективных направлений повышения эффективности вакцинации, является использование в качестве адъювантов различных цитокинов. Цитокины оказывают влияние практически на все клетки, воздействуя на большинство процессов, протекающих в организме. Они обеспечивают межклеточную кооперацию и регулируют иммунные процессы. Их активная продукция происходит в ответ на различные стимулирующие агенты, а действие неспецифично. Цитокины образуют особую сеть, модулируя экспрессию поверхностных рецепторов и индуцируя секрецию друг друга. Благодаря высокоаффинным рецепторам на клетках-мишенях они способны вызывать биологические эффекты в малых концентрациях.

В серии экспериментальных работ проведено исследование адъювантных свойств цитокинов и препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью, на экспериментальных моделях животных. Изучены адъювантные свойства таких цитокинов как IL-1b, IL-2, ФНО-α, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF в формировании поствакцинального иммунитета у экспериментальных животных при иммунизации против вирусного гепатита А, и гепатита В, бешенства, клещевого энцефалита, малярии, герпетической и других инфекций. Было установлено усиление специфического и неспецифического клеточного иммунитета, повышение уровня вируснейтрализующих антител в сыворотке крови. Наиболее выраженный иммуностимулирующий эффект был выявлен у рекомбинантных цитокинов – фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-1β, а также у препаратов «Полиоксидоний» и «Имунофан».

Таким образом, одним из перспективных направлений современной вакцинологии является обеспечение адекватного иммунного ответа при вакцинации. Использование препаратов с иммуномодулирующей активностью на фоне вакцинации может изменять баланс эндогенных цитокинов в организме и оказывать влияние на развитие антиген-специфического иммунного ответа. (Акользина 1996)

В связи с этим цитокины, регулирующие каскад иммунных реакций на любое антигенное воздействие, можно рассматривать как потенциальные иммуноадъюванты. Многочисленные экспериментальные данные и отдельные клинические наблюдения свидетельствуют о высокой эффективности использования цитокинов в качестве адъювантов.

1.4 Полиоксидоний – как модулятор иммунного ответа

Полиоксидоний (ПО) - это физиологически активное соединение с молекулярной массой 100 кДа, обладающее выраженной иммуномодулирующей активностью. По своей химической структуре он является сополимером N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиния бромида с молекулярной массой 80 кДа. (Некрасов, Пучкова 1998)

Механизм иммунотропного действия полиоксидония.

Начиная с 1983 г., группой авторов под руководством Р.В. Петрова детально изучался механизм действия полиоксидония на все звенья иммунной системы. (Петров, Хаитов 1999)

Установлено, что этот препарат оказывает активирующее действие на неспецифическую резистентность организма, фагоцитоз, гуморальный и клеточный иммунитет.

Одним из главных биологических свойств полиоксидония является его способность стимулировать антиинфекционную резистентность организма. Предварительное его введение за 48, 72 и 96 ч. может существенно повысить устойчивость животных к заражению несколькими DCL патогенного микроорганизма S. typhimurium. На 10-12 сут. после заражения процент выживших мышей, получавших полиоксидоний, составлял 85-95 %, тогда как к этому сроку в контроле наблюдалась 100%-ная их гибель. Такой эффект полиоксидония, вероятно, тесно связан с его способностью существенно повышать функциональную активность клеток фагоцитарной системы.

Установлено, что полиоксидоний действует на все звенья фагоцитарного процесса: активирует миграцию фагоцитов, усиливает клиренс чужеродных частиц из кровотока, повышает поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов. При оценке последнего параметра с помощью проточной цитометрии и "двойной метки" было установлено, что полиоксидоний в 1,5-2 раза усиливает способность фагоцитов периферической крови нормальных доноров убивать S. aureus и это усиление носит дозозависимый характер. Так, лейкоциты крови здоровых доноров за 1 ч убивают примерно 30 % клеток стафилококка. При инкубации с полиоксидонием в дозе 500 мкг/мл лейкоциты убивают более 50 % клеток стафилококка.

К настоящему времени установлено, что главными регуляторами иммунитета являются растворимые медиаторы - цитокины, продуцируемые как клетками моноцитарно-макрофагальной системы, так и лимфоцитами. (Ярилин 1997)

Поэтому была исследована в опытах in vitro с помощью иммуноферментного анализа способность полиоксидония индуцировать синтез цитокинов в культуре мононуклеров периферической крови здоровых доноров и оказывать костимулирующий эффект на синтез цитокинов, индуцированный соответствующим стимулятором.

Оказалось, что полиоксидоний в определенных дозах обладает способностью стимулировать как спонтанный, так и индуцированный синтез цитокинов, продуцируемых в основном клетками моноцитарно-макрофагальной системы и нейтрофилами: IL-1, IL-6, TNF-, -интерферона, причем в последнем случае он только усиливал продукцию интерферона, индуцированную вирусом болезни Ньюкасла. Сам по себе способностью индуцировать синтез -интерферона полиоксидоний не обладал.

Вероятно, усиление полиоксидонием продукции провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF лежит в основе его способности усиливать антиинфекционную резистентность организма, так как эти цитокины являются одними из главных активаторов функциональной активности фагоцитарных клеток. Чрезмерное усиление образования провоспалительных цитокинов опасно для организма, так как эти медиаторы могут быть причиной тяжелых патологических процессов, например септического шока. При индивидуальном анализе продукции цитокинов было обнаружено, что полиоксидоний усиливает образование TNF только у лиц с исходно пониженным или среднем уровнем синтеза цитокина и не оказывает влияния или даже несколько понижает продукцию у лиц с исходно повышенным его синтезом. Таким образом, в отношении индукции синтеза цитокинов полиоксидоний выступает как истинный иммуномодулирующий препарат.

Важными, на наш взгляд, являются данные об индукции полиоксидонием синтеза IL-6, который в свою очередь обладает способностью подавлять образование провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF. Таким образом, IL-6 является одновременно и провоспалительным и противовоспалительным цитокином. Поэтому, вероятно, способность полиоксидония индуцировать образование и провоспалительных, и противовоспалительных цитокинов лежит в основе его иммуномодулирующего эффекта.

При взаимодействии с мононуклеарами периферической крови человека полиоксидоний усиливает цитотоксичность NK-клеток, но только в том случае, если она была исходно понижена. На нормальные уровни цитотоксичности лимфоцитов он влияния не оказывает, т. е. и в этом случае полиоксидоний действует как иммуномодулирующий препарат.

Следовательно, клетками-мишенями для полиоксидония in vitro являются, прежде всего, факторы естественной резистентности: моноциты/макрофаги, нейтрофилы и NK-клетки - факторы ранней защиты организма от инфекции.

Однако в условиях in vivo полиоксидоний обладает более сложным и многогранным эффектом на иммунную систему. Так как развитие иммунного ответа начинается с антиген-представляющих клеток, к которым относятся клетки моноцитарно-макрофагальной системы, и так как цитокины, продуцируемые этими клетками, обладают плейотропным эффектом, то усиление под влиянием полиоксидония их функциональной активности в условиях целостного организма ведет к активации и клеточного, и гуморального иммунитета.

В условиях in vivo полиоксидоний обладает выраженной способностью стимулировать гуморальный иммунный ответ. При введении совместно с низкими дозами антигена полиоксидоний усиливает антителообразование в 5-10 раз по сравнению с животными, получавшими только один антиген. Важно отметить, что такое усиление можно наблюдать у старых мышей, у которых иммунный ответ по сравнению с молодыми животными существенно снижен. Полиоксидоний восстанавливает иммунный ответ на Т-зависимый антиген (эритроциты барана) у мышей линии C57Bl/6, c генетически детерминированным пониженным ответом на этот антиген, а также у так называемых В-мышей, в организме которых практически отсутствуют Т-клетки. Таким образом, полиоксидоний обладает способностью приводить в движение все факторы неспецифической и специфической защиты организма от чужеродных агентов антигенной природы, и это движение распространяется естественным путем, так как это происходит при развитии иммунного ответа в организме.

Помимо иммуномодулирующего полиоксидоний обладает выраженным детоксицирующим, антиоксидантным и мембраностабилизирующим эффектами. При совместном введении полиоксидония и CuSO₄ происходит 100%-ная защита животных от действия ядовитого сульфата меди при 100%-ной гибели их в контроле.

Другим ярким примером детоксицирующего и мембраностабилизирующего эффекта полиоксидония является нейтрализация гемолитического эффекта двуокиси кремния. Это вещество в дозе 3 мг/мл вызывает 90%-ный лизис эритроцитов. Детоксикант гемодез и альбумин в дозе 1 мг/мл защищают эритроциты от лизиса, вызываемого двуокисью кремния. Полиоксидоний в такой же степени защищает эритроциты от лизиса, но в дозе, в 100 раз меньшей.

Иммуномодулирующие свойства полиоксидония находят широкое применение в медицине, в том числе и экспериментальной. Например, при получении антирабических сывороток, использовании как адъюванта при разработке антихламидийной вакцины, и др.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Штаммы хантавирусов, использованные в работе

Для иммунизации лабораторных животных использовали следующий штамм хантавируса из рабочей коллекции лаборатории ГЛПС ФГБУ «НИИЭМ» СО РАМН (таблица 1), для которого ранее показана высокая иммуногенность:

Таблица 1.

Штаммы хантавирусов, использованные в эксперименте

№ пп	Источник выделения штамма	Обозначение штамма	Географическое происхождение, дата выделения	Типирование
	Полевая мышь A.agrarius	ПМ-95	Приморский край, Спасский район Январь 1996	Геновариант Far East вируса Хантаан

Для заражения животных использовали вируссодержащий супернатант, полученный при культивировании линии клеток Vero E-6, инфицированной различными штаммами. Титр вируса при иммунизации составлял не менее 5,0 lg ФОЕ/1,0 мл.

А) Выделение хантавирусов

Выделение хантавирусов из образцов от диких грызунов, отловленных в очагах Приморского края, проводилось на перевиваемой культуре клеток Vero E-6 (перевиваемая линия клеток почек зелённой мартышки CII06-CRL-1586 American Type collection) с использованием среды Игла МЭМ с двойным набором аминокислот и витаминов, дополненной L-глютамином (1 мг/мл), 7% сыворотки эмбрионов коров СЭК, с добавлением для профилактики микробного роста пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (50 мг/мл).

Монослой культуры клеток Vero Е-6 инкубировали вместе с инфицированным материалом (10% суспензия органов грызунов, по результатам ИФА показано наличие специфического антигена) в течении 1 часа при температуре 37°С в термостате. После контакта инокулят сливали, и во флаконы добавляли поддерживающую среду Игла МЭМ с 3,5% (СЭК). Вирус накапливали в термостате при температуре 37°С в течение 14 дней. Через 2 недели проводился первый пассаж, для чего культуральную жидкость из заражённых флаконов сливали, монослой дважды промывали средой 199 и для снятия клеток обрабатывали смесью, содержащей в равных количествах раствор 0,25% раствор трипсина и раствор Версена, подогретой до 37⁰ С. После отделения клеток от стекла, во флаконы добавляли по 1,0 мл питательной среды, в которой клетки ресуспендировали, а затем по 0,2 мл взвеси клеток переносили в стерильные флаконы. Последующие пассажи выполняли аналогичным способом, но со II пассажа к заражённым клеткам добавляли неинфицированные клетки Vero Е-6 в соотношении 1:1. Контроль размножения вирусов проводили со II пассажа, с этой целью часть клеток снятых с флакона, разводили стерильным физиологическим раствором и центрифугировали при 1000 об/мин в течении 5-7 мин. Осажденные клетки суспендировали, наносили на обезжиренные стёкла, которые подсушивали при комнатной температуре и фиксировали охлаждённым до -20°С ацетоном в течении 40 мин.

После выделения изолята хантавируса проводилось накопление вируссодержащей массы, изучение антигенных, молекулярно-генетических и биологических характеристик штамма, то есть, типирование.

Взятые в исследование штаммы прошли на культуре клеток различное количество пассажей (от 20 до 40).

Б. Титрование хантавируса под полужидким покрытием.

Для определения титра инфекционного вируса использовали методику, основанную на способности хантавируса формировать фокусы из инфекционных клеток под полужидким покрытием (Lee.P.W., 1985). Десятикратные разведения вируссодержащей жидкости (от 10^-1 до 10^-4) вносили на монослой клеток, выращенный на культуральных 24-луночных планшетах, в дозе 0,2 мл. После контакта в течение часа при 37°С инокулят сливали, монослой однократно отмывали средой МЕМ, и вносили 0,8 мл полужидкого покрытия, состоящего из среды Игла МЭМ содержащей 0,6% карбоксиметилцеллюлозы, 2,0% СЭК, антибиотики. Пластину с инфицированными клетками инкубировали в течение 7-8 дней при 37°С в термостате с 5% содержанием CO₂. Учет реакции проводили через 8-10 дней. Полужидкое покрытие сливали, клетки промывали один раз (для отмывки использовали 0,85% раствор NaCl или ФСБ). После чего клетки фиксировали абсолютным спиртом при комнатной температуре по 400 мкл/лунку (15, 20 минут), после удаления фиксатива клетки отмывали 0,85% раствором NaCl или ФСБ (3х10 минут). Затем вносили специфическую анти-хантавирусную сыворотку (сыворотка реконвалесцента ГЛПС, исходный титр 1:2048) в разведении 16-32 ед. по 200 мкл/лунку. После инкубации монослой отмывали (3х5 минут) раствором ФСБ + 1% Твин-20, и вносили меченный пероксидазой белок «А» 200 мкл/лунку (исходный титр 1:20000, 8-16 ед., разведение на трис-буфере с 0,05% раствором Твин-20 и 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на 60 мин. при 37⁰ С. Затем монослой отмывали 0,85% раствором NaCl или ФСБ (3х5 минут). Для выявления фокусов субстрат по 400 мкл (для получения рабочего раствора субстрата к 8 мл ФСБ прибавляли 1 мл раствора 3,3’диаминобензидина, 1 мл 0,6% раствора NiCl₂ и 4 мкл 30% Н₂О_2. Бляшки проявлялись в течение 5-15 минут, после чего панель промывали проточной водой, подсушивали и подсчитывали количество фокусов. Титр вируса выражали в десятичных логарифмах, по количеству фокусов, образованных при внесении 0,2 мл вируссодержащей жидкости в лунку, и выражали в lg/1,0 мл.

В) Выявление специфических антител и антигена хантавируса

1) Непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА).

Для оценки размножения вирусов на клеточной культуре, выявления специфических антител в сыворотках крови экспериментально инфицированных животных использовали НМФА, постановка которого осуществлялась согласно методическим рекомендациям, в двух модификациях:

1) Для выявления вирусного антигена в зараженной культуре клеток, из суспензии интересуемого субстрата готовили слайды, которые фиксировали охлажденным ацетоном в течение 40 минут. На приготовленные слайды с антигеном наносили референс-сыворотки от людей, переболевших ГЛПС, содержащие в высоком титре антитела к вирусу Хантаан, Сеул или Пуумала и оставляли на 45 мин для контакта во влажной камере при температуре 37 °С. После контакта препарат трижды в течение 3 мин отмывали фосфатно-солевым буфером рН 7,2, затем двукратно дистиллированной водой и подсушивали при комнатной температуре. На подсушенный препарат наносили в рабочем разведении антивидовые, приготовленные против иммуноглобулинов человека иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (производство Института им. Н. Ф. Гамалеи, Москва). Для контрастирования препарата применяли раствор голубого Эванса на ФСБ рН 7,2, в конечной концентрации 1:100000. После обработки препараты просматривали в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-И2, используя вводно-иммерсионный объектив (с увеличением х 40 или х 60). Результаты выделения вируса оценивали по накоплению вирусного антигена, о чем свидетельствовало ярко зелёное люминесцентное гранулярное свечение цитоплазмы клеток. Интенсивность накопления выражали в процентном содержании светящихся клеток на 100 клеток в поле зрения.

2) Для выявления специфических антител в сыворотках экспериментально инфицированных животных на заранее приготовленные слайды с клетками Vero E6, содержащими антиген известного хантавируса (как правило, прототипных штаммов вирусов Хантан, Сеул, Пуумала, Амур) наносили серийно разведенные (от 1:4 до 1:1024) на фосфатно-солевом буфере сыворотки экспериментально инфицированных животных. Дальнейшее проведение методики аналогично представленной выше, за исключением того, что в качестве вторичных антител использовали антивидовые, приготовленные против иммуноглобулинов мыши иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (производство Института им. Н. Ф. Гамалеи, Москва). Титр специфических антител определяли по последнему разведению, при котором отмечено ярко-зелёное люминесцентное гранулярное свечение цитоплазмы клеток. Титр выражали в величинах обратных разведению (например, при разведении 1:512, титр составил 512).

2) Иммуноферментный анализ

Специфический антиген хантавируса выявляли в 10% суспензиях органов грызунов с помощью коммерческих наборов «Хантагност», производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН (Москва), согласно инструкции производителя.

2.2. Выбор препарата для иммунизации

Для иммунизации животных выбран коммерческий препарат полиоксидоний.

ПОЛИОКСИДОНИЙ®

Регистрационный номер: Р N002935/02Торговое название: Полиоксидоний® Международное непатентованное название: Азоксимера бромидХимическое название: сополимер N-оксида 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиметил)-1,4-этиленпиперазиний бромидаЛекарственная форма: лиофилизат для приготовления раствора для инъекций и местного применения. Состав на 1 ампулу или флакон:Активное вещество: Полиоксидоний® (Азоксимера бромид) - 3 мг или 6 мг Вспомогательные вещества: маннитол, повидон, бетакаротен – до 4,5 мг для дозировки 3 мг или до 9 мг для дозировки 6 мг.Описание: пористая масса от белого цвета с желтоватым оттенком до желтого цвета. Препарат гигроскопичен и светочувствителен.Фармакотерапевтическая группа: иммуномодулирующее средствоКод АТХ: [L0З] (http://polyoxidonium.ru/1-3-2.php)

2.3. Лабораторные животные

А) Содержание и уход

Для проведения иммунизации и изучения иммуностимулирующего действия полиоксидония использовали беспородных белых лабораторных крыс в возрасте 3-4 недели, средняя масса 34,9 ± 0,7 г. Выбор белых крыс в таком возрасте в качестве экспериментальной модели обусловлен их низкой чувствительностью к возбудителю, сопоставимыми с таковыми у человека показателями клеточного и гуморального иммунитета по бактерицидным свойствам сыворотки крови и гиперчувствительности замедленного типа, а также накопленным ранее опытом по эффективности использования этой модели для получения специфических сывороток к хантавирусам.

Эксперимент выполнен на 40 животных - самцах и самках белых крыс, содержащихся в стандартных условиях вивария: содержание в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, не более 5 особей в клетке, стандартный рацион и питьевой режим в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и приказом Минздрава СССР от 10.10.83 № 1179 (пункт 4.1).

Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Уход за инфицированными животными и работу с ними осуществляли в условиях вивария с уровнем безопасности Р-3 (BSL-3).

Б) Иммунизация

1) Подбор дозы полиоксидония:

Доза полиоксидония подбиралась экспериментальным путем, на массу тела, как это проводилось для дозирования препарата у людей (6 мг/среднюю массу тела человека 63 кг). Учитывая, что в возрасте 3-4 недели средняя масса тела крысы составляет примерно 100 г, средняя доза/крысу составила примерно 0,01 мг или 10 мкг/крысу. Концентрация исходного раствора составила 0,6%. Для иммунизации использовали 0,006% раствор полиоксидония на воде для инъекций (в 1 мл = 60 мкг полиоксидония). Для исследования взяты три дозы: 10 мкг/крысу (0,17 мл), 20 мкг/крысу (0,33 мл) и 30 мкг/крысу (0,5 мл).

Животные были разделены на 2 экспериментальные группы: I группа - контрольная (интактные животные); II группа – иммунные животные. Иммунизацию проводили внутримышечно в левую заднюю лапку животного. В опытных группах (по 5 животных) вводили в одну лапку вируссодержащую жидкость, в другую полиоксидония. В контрольной группе животным вводили только вируссодержащую жидкость.

Таблица 2

Схема проведения опыта

Группа (№)	Количество животных	Путь введения	Кратность и доза введения вируса	Кратность и доза введения иммуномодулятора
Опыт № 1 (вирус ПМ-95)

Окончание таблицы 2

Контроль (1)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (5,6 lg ФОЕ/мл)	-
Опытная (2)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (5,6 lg ФОЕ/мл)	1 раз х 0,17 мл (10 мкг)
Опытная (3)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (5,6 lg ФОЕ/мл)	1 раз х 0,33 мл (20 мкг)
Опытная (4)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (5,6 lg ФОЕ/мл)	1 раз х 0,5 мл (30 мкг)
Опыт № 2 (вирус ПМ-95)
Контроль (5)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (3,6 lg ФОЕ/мл)	-
Опытная (6)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (3,6 lg ФОЕ/мл)	1 раз х 0,17 мл (10 мкг)
Опытная (7)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (3,6 lg ФОЕ/мл)	1 раз х 0,33 мл (20 мкг)
Опытная (8)	5	в/м	1 раз х 0,5 мл (3,6 lg ФОЕ/мл)	1 раз х 0,5 мл (30 мкг)

На 35–40 день после заражения животных обескровливали под общим наркозом. Кровь в пробирках центрифугировали в течение 2 минут при скорости 1000 об/мин, осторожно собирали сыворотку, которую далее исследовали на наличие антител.

Глава 3. Полученные результаты и обсуждения

Полиэлектролиты обладают иммуностимулирующим действием и избирательно влияют на отдельные звенья иммуногенеза, вызывают значительное повышение интенсивности антителообразования, не нарушая резервных возможностей кроветворной системы. Описанные свойства и послужили основанием для применения полиэлектролитов в качестве адъюванта при иммунизации животных против хантавирусной инфекции.

В результате проведенных экспериментов получены следующие данные:

Таблица 3

№ группы	Среднее (титр АТ)	Стандартное отклонение	Стандартная ошибка
1	512	313,5	140,2
2	409,6	140,2	62,71
3	486,64	343,5	153,6
4	563,2	280,4	125,4
5	204,8	70,11	31,35
6	460,8	114,5	51,2
7	512	0	0
8	460,8	114,5	51,2

Рисунок 1. Результаты изучения выработки антител после введения разных доз хантавируса и разных доз иммуномодулятора.

Как видно из рисунка 1 у контрольных животных первой группы, получивших только вирус, титр специфических антител был достаточно высоким, 1:512. В то же время отмечено отсутствие выраженной разницы в титрах антител, полученных в 1 опыте с дозой хантавируса 5,6 lg ФОЕ/мл, и введением 10, 20 или 30 мкг полиоксидония, средний титр составил 409,6; 486,64 и 563,2, соответственно. При изучении разницы титров между группами показано, что во всех случаях разность статистически не достоверна, р  0,5.

Таким образом, использованная схема стимуляции иммунизации не привела к значительному увеличению титра антител. Вероятно, это связано с тем, что использованный антиген хантавируса, взятый в высокой дозе, сам по себе обладает хорошим иммуногенным эффектом. Большое значение также может играть молодой возраст животных, с высокоактивным иммунитетом, эффективно реагирующим на введение чужеродного антигена.

В то же при проведении повторного эксперимента со снижением дозы вируса в 100 раз (на 2 логарифма = 3,6 lg ФОЕ/мл) в контрольной группе животных получен титр антител статистически достоверно ниже титра антител у животных первой контрольной группы (титр вируса 5,6 lg ФОЕ/мл) (P = 0.065). Однако введение полиоксидония привело к статистически достоверному увеличению титра специфических антител, по сравнению с контролем: во всех опытных группах значение Р варьировало от 0.000 до P = 0.003. Причем введение даже минимальной испытуемой дозы препарата – 10 мкг приводило к эффективной стимуляции выработки антител, аналогичная картина отмечена при увеличении дозы иммуномодулятора. В то же время сравнение групп, получавших равные дозы полиоксидония, но разные дозы хантавируса не показало достоверной разности между титрами специфических антител.

Однако даже полученные предварительно результаты свидетельствуют, что данная схема (низкая доза полиоксидония и низкая доза вируса) обладает несомненными преимуществами:

1. Позволяет получать иммунные сыворотки с высоким титром при введении малых доз вируса

2. Позволяет более рационально использовать иммуномодулятор, в меньших дозах.

3. Использование меньших доз, как вируса, так и полиоксидония, это более щадящий режим иммунизации животных, с сопоставимой эффективностью.

Таким образом, результаты предварительных исследований показали, что полиоксидоний обладает большей эффективностью при введении низких концентраций вирусного антигена, однако схема иммунизации и выбор доз иммуномодулятора требуют дальнейшей доработки. Наиболее приемлемой схемой иммунизации должна стать схема с однократным введением, как вируса, так и иммуномодулятора.

Выводы

1. Использование иммуномодулятора полиоксидоний приводит к стимуляции специфического противовирусного гуморального иммунитета, начиная с дозы 10 мкг/животное.

2. Полиоксидоний обладает большей эффективностью при введении низких концентраций вирусного антигена.

3. Использование полиоксидония эффективно для получения иммунных противохантавирусных сывороток, однако, схема его применения требует дальнейшей обработки.

Список литературы

Монографии и исследования

1.Слонова Р.А., Иванис В.А., Компанец Г.Г.Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. – Владивосток.: ОАО «Примполиграфкомбинат», 2006. – 247 с.

Статьи

1.Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А., Медуницын Н.В. Цитокины и вакцины//Тихоокеанский медицинский журнал. – 2009. – № 3. – С. 22-27.

2.Дертева И.И. и др. Сб. научных работ в противочумных учреждениях. - Саратов, 1966, с. 151-162

3.Кохил Т. Гигиена и содержание лабораторных животных в вивариях: статья – Центр лабораторных животных при университете г. Хельсинки – С. 21-26

4.Моисеева Е.Л., Соловьёв К.И., Гришенков Г.В. Опыт клинического применения полиоксидония в комплексной терапии заболеваний органов дыхания// РМЖ. - 2013. №7. С.595

5.Некоторые особенности получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к возбудителю мелиоидоза / Новицкая И.В., Рыбкин B.C., Тихонов Н.Г. и др.// Сб. науч. работ ВолгНИПЧИ. - Волгоград, 1989. - Вып.4. - С.242-245

6.Недоспасов С., Руденко Б. Великая иммунологическая революция.//Наука и жизнь – 2010. - №9

6.Петров Р.В., Хаитов Р.М., Некрасов А.В. и др. Полиоксидоний — иммуномодулятор последнего поколения: итоги трехлетнего клинического применения // Аллергия, астма клин. иммунол. — 1999. — № 3. — С. 3–6

7.Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Полиоксидоний: новые аспекты применения//Новые лекарства – 2003. - №3.

8.Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. — 1997. — № 5. — С. 7–14

9. Dambaeva S.V.,Mazurov D.V.,Golubeva N.M. Effect of polyoxidonium on the phagocytic activity of human peripheral blood leukocytes//Immunologia. –2003. - N8(1). – P. 53-60.

10.Kozhevnikova Т.N., Vorovich М.F., Kozlov V.G.Phosprenyl as vaccine adjuvant and hyperimmune sera specific antibodies production – 2004. – P. 11

11.Hurn B.A.L., Chantler S.M. Production of reagent antibodies // Methods in Enzymology. – 1980. – Vol. 70, N 5. – P. 104–142.

12.Tomlenovich L., Show Chr. Aluminium adjuvants in vaccines//Current Medicinal Chemistry. – 2011. – вып. 18 – С. 2630-2637

Учебники и учебные пособия

1.Букринская А.Г. Вирусология: учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов. М.: Медицина – 1986. – 336 с., ил.2.Детские болезни. Полный справочник/ под ред. Елисеева Ю.Ю. - М.: Эксмо, 2008. — 705 с.

3.Петров Р.В. Беседы о новой иммунологии. – М.: Молодая гвардия – 1978. – 224 с.

4.Токаревич К.Н., Грекова Т.И. По следам минувших инфекций. - Ленинград, 1986. – 41 с.

5.Учайкин В.Ф., Шамшева О.В. Вакцинопрофилактика. Настоящее и будущее. М. - ГЭОТАР-Медиа, 2001. – 399 с.

6.Фонталин Л.Н., Певницкий Л.А. Иммунологическая толерантность. – М., 1978. – 282 с

7.Чард Т. Радиоиммунологические методы. – М.: Мир, 1981. – 246 с.

Электронные ресурсы

1.Алиева Е.В. Разработка экспресс-методов и технологий производства иммунодиагностических препаратов [Электронный ресурс] – режим доступа: http://proflibrary.ru/themes/microbiologija/alieva_elena_vasil_evna_74921/2

2.Биотехнология моноклональных антител [Электронный ресурс] – режим доступа: http://portal.agun.kz/e-books/content/Th15Ubp5Nex64yvYBH84/pages/2.3.1.htm

3.Виды адъювантов [Электронный ресурс] – режим доступа: http:// meduniver.com/ Medical/Microbiology/957.html

4.Иммуногенность вакцин [Электронный ресурс] – режим доступа: http://microbiology.com.ua/?p=247

5.Иммунологические адъюванты. Вещества, повышающие иммунитет [Электронный ресурс] – режим доступа: http://meduniver.com/Medical/Microbiology/955.html

5.Инструкция по медицинскому применению препарата полиоксидоний [Электронный ресурс] – режим доступа: http://polyoxidonium.ru/1-3-2.php

6.Краткая история сыворочного дела [Электронный ресурс] – режим доступа: http://bio-mind.ru// serum/immune-1

7.Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Иванова А.С., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М., Петров Р.В. Производное поли21,42этиленпиперазина, обладающее иммуно2модулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью (Патент № 2073031) [Электронный ресурс] – режим доступа: http://ru-patent.info/20/70-74/2073031.html

8.Отличия вирусных и бактериальный инфекций [Электронный ресурс] – режим доступа: http://goodsher.ucoz.ru/news/otlichija_virusnykh_i_bakterialnykh_infekcij/2012-10-03-48

9.Полиоксидоний – истинный иммуномодулятор [Электронный ресурс]: статья – режим доступа: http://grandex.ru/medicine/text/11192.html

10.Разработка методов изготовления противовирусных диагностических сывороточных препаратов [Электронный ресурс] – режим доступа: http://bio-mind.ru//serum/immune-2

11.Способ повышения антигенности и иммуногенности материала [Электронный ресурс] – режим доступа: http://bankpatentov.ru/node/109890

12.Храпова Н.П., Корсакова И.И., Ломова Л.В. Способ определения предельно допустимой антигенной нагрузки, стимулирующей продукцию гуморальных антител (патент РФ № 2371196) [Электронный ресурс] – режим доступа: http://freepatent.ru/patents/2371196

Нормативные документы

1.Безопасное применение адъювантов: отчет о совещании комитета ВОЗ от 1-2 декабря, М., 2005

2.Государственный реестр лекарственных средств: Официальное издание (по состоянию на 1 января 2000 г.). М., 2000. - 1202 с. - М-во здравоохранения РФ.

3..Оценка воздействия наноматериалов на функции иммунитета: Методические рекомендации - введены 29.12.2011 – М. – 2011. – 11 с.

4.Сергеев Р.А., Андрияш Т.А. Разработка полноценного экструдированного гранулированного корма для лабораторных животных: Указания. – М.: ООО «МЭСТ», 1997. – 25 с.

Диссертации и рефераты

1.Акользина С.Е. Цитокины в вакцинах и их адъювантное действие. - Автореф. дис. на соискание уч. ст. канд. мед. наук. М. – 1996. – 20 с.

2.Баборенко Е.П. Иммунобиологические свойства штаммов вируса болезни Ауески. – Автореферат дис. на соискание учен. степени канд. биол. наук. – Владимир, 1996. – 21 с.

3.Гаранина С.Б. Молекулярно-генетические методы и компьютерные технологии в системе эпидемиологического надзора за хантавирусными инфекциями: диссертация к. б. н./Гараниной С.Б. – М., 2009. – 239 с.

4.Полосин А.В. Клинико-лабораторная оценка эффективности полиоксидония в комплексной терапии больных хроническими урогенитальными инфекциями. – Автореферат на соискание степени канд. мед. наук. Саратов – 2004. – 110 с.

5.Тюменцева И.С. "Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций". Автореферат дисс. на соискание уч. ст. доктора мед. наук, Саратов, 1996

6.Шатохин М.Н. Использование полиоксидония для коррекции иммунных нарушений у больных хроническим простатитом. – Автореферат дис. на соискание степени канд. мед. наук. – М., 2005. – 23 с.

Код для цитирования: Скопировать