VI Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум - 2014

 

Введение

Антибиотики класса хинолонов - эффективные лекарственные средства нового поколения, успешно применяемые для профилактики и лечения микробных инфекций. Класс хинолонов включает две основные группы препаратов, различающихся по структуре и активности: нефторированные хинолоны и фторхинолоны. Несмотря на сходство химического строения нефторированных и фторированных хинолонов, они существенно отличаются по своим свойствам, что дает основание рассматривать фторхинолоны в качестве самостоятельной группы препаратов в рамках класса хинолонов.

Действующее вещество ветеринарного препарата байтрила-энрофлоксацин. Структурная формула энрофлоксацина (C₁₉H₂₂FN₃O₃ - 1-циклопропил-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-6-фторо-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота) представлена на рис 1.

Рис.1.Структурная формула энрофлоксацина

Является представителем группы фторхинолонов. Он характеризуется широким спектром активности против большого ряда грамотрицательных и грамположительных бактерий, включая устойчивые к β-лактамным антибиотикам и сульфонамидам. Используется для лечения инфекций мочевого тракта, пиелонефритов, венерических заболеваний, простатита, кожных и тканевых инфекций. Энрофлоксацин первым из фторхинолонов начали применять в ветеринарии. Назначают телятам, поросятам цыплятам, плотоядным при инфекциях дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей, кожи в форме инъекций (внутримышечно) и в форме порошка (с водой) в дозах 2,5-5 мг/кг, однократно.

Существующие методы определения действующего вещества байтрила длительны и трудоемки. Целью данной работы является разработка методики определения байтрила (энрофлоксацина) методом капиллярного электрофореза.

2. Обзор литературы

2.1.Классификация и синтез хинолонов и фторхинолонов

Начало этому классу химиопрепаратов было положено в 1962 году с внедрением в медицинскую практику налидиксовой кислоты (невиграмона), а затем ее близких структурных аналогов: оксолиниевой, пиромидиевой и пипемидиевой кислот.[2] Первое поколение хинолонов обладало ограниченным по широте спектром антибактериальной активности и использовалось преимущественно для лечения инфекций мочевого тракта. Структурные формулы налидиксовой кислоты и оксолиниевой представлены на рис 2.

Рис.2.Структурные формулы налидиксовой кислоты и оксолиниевой кислоты

Второе поколение хинолонов представлено широким рядом производных (норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин и др.), содержащих в положении 6 атом фтора, а в положении 7 - остаток пиперазина. Структурные формулы норфлоксацина, пефлоксацина, ципрофлоксацина изображены на рис 3.

Рис.3.Структурные формулы норфлоксацина, пефлоксацина, ципрофлоксацина

Они появились на мировом фармацевтическом рынке в середине 80-х годов и быстро завоевали признание как препараты с исключительно высоким уровнем активности (в десятки и сотни раз превосходящей β-лактамные антибиотики) и широчайшим спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, сравнительно низкой токсичностью, хорошей фармакокинетикой и практически полным отсутствием резистентности. Благодаря своим уникальным характеристикам фторхинолоны сразу привлекли внимание ведущих фармацевтических фирм, которые в сжатые сроки наладили промышленный выпуск серии (более 20 наименований) клинически наиболее важных фторхинолонов. О бурном развитии научных исследований в этой области можно судить по числу синтезированных веществ фторхинолонового ряда, которое уже превысило отметку 10 000.

Следующее поколение хинолонов представлено молекулами спарфлоксацина, ломефлоксацина и темафлоксацина, содержащими два и три атома фтора.[3] Их структурные формулы показаны на рис 4.

Рис.4.Структурные формулы спарфлоксацина, ломефлоксацина и темафлоксацина

Методы построения углеродного скелета хинолоновых молекул хорошо известны, и синтез их фторированных производных не представлял бы проблемы, если бы атомы фтора можно было ввести в уже готовые хинолоновые молекулы. Поскольку прямое введение атомов фтора в ароматическое кольцо связано со значительными трудностями, совершенно очевидно, что стратегия синтеза фторхинолонов должна базироваться на использовании исходных веществ, которые уже содержат атомы фтора, причем в строго определенных положениях ароматического кольца. Ретроспективный анализ показывает, что для получения 6-фторхинолонов пригодны 3-галоген-4-фторзамещенные анилины либо 2,4-дигалоген-5-фторзамещенные бензойные кислоты.[4] Получение 6-фторхинолонов представлено на рис 5.

Рис.5. Получение 6-фторхинолонов на основе 3-галоген-4-фторзамещенных анилинов и 2,4-дигалоген-5-фторзамещенных бензойных кислот

Для получения базовых фтораренов в промышленности чаще всего используют реакции нуклеофильного замещения галогена или диазогруппы фторид-анионом, а далее, как уже отмечалось выше, существуют две стратегии синтеза фторхинолонкарбоновых кислот, которые изображены на рис 6.

В первом случае фторсодержащие анилины конденсируют сначала с этоксиметиленмалоновым эфиром, а затем проводят внутримолекулярную циклизацию с замыканием пиридонового цикла по реакции Гоулда-Джекобса. Далее NH-хинолон алкилируют, гидролизуют и замещают атом галогена в положении 7 на остаток пиперазина .

Второй метод построения предполагает использование в качестве исходного сырья фторсодержащих производных бензойной кислоты. Ключевым интермедиатом в этом случае является соответствующий b-кетоэфир, который далее конденсируют с орто-муравьиным эфиром. В полученном бензоилакрилате замещают этоксигруппу на остаток амина с последующей внутримолекулярной циклизацией b-амино-a-бензоилакрилата в хинолоновый бицикл .[5]

Рис.6. Синтез фторхинолонкарбоновых кислот

2.2.Методы определения энрофлоксацина

2.2.1 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Хроматография – физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Хроматографический анализ является критерием однородности вещества. Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими методами. Главной задачей хроматографии является разделение веществ.

Показано, что при анализе лекарственных средств группы фторхинолонов методом ВЭЖХ использование буферных растворов в составе подвижной фазы и добавление ион-парных реагентов существенно повышает эффективность колонки и симметричность пиков анализируемых соединений. Установлено, что в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ оптимальные значения параметров хроматографических пиков фторхинолонов наблюдаются в подвижной фазе, содержащей в качестве водного компонента фосфатный буфер с рН 2,5 с добавлением тетрабутиламмония в концентрации 1 ммоль/л. Разработанная методика может быть использована при анализе субстанций и лекарственных препаратов фторхинолонов по разделам нормативной документации “подлинность” и “количественное определение”. [6]

Для определения энрофлоксацина методом ВЭЖХ был подобран растворитель - раствор муравьиной кислоты, элюент-смесь гептансульфоновой кислоты и дигидрогенфосфата калия в воде с ацетонитрилом, оптимальные условия хроматографирования на колонке из нержавеющей стали Мис1еозП КР 18 (250x4 тш): температура процесса –

30°С , скорость элюации - 2 мл/мин, длина волны - 278 нм, концентрация вводимого раствора - 250 мкг/мл при объеме инжекции 5 мкл. Установлено, что в данных условиях время выхода пика энрофлоксацина составляет ~ 4-5 мин. [7]

2.2.2 Спектрофотометрический метод

Метод исследования и анализа веществ, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. Иногда под спектрофотометрией понимают раздел физики, объединяющий спектроскопию (как науку о спектрах электромагнитного излучения), фотометрию и спектрометрию, как теорию и практику измерения соответствующей интенсивности и длины волны (или частоты) электромагнитного излучения. По типам изучаемых систем спектрофотометрию обычно делят на молекулярную и атомную. Различают спектрофотометрию в инфракрасной, видимой и ультрафиолетовой областях спектра. [8]

В работе использован спектрофотометр СФ-56, исследование проводилось в ультрафиолетовой области спектра (220-350 нм). Использовались кварцевые кюветы с толщиной рабочего слоя 1 см. В качестве рабочих субстанций были использованы стандартные образцы.

Методика определения энрофлоксацина в лекарственных формах.

Точную навеску порошка лекарственного препарата на основе энрофлоксацина растворяли в дистиллированной воды, отфильтровали через беззольный фильтр и фильтрат доводили до метки в мерной колбе до 100 мл. Далее проводилось измерение оптической плотности полученного раствора при соответствующей длине волны на фоне воды очищенной.

Методика легко воспроизводима и общее время выполнения анализа не превышает 30 минут.[9]

2.2.3 Метод капиллярного электрофореза

Капиллярный электрофорез на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты и находит всё более широкое применение. Метод характеризуется экспрессностью, микрообъемами анализируемого раствора, отсутствием колонки и твёрдого сорбента, проблем с его «старением» (в отличие от ВЭЖХ), физической и химической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы, а также практически не требуется органических растворителей .[10]

Метод капиллярного электрофореза (КЭФ) основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счёт подачи высокого напряжения к концам капилляра.

Наиболее распространёнными вариантами метода КЭФ являются: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ).

КЗЭ - метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различии в электрокинетических подвижностях заряженных частиц, как в водных, так и в неводных электролитах.[11]

МЭКХ - вариант капиллярного электрофореза, который позволяет проводить разделение соединений ионного и нейтрального характера при использовании поверхностно-активных веществ (ПАВ). Разделение электронейтральных соединений осуществляется благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ - мицеллообразователей. Чаще всего используют анионный ПАВ (например, додецилсульфат натрия - ДДСН) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицелообразования, что приводит к формированию так называемой «псевдостационарной фазы», и аналиты распределяются между мицеллой и буферным электролитом согласно их гидрофобности.[12]

Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью (более сотни тысяч теоретических тарелок). Это объясняется прежде всего уникальным свойством ЭОП в кварцевом капилляре, который заключается в формировании плоского профиля потока (в отличие от параболического в ВЭЖХ), не вызывающий при движении зон компонентов практически их уширения. Очень высокая эффективность разделения позволяет широко применять метод для выявления не только близких по строению веществ (белков, пептидов, аминокислот, наркотиков, витаминов, красителей и др.), но и для контроля качества, технологического контроля, идентификации лекарственных препаратов, исследования фармакокинетики .

Эффективность, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы.[13]

К снижению эффективности могут привести ряд факторов: увеличение зоны вводимой пробы (определяемая длительность ввода); образование температурного градиента (за счёт разницы температуры в центре капилляра и на внутренней стенке капилляра). Возникающий вследствие этого градиент вязкости приводит к тому, что вещество у стенки перемещается медленнее, чем в центре, что вызывает уширение полос и снижение эффективности; адсорбция на стенках капилляра, приводящая к искажению формы пиков (появление хвостов), и другие факторы. Все эти параметры управляются путём создания оптимальной схемы разделения.[14]

Для решения задач качественного и количественного определения в КЭ перед анализом пробы обязательно проводят процедуру градуировки системы путем измерения одной или нескольких смесей с известным качественным и количественным составом. Результатом градуировки являются формирование таблицы компонентов (содержит времена миграции и имена определяемых компонентов) и построение градуировочной зависимости (показывает зависимость сигнала детектора от концентрации/содержания вещества).[15]

Качественный анализ обычно состоит в сравнении времен миграции (в случае капиллярного зонного электрофореза) или времен удерживания (в случае мицеллярной электрокинетической хроматографии), полученных для стандарта и пробы, измеренных в одинаковых условиях. Если эти времена совпадают с заданной точностью (обычно окно идентификации не превышает 5 %), то считают, что искомое вещество в пробе найдено и переходят к количественному анализу. Суть количественного определения сводится к следующему: сначала выбирают метод градуировки (внешнего стандарта (абсолютной градуировки), внутреннего стандарта, метод добавок и т. д.); определяют какую величину отклика детектора — высоту пика или площадь пика — будут использовать; затем анализируют стандартные растворы с известными концентрациями веществ и для каждого компонента

строят градуировочную зависимость отклика детектора от концентрации вещества; после чего анализируют пробу неизвестного состава и по градуировочному графику находят концентрацию определяемых веществ.

Капиллярный электрофорез как новый и быстро развивающийся метод широко применяется в аналитической практике лекарственных средств, в том числе и в биологических средах с целью идентификации и количественного анализа.[16]

3. Экспериментальная часть

3.1. Реагенты. Аппаратура

В работе использовали следующие реагенты:

• Стандартный раствор ломефлоксацина 20 мг/л

• Стандартный раствор данофлоксацина 20 мг/л

• Стандартный раствор эноксацина 20 мг/л

• Стандартный раствор ципрофлоксацина 20 мг/л

• Стандартный раствор левофлоксацина 20 мг/л

• Стандартный раствор энрофлоксацина 20 мг/л

• Стандартный раствор пефлоксацина 20 мг/л

• Фосфатный буферный раствор

• Дистиллированная вода по ГОСТ 6709

В работе использовали следующую аппаратуру:

• Система капиллярного электрофореза «Капель 105М» с положительной полярностью источника высокого напряжения (внутренний диаметр капилляра 50 мкм, полная длина капилляра 60 см, эффективная длина 50 см), оснащенная специализированной программой;

• Весы лабораторные специального класса точности с ценой деления не более 0,1 мг, наибольшим пределом взвешивания не более 210 г;

• Пробирки одноразовые (типа Эппендорф) вместимостью 1,5 мл;

• Микродозаторы с переменным объемом 10-100 мкл и пределом допускаемой погрешности измерения не более  2 %;

• Центрифуга с числом оборотов 10000 об/мин;

3.2.Определение энрофлоксацина

Пробоподготовка Байтрила: 1 мл препарата «Байтрил 6%» (50 г/л) переносили в колбу объемом 100 мл и доводили до метки дистиллированной водой (раствор с концентрацией 0,5 г/л), 1 мл которого снова переносили в колбу на 100 мл и доводили до метки дистиллированной водой (раствор с концентрацией 0,005 г/л). Проводили электрофоретическое определение.

Условия проведения анализа: Измерение проводили на системе капиллярного электрофореза «Капель-105М». Для определения использовали капилляр внутренним диаметром 50 мкм. Ведущий электролит - 20 мМ фосфатного буфера. Температура-35 °С. Ввод пробы 30 мбар × 10с.

4. Результаты и их обсуждение

4.1Выбор оптимальных условий электрофоретического разделения

Для выбора оптимальных условий по определению энрофлоксацина методом КЭ необходимо получить и изучить зависимость времени миграции, высоты и площади пика от тех факторов, которые можно контролировать в процессе анализа. Таким фактором является, например pH ведущего электролита. Электрофореграммы смеси фторхинолонов при различных значениях рН фосфатного буферного раствора приведены на рис 7- 10.

Рис.7. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 7,0, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин

Рис.8. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 7,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин, 6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис.9. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 8,0, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм; 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин, 6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Рис.10. Электрофореграмма смеси фторхинолонов; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм 1-ломефлоксацин,2-данофлоксацин,3-эноксацин,4-ципрофлоксацин,5-левофлоксацин,6-энрофлоксацин,7-пефлоксацин

Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью. Эффективность N, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграмм по уравнению:

N=16(tmw )2;

где tм — время миграции аналита,

w — ширина пика.

Результат расчета эффективности энрофлоксацина при различных значениях pH ведущего электролита приведен в таблице 1.

Таблица 1

Эффективность разделения фторхинолонов при различных значениях pH ведущего электролита

Фторхинолоны	Эффективность
	pH =7.0	pH =7.5	pH =8.0	pH =8.5
Энрофлоксацин	-	24,41	229,23	322,23
Время разделения, мин	7,5	8,5	8,5	8,5

Из полученных данных следует, что эффективность разделения наилучшая при pH=8,5.

Установлено, что электрофоретические пики смеси фторхинолонов близки, поэтому необходимо было проанализировать селективность и разрешение соседних пиков с энрофлоксацином в зависимости от pH ведущего электролита.

Селективность рассчитывается по формуле:

где tr – время миграции компонента, мин.

Значения величины селективности соседних пиков с энрофлоксацином представлены в Таблице 2.

Таблица 2

Селективность пиков фторхинолонов при различных значениях pH

Пары пиков фторхинолонов	Селективность
	pH =7.0	pH =7.5	pH =8.0	pH =8.5
Левофлоксацин-Энрофлоксацин	-	0,99	0,95	0,96
Энрофлоксацин- Пефлоксацин	-	0,94	0,96	0,96

Из таблицы 2 следует, что селективность пиков лучше при pH=8,5.

Разрешение для соседних пиков двух веществ A и B рассчитывается по формуле:

где tr_i-время миграции компонентов, мин; w_i- ширина основания пика компонента, мин.

Значения величины разрешения соседних пиков с энрофлоксацином представлены в Таблице 3.

Таблица 3

Разрешение пиков фторхинолонов при различных значениях pH

Пары пиков фторхинолонов	Разрешение
	pH =7.5	pH =8.0	pH =8.5
Левофлоксацин-Энрофлоксацин	0,33	2,44	2,70
Энрофлоксацин- Пефлоксацин	3,52	2,47	3,55

Таким образом, разделение смеси фторхинолонов будет наиболее эффективным при рН = 8,5, чувствительность метода, селективность и разрешение пиков при этом pH будут так же наилучшими для энрофлоксацина.

4.2 . Построение градуировочных графиков

Для построения градуировочного графика провели анализ энрофлоксацина концентрациями 2,5мг/л, 5мг/л, 10мг/л, 20мг/л. Полученные электрофореграммы представлены на рис 11-14

Рис.11. Электрофореграмма энрофлоксацина С=2,5мг/л, капилляр 50 мкм, ведущий электролит 25 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм;

Рис. 12. Электрофореграмма энрофлоксацина С=5 мг/л, капилляр 50 мкм, ведущий электролит 25 мМ ФБ рН = 8,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм;

Рис.13. Электрофореграмма энрофлоксацина C=10мг/л; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 7,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм;

Рис.14. Электрофореграмма энрофлоксацина C=20мг/л; внутренний диаметр капилляра 50 мкм, ведущий электролит 20 мМ ФБ рН = 7,5, 35 °С, ввод пробы 30 мбар × 10 с, длина волны 280 нм;

Данные градуировочной характеристики компонента энрофлоксацина представлены на рис 15.

Рис.15.Градуировочная характеристика компонента энрофлоксацина (СКО=3,243% R²=0.999)

4.3 Определение Байтрила

С помощью подобранных условий для определения фторхинолонов, проводят анализ препарата «Байтрил 6%» (действующее вещество энрофлоксацин) рис. 16 – 18. Измерение проводят три раза.

Рис.16. Электрофореграмма препарата «Байтрил 6%» концентрацией С₁

Рис.17. Электрофореграмма препарата «Байтрил 6%» концентрацией С₂

Рис.18. Электрофореграмма препарата «Байтрил 6%» концентрацией С₃

По градуировочному графику находят концентрацию определяемых веществ:

C₁=6.53 мг/л

C₂=6.45 мг/л

C₃=6.33 мг/л

По формуле рассчитали массовую долю энрофлоксацина в анализируемом препарате:

ω = C×V1×V2103×103 ×V3×V4×P×100%

где с-концентрация энрофлоксацина, измеренная по градуировочной зависимости ; V₁ – объем мерной колбы для разбавления «Байтрил 5%»,мл (100мл); V₂ - объем мерной колбы для разбавления аликвоты V₄,мл (100мл); V3 - объем анализируемого препарата «Байтрил 6%»,мл (1мл); V₄-объем аликвоты раствора V₁взятого для разбавления,мл (1мл); P- плотность «Байтрил 6%»,г/мл; 10³-коэффцициент пересчета мл в л; 10³- коэффициент пересчета г/мл в мг/мл;

ω₁=6,5%

ω₂=6,4%

ω₃=6,3%

Далее произвели расчет метрологических характеристик, таких как дисперсия, стандартное отклонение, относительно стандартное отклонение, доверительный интервал. По следующим формулам:

Вначале рассчитывают среднее значение массовой доли:

и дисперсию, характеризующую рассеяние результатов относительно среднего:

Тогда стандартное отклонение аналитического сигнала фона будет равно:

Доверительный интервал рассчитывается по формуле:

m=-+tp,f*Sn ;

где n- число измерений;

P- доверительная вероятность;

f-число степеней свободы;

по справочнику коэффициент Стьюдента(p и f):

t (P=0,95; f=2) =4, 303

Далее рассчитывается предел обнаружения и предел определения:

Предел обнаружения- это минимальная концентрация, которая фиксируется используемым прибором для получения аналитического сигнала

Предел определения- это минимальное содержание компонента, которое можно определить с заданной степенью точности.

Предел обнаружения С_min = 8.4668*3*h_ср,

Предел определения С_lim= 8.4668*10*h_ср,

Где h_ср- средняя высота пика ;

Полученные результаты занесены в таблицу 6.

Таблица 6.

Метрологические характеристики методики определения энрофлоксацина (n=3; Р=0,95)

Метрологические характеристики	значение
дисперсия	0,010
станд. отклонение	0,10
отн.станд.отклонение	0,02
Доверительный интервал	0,40
предел обнаруженияCmin	1.25
предел определения Clim	1.49

Таким образом, было установлено, что в анализируемом препарате содержание энрофлоксацина составляет 6,4±0,4%. Время анализа 30 минут.

5. ВЫВОДЫ

1. Установлена возможность определения байтрила методом зонного капиллярного электрофореза.

2. Выбраны оптимальные условия определения байтрила методом КЭ: напряжение +25 кВ, длина волны 280 нм, температура 35 °С, ввод пробы 30 мбар*10с, ведущий электролит 20мМ 50 фосфатного буфера, давление 5 мбар, капилляр внутренним диаметром 60 мкм.

3. Изучено влияние pH ведущего электролита на эффективность разделения смеси фторхинолонов. Установлено, что при pH=8.5 разделение смеси фторхинолонов эффективней.

4. Определены метрологические характеристики методики определения байтрила: предел обнаружения энрофлоксацина 1,25 мг/л;

5. Разработана методика определения энрофлоксацина. Методика характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов (s_r

Код для цитирования: Скопировать